煙草葉片響應鎘脅迫的差異表達基因鑒定及分析

張 慧 張欣雨 袁 旭 陳偉達 楊 婷

煙草葉片響應鎘脅迫的差異表達基因鑒定及分析

張 慧 張欣雨 袁 旭 陳偉達 楊 婷*

江漢大學生命科學學院 / 漢江流域特色生物資源保護開發與利用工程技術研究中心, 湖北武漢 430056

煙草具有超富集鎘的能力, 嚴重降低煙葉品質, 影響其經濟價值。為了闡釋煙草響應鎘脅迫的分子機制, 本研究采集了鎘濃度為0和500 μmol L–1培養條件下的煙草葉片進行轉錄組測序。共獲得76.94 Gb有效數據(Clean data), Q30 堿基百分比均達到95.43%以上; 在鎘脅迫的煙草葉片中, 共篩選出7735個差異表達基因, 其中4833個基因表達上調, 2902個基因表達下調, 并通過qRT-PCR分析驗證了轉錄組數據的可靠性。對差異轉錄本進行GO和KEGG富集分析, GO注釋表明差異基因涉及代謝過程、應激反應、細胞結構體、催化活性和轉錄調節活性等; KEGG富集分析表明上調差異基因主要富集在氨基酸的生物合成、碳代謝、氧化磷酸化和檸檬酸循環等通路, 下調差異基因則主要富集在光合作用、次生代謝產物的生物合成、代謝途徑和植物激素信號轉導途徑。進一步分析植物激素信號轉導通路發現, 共有8條植物激素途徑以不同的表達方式參與煙草對鎘脅迫的響應。激素噴施煙草的實驗結果表明, 葉片通過調控赤霉素、油菜素內酯和茉莉酸途徑以應對鎘脅迫; 擬南芥激素信號缺失突變體驗證實驗表明赤霉素、油菜素內酯、茉莉酸和乙烯途徑均響應鎘脅迫。綜上所述, 本文以轉錄組分析探究了煙草葉片響應鎘脅迫的調控網絡, 以期為提高作物抗逆性的遺傳改良提供理論依據。

普通煙; 鎘脅迫; 轉錄組分析; 調控機制; 植物激素

目前, 全球的土壤普遍受到不同程度的重金屬污染[1], 鎘(Cd)是最具毒性的重金屬, 其毒害作用使得農業Cd污染問題備受關注[2]。Cd易在植物中積累, 并通過食物鏈進入人體而危害人類健康, 如腎損傷、心血管疾病和癌癥等[3], 已成為威脅世界糧食生產安全的重要元素。在中國, 隨著工業的發展和城市化進程的加快, 含Cd礦源的開采與冶煉以及含Cd工業“三廢”的排放, 造成農田土壤Cd污染問題日益嚴重[4]。因此, 深入研究植物響應鎘脅迫的分子機制, 可為品種的遺傳改良提供理論依據, 對治理鎘污染和保障糧食安全具有重要意義。

土壤中離子態的Cd極易被植物根部吸收, 而Cd的運輸和分布則依賴于植物體內金屬轉運蛋白, 包括ATP結合盒轉運蛋白(ATP-binding cassette transporter, ABC)、陽離子交換體(cation exchanger, CAX)、重金屬ATP酶(heavy metal ATPase, HMA)、天然抗性相關巨噬細胞蛋白(natural resistance- associated macrophage proteins, NRAMP)和寡肽轉運體(oligopeptide transporter, OPT)等[5-6]。Cd進入植物細胞后會誘導活性氧過量積累, 使得蛋白質發生氧化損傷, 甚至造成細胞壞死[7]。此外, Cd通過金屬轉運蛋白轉移到地上組織后, 不僅擾亂植物水分平衡、氣孔導度和CO2利用率以改變葉片的光合速率, 還會阻礙葉綠素色素與特定蛋白質的結合, 致使光系統、光收集復合物和光合酶失去原有功能, 破壞葉綠素的合成[8]。另有研究表明, 高濃度Cd誘導葉綠體內淀粉粒體積和數量的增加, 破壞葉綠體結構, 導致體內干物質大量減少, 而且Cd會抑制植物種子的萌發, 嚴重降低作物的生產力[9-11]。

