基于網絡藥理學和分子對接探討扶正化纖方治療特發性肺纖維化的機制

魏祎，葉海燕，趙國靜，宋歡，孫英，周佩夏，王坤，胡海波，陸學超

特發性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一種慢性、進行性和不可逆的呼吸系統疾病，其特征是以肺泡上皮細胞損傷、成纖維細胞活化和膠原纖維大量沉積為特征的進行性肺部疾?。?-2］。IPF 死亡率較高，臨床研究發現，其平均生存率為3～5 年［3］。吡非尼酮和尼達尼布是目前市場上僅有的2 種被批準用于治療IPF 的藥物［4-5］。然而吡非尼酮和尼達尼布不能延長患者的生存期，并且存在耐受性、不良反應等問題，因此迫切需要開發安全、有效的治療藥物。中醫由于其獨特的理論和悠久的實踐歷史，在世界范圍內逐漸受到廣泛關注。與現代醫學不同，中醫理論更注重的是辨證論治和整體論治。扶正化纖方由補骨脂、冬瓜子、茯苓、甘草、紅景天、黃芪、款冬花、麥冬、三七、山茱萸、太子參、五味子、杏仁、薏苡仁及地龍組成，是全國名老中醫周兆山教授提出的用于治療IPF 的驗方。根據本課題組前期隨機、雙盲實驗研究發現，該方劑治療IPF 有較好的臨床療效［6］。本課題組前期的動物實驗研究發現，扶正化纖方可以減輕博來霉素誘導的IPF 小鼠模型肺組織炎癥和膠原沉積［7］。

隨著系統生物學研究領域的發展，“一個靶點、一種藥物”的傳統模式逐漸轉變為“網絡靶點、多組分療法”模式。網絡藥理學是系統生物學和網絡信息學相結合的綜合性學科，可用于在系統層面上分析多組分藥物對人體的影響，這有助于研究者找到藥物有效活性成分的治療靶點，提高藥物的療效，減少不良反應［8］。同時，中醫整體觀的指導思想、方劑配伍的整體協同機制與網絡藥理學倡導的藥物研發模式相契合。分子對接是一種廣泛應用于藥物發現的基于計算機結構的方法，重點是對分子間相互作用開展研究分析，并對其中存在的親和力及結合模式加以預測［9］。本研究基于網絡藥理學，探索扶正化纖方抗IPF 的分子機制，進行分子對接以驗證活性化合物與關鍵靶點之間的親和力，探索扶正化纖方治療IPF 的潛力。

1 方法

1.1 藥物有效成分與靶點的篩選 通過TCMSP數據庫（https：//tcmspw.com/tcmsp.php）、HERB 數據庫（herb.ac.cn）檢索補骨脂、冬瓜子、茯苓、甘草、紅景天、黃芪、款冬花、麥冬、三七、山茱萸、太子參、五味子、杏仁、薏苡仁及地龍的成分。根據參考文獻，將篩選條件設定為口服生物利用度（oral bioavailability， OB）≥30%，類藥性（drug-likeness， DL）≥0.18［10］。并通過TCMSP 數據庫尋找藥物活性成分的對應靶點，TCMSP 數據庫中未收錄的藥物通過HERB 數據庫，查閱相關文獻資料［11］補充檢索，獲取活性成分。通過PubChem 數據庫、Swiss Target Prediction 數據庫補充藥物靶點。Uniport 數據庫（https：//www.uniprot.org/）用于靶點的校正，去掉非人類靶點，一共獲得333 個靶點。

1.2 “特發性肺間質纖維化”疾病靶點的搜集 以“idiopathic pulmonary fibrosis”為關鍵詞，在Gene-Cards 數據庫（https：//www.genecards.org/）中進行人類基因檢索，并刪除Score 值為0 的靶點。

1.3 交集靶點韋恩圖及蛋白相互作用（protein-protein interaction， PPI）網絡的構建 利用R 語言4.1.3 軟件Venn 包篩選出藥物活性成分對應的靶點與疾病的共有靶點，并繪制韋恩圖。二者的交集靶點輸入String 數據庫（https：//string-db.org/cgi/input.pl）構建PPI 網絡圖，結果文件輸入Cytoscape軟件進行可視化分析，根據Degree 值尋找核心靶點。同時利用Cytoscape 軟件構建“藥物-活性成分-靶點-疾病”的網絡圖。