為了應對不利的生存環境, 植物已經進化出一系列的響應調節機制和防御策略, 包括對干旱、高溫和金屬的適應。如, 在缺乏鐵元素的情況下, 水稻可以通過調節體內赤霉素的含量減緩葉片鐵缺乏的癥狀[12]。鹽生植物對高鹽土壤的適應則是通過脅迫感知、信號轉導和代謝途徑改變來實現[13]。油菜和小麥等農作物為了應對干旱脅迫, 通過促發糖酵解到醋酸合成的動態代謝能量轉換以啟動茉莉酸信號通路, 從而提高植物耐旱性[14]。為了減緩重金屬Cd的毒害作用, 植物利用激素合成通路和抗氧化系統進行抵御。擬南芥通過調節乙烯含量從而降低植物體內超氧陰離子的積累, 以改善鎘脅迫下根系的發育[15], 植物體內脯氨酸的積累可促進糖和有機酸的合成, 減少氧化損傷并調節細胞滲透壓, 維持細胞結構的穩定[16]。龍葵通過誘導生長素在根部的重新分布, 調控一氧化氮的積累量, 從而緩解鎘毒性[17]。大量報道關注植物根部對重金屬Cd的響應, 但對葉片響應Cd脅迫的調控機制卻缺乏深入研究。

煙草(L.)作為我國重要的經濟作物, 極易超富集Cd, 且煙草Cd含量的50%以上積累在葉片[18-19], 嚴重影響煙葉的品質。越來越多的研究表明, 吸煙已成為煙民身體中重金屬Cd的主要來源之一[20-21], 而非吸煙者則可能通過二手煙加劇Cd的吸入[22-23], 但關于煙草響應鎘脅迫的分子機制尚待解析。因此, 本文以烤煙作為研究材料, 利用高通量測序技術對Cd脅迫和正常生長的煙草葉片進行轉錄組測序(RNA-Seq), 以獲得差異基因的功能注釋。此外, 通過外施激素和激素信號突變體明確激素對Cd的調控, 旨在揭示煙草葉片響應Cd脅迫的分子機制, 進一步豐富煙草對逆境的調控網絡, 為提高作物抗逆性的遺傳改良奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試煙草材料為本實驗室保存的煙草栽培品種NC89 (L. cv. NC89)。野生型擬南芥(, Col-0)和擬南芥油菜素內酯信號缺失突變體由本實驗室保存, 擬南芥其他激素信號缺失突變體、、、和由廣西民族大學豐景老師提供。

1.2 材料處理及生理參數的測定

煙草NC89種植在溫室, 溫室培養條件為相對濕度75%、光周期12 h光照/12 h黑暗、溫度24℃ ± 2℃。首先, 將煙草種子用水浸泡1 d, 隨后均勻播撒在營養土中萌發生長12～14 d, 將萌發的材料移栽至穴盤繼續培養13～17 d, 最后用清水洗凈幼苗的根部,并用海綿夾住下胚軸基部, 使其固定在KT板上進行水培預培養(5 d)。最后, 將煙苗放置在Cd濃度為0 (對照, CK)和500 μmol L–1(Cd處理組)的1/2霍格蘭營養液中進行脅迫處理, 脅迫1周后的煙草用標尺測量其葉長、葉寬、根長, 并稱量地上部和根部的鮮重。

1.3 轉錄組測序和基因文庫建立

脅迫1周后采集對照組(CK)和Cd處理組(Cd)同一葉位的2片煙草葉片, 立刻用液氮速凍研磨, 使用干冰運輸至上海凌恩生物科技有限公司進行二代轉錄組測序。每一個樣品由10棵煙草的葉肉組織混合組成, 并設置3個生物學重復樣品(CK-1、CK-2、CK-3和Cd-1、Cd-2、Cd-3)。提取樣本的總RNA后, 采用Illumina Truseq RNA sample prep Kit方法將富集得到的RNA反轉錄形成雙鏈cDNA, 修復cDNA雙末端, 加上接頭, PCR擴增后構建文庫。使用Agilent 2100 bioanalyzer對文庫進行質檢, 合格后利用Illumina NovaSeq 6000測序儀進行測序。

1.4 差異基因的篩選和功能注釋

將原始數據進行質控, 去除接頭序列和低質量序列, 以獲得高質量的序列(Clean data)。利用HISAT2軟件, 并以煙草栽培品種K326的核酸序列為參考基因組對Clean data進行比對分析[24]。利用FPKM法消除基因長度和測序量差異對計算基因表達的影響, 將調整后的值(FDR < 0.05)和|log2(FC)|≥1作為篩選標準, 使用EdgeR軟件獲取Cd處理組與CK對照組之間的差異表達基因(Differentially Expressed Genes, DEGs)。為了研究差異基因的生物學功能, 使用Goatools軟件進行基因集富集。同時利用KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, 京都基因與基因組百科全書)數據庫對差異基因進行Pathway分析, 以鑒定差異基因主要影響的生物學功能或調控通路。

1.5 實時熒光定量PCR驗證差異基因的表達

為驗證轉錄組數據的可靠性, 隨機選擇7個差異基因(, NADH氧化酶基因;, 脂氧合酶基因;, AP2/ERF轉錄因子基因;, WRKY轉錄因子基因;, 天線蛋白基因;, 核糖體蛋白基因;, 抗壞血酸過氧化物酶基因)進行實時熒光定量PCR (qRT-PCR), 并選用煙草轉錄延伸因子(,)作為內參基因, 通過Primer Premier 5設計基因的特異性引物(表1)。使用Eastep Super總RNA提取試劑盒提取葉片RNA, 隨后采用Invitrogen SuperScript反轉錄酶進行反轉錄, 合成cDNA。實時熒光定量PCR使用Hieff qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox)試劑盒(YESEN公司), 試驗過程參照試劑盒的操作說明。qRT-PCR的反應條件為: 94℃預變性3 min; 94℃變性20 s, 60℃退火45 s, 72℃延伸30 s, 40個擴增循環; 在延伸階段采集熒光, 并插入溶解曲線。本試驗包含3次生物學重復, 以2-ΔΔCT法進行定量數據分析[25]。

表1 實時熒光定量PCR引物序列

1.6 植物激素信號轉導通路的調控

將擬南芥種子(WT、、、、、和)用含1% Triton的75%乙醇溶液消毒20 min (旋轉), 在超凈工作臺內用無水乙醇清洗3次, 將其放在濾紙上晾干后, 均勻撒播在Cd濃度為0 (對照組)和50 μmol L–1的1/2 MS培養基中。隨后, 培養基平板置于黑暗條件下4℃培養3 d, 再將平板移至培養箱(溫度22～24℃, 光暗周期16 h光照/8 h黑暗, 相對濕度70%)生長, 觀察表型并測定生理參數。此外, 利用外源激素6-BA (細胞分裂素的一種, 40 μmol L–1)、BL (活性最高的一種BR, 10 μmol L–1)、GA3(赤霉素的一種, 100 μmol L–1)、MeJA (茉莉酸甲酯, 200 μmol L–1)噴施煙草, 水(Water)作為對照, 2 d后將煙草移至Cd濃度為0和500 μmol L–1的1/2霍格蘭營養液中進行培養, 觀察表型并測量相關生理參數, 以確定激素響應Cd脅迫的機制。

1.7 數據方差分析

本研究所有實驗處理均包含至少3組生物學重復。利用GraphPad Prism 9.0軟件對數據進行單因素或雙因素方差分析并作圖,< 0.05表示差異顯著,< 0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 Cd抑制了煙草的生長

為探究Cd脅迫對煙草生長發育的影響, 選取野生型煙草, 進行Cd脅迫處理。如圖1-A所示, 在正常條件下(CK), 煙草葉片和根系均呈現生長茂盛的情況, 葉片翠綠, 根系發達。但在Cd脅迫條件下(Cd), 煙草的生長受到顯著的抑制, 葉片葉綠素降解明顯、黃化程度增加、葉面積減小, 而根系發育不良, 呈現為褐化狀態。進一步對煙草葉寬、葉長和根重、根長以及地上部分的生物量進行了測量, 結果表明Cd導致煙草葉片的長度、寬度以及根重、根長和地上部分的重量都受到顯著的抑制(圖1-B), 表明Cd抑制了煙草的生長。