1.4 基因本體（gene ontology， GO）富集分析與京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes， KEGG）富集分析 通過R 語言4.1.3軟件將藥物疾病共有靶點及疾病靶點進行GO 富集分析和KEGG 通路富集分析，安裝并引用gglpot2包，分別進行圖形繪制。

1.5 分子對接實驗 根據藥物活性成分的CAS 號從數據庫中下載活性成分的3D 結構。從PDB（http：//www.rcsb.org/）數據庫下載關鍵蛋白。采用AutoDock Vina 1.1.2 進行對接。

2 結果

2.1 扶正化纖方中藥物的有效活性成分與作用靶點 經匯總刪重后，本研究篩選得到扶正化纖方中具有潛在作用的有效化學成分共174 個，根據Degree 值排名，排名前20 的活性成分見表1。扶正化纖方中藥物的作用靶點有333 個。

表1 關鍵成分信息表

2.2 扶正化纖方作用靶點與IPF 的交集靶點篩選 篩選得到的扶正化纖方333 個靶點與IPF 疾病相關的3 509 個靶點，利用R 語言Venn 包尋找交集靶點。結果發現兩者共有234 個靶點，可作為藥物作用于疾病的預測靶點進行之后的通路富集分析。見圖1。

圖1 扶正化纖方-特發性肺纖維化交集靶點韋恩圖

2.3 扶正化纖方-IPF 交集靶點的PPI 網絡構建 通過String 數據庫構建PPI 網絡，該網絡中有234 個節點，4 292 條邊，平均Degree 值為15.5；再將String 網站導出的PPI 網絡導入Cytoscape 3.9.1軟件，繪制PPI 網絡圖，見圖2。此外，本研究還構建了“藥物-活性成分-靶點-疾病”網絡圖，可以更加直觀地觀察藥物活性成分與疾病靶點之間的作用關系，見圖3。

圖2 Cytoscape 軟件繪制得到的PPI 網絡圖（節點顏色和大小根據Degree 值調整）

圖3 藥物-成分-靶點-疾病網絡圖

圖4 扶正化纖方治療IPF 的GO 功能富集分析以及KEGG 通路分析

2.4 扶正化纖方-IPF 交集靶點的拓撲分析 通過CytoNCA 工具進行拓撲分析，共篩選得到84 個關鍵靶點，排名前20 位的靶點見表2。結果發現，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（serine/threonine kinase 1，AKT1）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor， TNF）、腫瘤蛋白P53（tumor protein 53， TP53）、血管內皮生長因子A （vascular endothelial growth factor A， VEGFA）等可能是扶正化纖方治療IPF 的潛在核心靶點。

表2 排名前20 位扶正化纖方-IPF 交集核心靶點的拓撲分析

2.5 GO 功能與KEGG 通路富集分析 進一步分析扶正化纖方治療IPF 的信號通路，其中GO 功能總共富集到2 669 條生物過程，225 項分子功能相關，95 項細胞組成相關。KEGG 通路總共富集到178 條信號通路。KEGG 通路富集分析表明扶正化纖方治療IPF 主要涉及晚期糖基化終產物受體（advanced glycation end product-receptor for advanced glycation end-product， AGE-RAGE）信號通路、磷脂酰肌醇-3 激酶/蛋白激酶B （phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B， PI3K/AKT）信號通路、白細胞介素（interleukin， IL）-17 信號通路。見表2。

2.6 分子對接結果 將表1 中Degree 值排名前6位的活性成分與關鍵靶點VEGFA、TP53、STAT3、CASP3、AKT1、TNF 進行分子對接和結合能力預測。結合能越小，表明受體與配體蛋白之間的親和力越大，見圖5。其中槲皮素（MOL000098）和TNF 結合能最小、β-谷固醇（MOL000358）和TNF 結合能為其次，進行可視化處理。見圖6～7。