2.2 獲得高質量轉錄組數據

為了闡明煙草響應鎘脅迫的調控網絡, 我們采集生長環境Cd濃度為0 (CK)和500 μmol L-1(Cd)的煙草葉片進行轉錄組測序。測序結果顯示, 每個樣本的測序原始數據分別從78,412,514到78,412,514不等。經過質量過濾后, 每個樣本產生77,125,276～ 114,117,568干凈讀長, 有效堿基為11.09～16.28 Gb, 共獲得76.94 Gb有效數據(Clean data), 平均GC含量為46.38%, 有效序列的Q30均超過95.43% (表2)。采用Pearson方法進行樣品間相關性檢驗, 結果表明同組生物學重復樣品間的表達模式高度一致, 相關系數均在0.98以上(圖2-A)。以上數據說明了本次轉錄組數據的高質量, 可用于后續分析。

為了確定對照組(CK)和實驗組(Cd)之間基因表達的差異性, 根據EdgeR分析結果, 以<0.05和|log2FC|≥1作為標準進行篩選。與對照組相比, 實驗組共篩選出7735個差異表達基因(DEGs), 其中有4833個基因(占總DEGs的62.5%)在Cd脅迫環境中的表達上調, 2902個基因(占總DEGs的37.5%)在Cd脅迫環境中的表達下調(圖2-B)。

圖1 鎘抑制了煙草的生長

A: Cd對煙草表型的影響; B: 定量分析煙草的生理參數。誤差線表示平均值?±?標準差。*表示< 0.05水平差異顯著; **表示< 0.01水平差異極顯著; 葉長、葉寬和根長的單位為cm; 鮮重單位為g。

A: phenotypic changes of tobacco under Cd stress conditions; B: measurements of physiological parameter. The error line represents the mean ± standard deviation; *:< 0.05; **:< 0.01. The unit of leaf length, leaf width, and root length is cm; The unit of fresh weight is g. CK: 0 μmol L–1Cd; Cd: 500 μmol L–1Cd.

表2 樣品測序輸出數據的質量評價

圖2 樣品相關性及差異基因分析

A: 樣品相關性分析; B: 差異表達基因火山圖。

A: sample correlation analysis; B: volcano map of differentially expressed genes.

2.3 qRT-PCR驗證差異表達基因

為了驗證轉錄組數據的可靠性, 本研究以煙草作為內參基因, 隨機篩選了在轉錄組數據中有顯著變化的7個差異表達基因進行qRT-PCR檢測。RNA-seq測序結果表明, Cd誘導了基因、、和的表達, 但是會抑制基因、、的轉錄(表3)。qRT-PCR檢測結果與轉錄組數據變化趨勢高度一致, 與對照組相比, Cd處理使得、、和分別上調了1.85、5.15、26.40, 3.47倍, 卻使、、分別下調至0.81、0.71和0.62 (圖3), 表明轉錄組數據的真實可靠。

表3 轉錄組的差異表達基因

圖3 差異表達基因的qRT-PCR驗證

誤差線表示平均值?±?標準差。*表示< 0.05水平差異顯著; **表示< 0.01水平差異極顯著。

The error line represents the mean ± standard deviation; *:< 0.05; **:< 0.01.

2.4 鎘誘導金屬轉運相關基因的差異表達

研究表明, 植物根部吸收的Cd通過金屬轉運蛋白轉移到地上組織, 使得作物葉片變黃, 生長出現遲緩現象[26]。為了探究煙草葉片對Cd轉運的響應機制, 本文對鎘轉運相關蛋白的差異表達基因進行了分析。在Cd脅迫條件下, 負責Cd長距離運輸的金屬轉運蛋白和的基因表達量大部分上調, 少部分基因表達量下調; 負責將Cd轉運到液泡儲存以減緩植物毒害作用的和基因被顯著誘導表達; 此外, 為了維護細胞穩態, 細胞質膜上的金屬轉運蛋白會將過量的Cd運送至細胞外, 涉及的轉運蛋白基因家族的表達水平多數提高, 個別表達水平受到抑制; 提高植物Cd抗性的金屬轉運蛋白基因的表達量均上調(表4)。轉錄組數據表明, 鎘脅迫誘導葉片金屬轉運相關基因的差異表達。

表4 煙草葉片中鎘轉運相關基因的差異表達

(續表4)

2.5 差異表達基因GO功能注釋

為進一步探究煙草對Cd的響應過程, 本研究利用Goatools軟件對所有DEGs進行GO分析, 發現共有2459個上調差異基因和1443個下調差異基因獲得了注釋, 根據基因數目篩選出36條最顯著的條目(圖4)。結果表明, Cd處理后煙草DEGs可分為3個主要功能類別, 分別是生物學過程(biological process, BP)、細胞組分(cellular component, CC)和分子功能(molecular function, MF), 特別是在生物學過程中高度集中。在生物學過程中, 差異基因主要分布在生物調節(biological regulation)、細胞過程(cellular process)、代謝過程(metabolic process)、多細胞生物過程(multicellular organismal process)、應激反應(response to stimulus)等條目。細胞組分功能模塊基因數目最多的條目為細胞內(intracellular)和細胞結構體(cellular anatomical entity)。分子功能注釋的基因大部分集中在結合(binding)、催化活性(catalytic activity)、轉錄調節活性(transcription regulator activity)等條目。

圖4 差異表達基因 GO功能注釋

圖中左側縱坐標表示注釋到某一GO term的基因數占所有GO注釋基因總數的比例, 右側縱坐標表示注釋到某一GO term的基因個數, 橫坐標表示GO的每一詳細分類。

The left vertical axis in the figure represents the proportion of genes annotated to a certain GO term to the total number of genes annotated with GO, the right vertical axis represents the number of genes annotated to a certain GO term, and the horizontal axis represents each detailed classification of GO.

2.6 差異基因KEGG富集分析

根據KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)數據庫開展通路富集分析, 通過解析差異表達基因對代謝通路的影響, 進一步揭示煙草響應Cd脅迫的生理機制。Cd脅迫下煙草的差異基因成功地被富集到210條KEGG通路上, 其中共有4400個基因上調, 1906個基因下調。上調基因富集途徑主要與氨基酸的生物合成(biosynthesis of amino acids)、內質網中的蛋白質加工(protein processing in endoplasmic reticulum)、β-丙氨酸代謝(beta-alanine metabolism)、碳代謝(carbon metabolism)、檸檬酸循環(citrate cycle)、氧化磷酸化(oxidative phosphorylation)、脂肪酸降解(fatty acid degradation)等途徑相關。下調基因則主要富集于植物激素信號轉導(plant hormone signal transduction)、次生代謝產物的生物合成(biosynthesis of secondary metabolites)、代謝途徑(metabolic pathways)、氰胺酸代謝(cyanoamino acid metabolism)、光合生物中的碳固定(carbon fixation in photosynthetic organisms)、戊糖和葡萄糖醛酸相互轉化(pentose and glucuronate interconversions)、光合作用(photosynthesis)等通路(圖5)。

2.7 植物激素信號通路的研究

植物激素信號分子廣泛存在于在生命體中, 不僅參與植物生長發育的調控, 而且在幫助植物適應不利的生存環境等方面起著至關重要的作用。由圖6可知, KEGG富集分析表明大量差異基因被富集在植物激素信號轉導途徑, 共有8種不同的植物激素信號通路參與煙草對Cd脅迫的響應, 包括生長素(Auxin)、細胞分裂素(CTK)、乙烯(ET)、油菜素內酯(BR)、茉莉酸(JA)、赤霉素(GA)、脫落酸(ABA)和水楊酸(SA)。Auxin與CTK主要調節植物的生長與發育, 在響應Cd脅迫中, Auxin和CTK信號轉導途徑中的所有基因幾乎都被差異富集, 導致了煙草生長狀態的差異。植物生物脅迫抗性激素JA和SA信號通路的也被差異富集。在調節植物非生物脅迫的ABA信號通路中, Cd 誘導基因的表達, 抑制了和基因的表達。在GA信號轉導途徑中,基因的表達被誘導了。ET信號轉導途徑的基因表達均上調, 而BR信號轉導途徑的基因則主要是被下調表達。上述結果表明激素信號轉導途徑參與煙草對Cd脅迫的響應。

(圖5)

A: 上調差異基因前30條途徑的KEGG富集散點圖; B: 下調差異基因前30條途徑的KEGG富集散點圖。Y軸表示富集的KEGG途徑, X軸表示富集到KEGG通路DEG數量與DEGs總數的比率。

A: KEGG pathway up-regulated gene top 30 enrichment scatter plot; B: KEGG pathway down-regulated gene top 30 enrichment scatter plot. The Y-axis represents the enriched KEGG pathways, while the X-axis represents ratio of enriched DEGs in KEGG pathways to the total amount of DEGs.

2.8 植物激素通路響應鎘脅迫

為了具體闡述植物激素對Cd脅迫的調控機制, 本研究使用外源激素噴施烤煙地上部分, 并利用擬南芥不同激素信號響應途徑的缺失突變體進行鎘暴露試驗, 以探究植物激素是否參與煙草對Cd的響應。在植物噴施水(Water)的對照組中, Cd明顯抑制了煙草的生長; 在噴施6-BA (細胞分裂素)的處理組中, Cd仍然會抑制植物的生長, 并且在Cd暴露條件下, 6-BA處理組煙草地上部分的重量與對照組噴施水(Water)的煙草重量無明顯差別(圖-7A, B)。在噴施GA3(赤霉素)、BL (油菜素內酯)和MeJA (茉莉酸甲酯)煙草的處理組中, 地上部分鮮重在正常生長環境(CK)與Cd脅迫(Cd)條件下無顯著變化, 而在Cd條件下, 噴施GA3、BL和MeJA煙草的鮮重均明顯高于噴施水(Water)的煙草重量(圖-7A, B), 說明赤霉素、油菜素內酯和茉莉酸參與煙草對Cd的響應。在擬南芥材料中, 與 CK相比, 在Cd脅迫條件下赤霉素缺失突變體()、乙烯缺失突變體()和油菜素內酯缺失突變體()的鮮重和根長都沒有發生顯著變化(圖7-C～E), 而野生型擬南芥(WT)、生長素突變體()、水楊酸突變體()和脫落酸突變體()的鮮重和根長都受到了顯著抑制, 說明只有赤霉素、乙烯和油菜素內酯途徑參與植物對Cd的響應。綜上所述, 赤霉素、乙烯、油菜素內酯和茉莉酸參與植物對Cd脅迫的調控。

3 討論

Cd是一種非必需且毒性很強的重金屬元素, 可通過與膜蛋白競爭性結合進入植物或動物細胞[27-28]。Cd進入細胞后會誘導機體產生自由基引發活性氧的過量積累, 導致細胞器的功能紊亂和細胞氧化損傷[29]。當煙草體內的重金屬Cd累積到一定濃度后, 會出現一系列復雜的生理生化與分子水平的響應, 其直觀表現為: 植株生長遲緩、葉片失綠萎蔫、根系壞死(圖1), 但是關于煙草對鎘的響應機制還不清楚。轉錄組測序具有檢測范圍廣、數據量大的特點, 可提供高分辨率的基因表達譜來分析差異基因表達模式[30]。近年來, 有研究利用RNA-Seq獲得煙草在冷脅迫和病蟲害侵染過程中的差異基因表達矩陣, 揭示了植物對脅迫的應答機制[31-32]。因此, 本研究首次利用RNA-Seq技術篩選烤煙葉片響應鎘脅迫的差異基因, 并進行功能注釋, 獲得了特異性調控煙草抵抗鎘脅迫的激素代謝途徑, 最后利用植物激素信號轉導突變體進行驗證, 闡述了煙草響應鎘脅迫的分子機制。本文的研究結果不僅豐富了煙草對重金屬響應的調控網絡, 而且還為提高作物抗性的遺傳改良提供了理論依據。

圖6 植物激素信號轉導示意圖

圖中底色為紅色、黃色、藍色的基因均屬于差異表達基因, 其中紅色代表基因上調表達, 黃色代表基因下調表達, 藍色代表同時存在上調表達基因和下調表達基因。

The colors in the figure represent differentially significant genes. Red shows genes that are significantly up-regulated. Yellow shows genes that are significantly down-regulated. Blue indicates that there are both significantly up-regulated and down-regulated genes.

(圖7)

A: 不同激素對煙草表型的影響; B: 煙草地上部分的鮮重; C: 鎘對不同擬南芥突變體表型的影響; D: 擬南芥突變體根長的變化; E: 擬南芥鮮重的變化。根長的單位為cm; 擬南芥鮮重單位為mg; 煙草鮮重單位為g。誤差線表示平均值?±?標準差。*表示< 0.05水平差異顯著; **表示< 0.01水平差異極顯著。

A: the effects of hormone on tobacco phenotype under Cd stress conditions; B: the quantitative analysis of shoot biomass; C: the phenotypes ofmutants and wild-type plants under Cd stress conditions; D: the determination ofroot length; E: determination of Arabidopsis fresh weight. The error line represents the mean ± standard deviation; *:< 0.05; **:< 0.01. The unit of root length is cm; The fresh weight unit ofis mg, and the fresh weight unit of tobacco is g.

煙草葉片RNA-Seq數據表明鎘脅迫誘導植物大量基因的差異表達。金屬轉運蛋白調控植物體內Cd的運輸與儲存, 為生物體維持重金屬元素的穩態平衡做出重要貢獻[6]。本文發現金屬轉運蛋白基因家族的表達水平差異顯著, 故煙草葉片出現了Cd的超富集 (表4)。研究表明, Cd會影響葉綠素的合成, 抑制光合速率, 減少干物質的儲存[9-10,33]。本文通過對差異表達基因進行GO功能注釋和KEGG富集分析, 發現大量下調表達的差異基因富集在光合作用通路和碳固定通路中(圖4), 說明Cd通過干擾光合作用, 影響光合生物的碳固定, 從而導致葉片面積減小, 煙草生物量降低。此外, 脂肪酸參與調節多種生命活動和逆境脅迫應答過程, 不僅可為植物儲備能量, 還能為細胞膜形成屏障[34]。植物鎘暴露五分鐘后, 其根部大量的差異基因富集在脂質生物合成過程和脂肪酸生物合成過程[35]。在本研究中, 鎘脅迫條件下, 煙草葉片上調的差異表達基因富集在脂肪酸降解途徑, 說明脂肪酸代謝過程參與了煙草對鎘脅迫的響應。此外, 有研究表明, 桂花樹可通過大幅度降低體內脂肪酸含量以應對環境的高溫脅迫[36]。因此, 當煙草響應Cd對植物光合作用的毒害作用時, 葉片可能通過促進脂肪酸的分解為生命代謝過程提供能量, 從而增強對重金屬的抗性。

為了適應不利的生存環境, 植物在長期進化中已獲得了一套復雜精細的調控機制以提高抗性。進一步對差異表達基因進行KEGG富集分析發現, 氨基酸的生物合成、植物激素信號轉導、代謝途徑、次生代謝產物的生物合成等與植物抗性相關的通路均參與煙草對Cd的響應。植物激素在調節植物的生長發育和對生物脅迫及非生物脅迫的防御反應中發揮著重要作用[37-38]。茉莉酸提高了草莓對水澇脅迫的抗性, 脫落酸通過調控氣孔開關, 增強植物抵抗干旱脅迫的能力[39]。Kaya等[40]證實, 植物也可通過調控赤霉素來緩解鹽堿脅迫帶來的傷害。本文發現煙草葉片共有八種植物信號轉導通路響應了Cd脅迫, 并且每種激素轉導途徑都富集了大量的差異表達基因, 說明植物激素信號通路在煙草抵抗Cd脅迫的響應中扮演重要角色。

近年來, 越來越多的研究表明激素可以緩解重金屬對植物傷害, 外源生長素促進了芥菜在砷脅迫條件下的生長[41-42], 在本研究中, 激素信號轉導缺失突變體和外源激素噴施的煙草實驗表明乙烯、油菜素內酯、赤霉素和茉莉酸四種激素參與煙草對鎘脅迫的調控。在蠶豆響應鎘脅迫時, 茉莉酸通過改善滲透壓和抗氧化酶活性提高植物抗性。油菜素內酯和乙烯可以提高植物抗氧化劑的表達水平以降低Cd的毒害作用[43-44]。赤霉素可以抑制Cd吸收和轉運相關基因的表達, 增強生菜對鎘的抗性[45]。而脫落酸通過調控Cd脅迫相關基因的表達, 促進Cd在景天植物的積累[46]。表明乙烯、油菜素內酯、茉莉酸和赤霉素廣泛參與植物對Cd脅迫的調控機制, 而脫落酸則根據植物物種不同, 選擇性參與植物對Cd的響應, 生長素、細胞分裂素、水楊酸不參與煙草葉片對Cd脅迫的調控作用, 但是否參與其他作物對Cd的響應仍需要更多的實驗數據支撐。

4 結論

本研究利用RNA-seq轉錄組測序數據系統分析了煙草葉片響應Cd脅迫的差異表達基因, 發現 Cd誘導煙草碳水化合物代謝途徑、氧化磷酸化途徑相關基因的表達, 煙草通過調節抗氧化物質代謝、激素信號轉導等途徑以抵抗重金屬Cd的毒害作用。激素信號缺失突變體和外施植物激素證明了煙草主要依賴乙烯、赤霉素、油菜素內酯和茉莉酸調控對Cd脅迫的適應機制。本研究闡述了煙草葉片響應Cd脅迫的調控機制, 可為提高作物抗逆性的遺傳改良提供理論依據。

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Transcriptome analysis of tobacco in response to cadmium stress

ZHANG Hui, ZHANG Xin-Yu, YUAN Xu, CHEN Wei-Da, and YANG Ting*

College of Life Sciences, Jianghan University / Hubei Engineering Research Center for Protection and Utilization of Special Biological Resources in the Hanjiang River Basin, Wuhan 430056, Hubei, China

With the development of industrialization process in society, the problem of cadmium (Cd) pollution in soil is increasing. However,has a strong Cd enrichment capacity in leaves, which seriously affects its economic value. To investigate the mechanism by which tobacco responds to Cd stress, tobacco leaves were harvested from the culture solution with Cd concentrations of 0 μmol L-1and 500 μmol L-1for subsequent transcriptome sequencing. In this study, a total of 76.94 Gb clean data was obtained, with Q30 base percentage exceeding 95.43%. The results showed that 7735 differentially expressed genes (DEGs) were screened under Cd stress conditions, including 4833 up-regulated genes and 2902 down-regulated genes. The reliability of transcriptome data was verified by qRT-PCR analysis to detect the expression patterns of candidate gene. Gene ontology (GO) annotation as well as Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) pathway analysis were performed on differentially expressed transcripts. GO functional enrichment revealed that the differentially expressed genes were mainly distributed in metabolic processes, response to stimulus, cellular anatomical entity, catalytic activity, and transcription regulator activity. Meanwhile, KEGG analysis showed that the up-regulated differentially expressed genes were mainly involved in biosynthesis of amino acids, carbon metabolism, oxidative phosphorylation, and citrate cycle. Down-regulated differentially expressed genes were primarily enriched in photosynthesis, biosynthesis of secondary metabolites, metabolic pathways, and plant hormone signal transduction. Further analysis of plant hormone signal transduction pathways revealed that there were eight plant hormone pathways involved in response to cadmium stress in tobacco, and the relative expression patterns of different hormone gene member were also different. Experimental results from plant hormone application on tobacco leaves demonstrated that the regulation of gibberellins, brassinosteroids, and jasmonic acid pathways played roles in tobacco’s response to cadmium stress. The experimental results ofhormone signal mutant showed that plants respond to cadmium stress by regulating ethylene, gibberellin, brassinosteroid, and jasmonic acid pathways. In conclusion, this study not only explores the regulatory network of tobacco resistance to Cd stress, but also lays a theoretical foundation for the genetic improvement of crop resistance.

; cadmium stress; transcriptome analysis; regulatory mechanism; plant hormone

10.3724/SP.J.1006.2024.34141

本研究由湖北省自然科學基金計劃項目(2022CFB909), 國家自然科學基金青年項目(31900095)和江漢大學一流學科建設重大專項計劃項目(2023XKZ016)資助。

This study was supported by the Natural Science Foundation of Hubei Province of China (2022CFB909), the Youth Fund Project of the National Natural Science Foundation of China (31900095), and the First-Class Discipline Construction and Special Program of Jianghan University (2023XKZ016).

楊婷, E-mail: yangtingYT2016@163.com

E-mail: zhanghui313355@outlook.com

2023-08-15;

2023-10-23;

2023-11-15.

URL: https://link.cnki.net/urlid/11.1809.S.20231115.1006.004

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