圖5 活性成分-靶點結合能熱圖

圖7 β-谷固醇（MOL000358）和TNF 蛋白的結合能為-9.0 kcal/mol

3 討論

IPF 的發病機制尚未完全闡明，炎癥、氧化應激、自噬不足等是其重要發病機制之一。根據其病因、癥狀，可以將其歸于中醫學“肺痿”“肺痹”的范疇?；诙嗄昱R床經驗，周兆山教授自擬扶正化纖方，全方共15 味藥，方中黃芪補益肺氣，太子參、麥冬、五味子三藥合用，兼具補、潤、斂之效，上述四藥合用，大補肺之氣陰；山茱萸、補骨脂收澀固脫，二藥合用補助腎氣以治其本；薏苡仁、茯苓、冬瓜子淡滲利濕，行水消腫；三七、紅景天活血補血，調暢肺之氣血；地龍通達肺絡。該方已經在臨床上用于IPF 的治療，且取得良好的臨床療效［6］。

根據網絡藥理學結果顯示，扶正化纖方作用于IPF 的主要活性成分有槲皮素、木犀草素、山柰酚、甘草查爾酮A 等。體外試驗發現槲皮素可以減少肺組織膠原蛋白的沉積，降低肺纖維化模型大鼠肺泡灌洗液中促纖維化介質的濃度，如IL-13、TNF等［12-13］。富含膠原蛋白的細胞外基質（extracellular matrix， ECM）的異常沉積是IPF 的一個重要病理特征。據實驗研究發現，木犀草素通過降低I 型膠原蛋白（collagen Ⅰ）、平滑肌肌動蛋白、鈣黏蛋白E（Ecadherin）的表達，從而抑制ECM 重塑［14］。此外，有研究報道，木犀草素可以通過調控NLRP3/IL-1β/TGF-β1 信號軸，從抗炎、抗膠原沉積2 個方面共同發揮緩解IPF 的作用［15］。山柰酚可通過抑制mTOR信號通路，下調基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases， MMPs）家族中MMP-9 和MMP-2 的表達，發揮緩解ECM 過度沉積的作用［16］。甘草查爾酮A具有抗炎、抗氧化應激、免疫促進等多種生物活性。動物實驗研究發現，甘草查爾酮A 可以通過抑制TGF-β1/Smad 信號通路阻止成纖維細胞活化，下調細胞外基質如collagen I 等表達［17］，還可以調控ERK1/2/NF-κB 信號通路緩解肺組織炎癥反應［18］。

本研究預測AKT1、TNF、TP53、VEGFA 等可能是扶正化纖方治療IPF 的潛在核心靶點。AKT1 既可以調節炎癥反應的關鍵轉錄因子NF-κB 的活性，減少炎性細胞因子的產生，又可以調節炎癥相關的下游產物的活性，例如環氧合酶2。此外，AKT1 與TGF-β1 的激活密切相關。TNF-α則是典型的炎癥因子。在肺纖維化患者的肺組織中可以檢測到TP53 的高表達。研究表明，TP53 可以影響肺上皮細胞的上皮間充質轉化（epithelial mesenchymal transition， EMT）過程，促進肺纖維化的發展［19］。VEGFA 在促進血管生成方面起著至關重要的作用，并已經被證明可以刺激成纖維細胞增殖、遷移和激活［20］。

KEGG 通路富集分析發現扶正化纖方的活性成分主要通過AGE-RAGE 信號通路、PI3K/AKT 信號通路、IL-17 信號通路等干預IPF。根據臨床研究發現，IPF 患者存在AGE/RAGE 失衡，AGE 水平升高，RAGE 表達降低，AGE/RAGE 過度升高可導致纖維化進展加快和肺功能持續下降。AGE/RAGE 信號通路的激活也可介導EMT，進一步導致纖維化［21］。PI3K/AKT 信號通路也在IPF 發展過程中起著重要作用。越來越多的證據表明，TGF-β1 的過度表達與PI3K/AKT 信號通路激活密切相關，二者的相互作用促進了肺纖維化形成［22］。IL-17 由輔助T 細胞17（T helper cell 17， Th17）特異性分泌，參與多種慢性炎癥疾病和自身免疫性疾病［23］。根據前期動物實驗驗證，IPF 小鼠模型中IL-17A 表達升高，IL-17A相關的信號通路被激活［7］，應用IL-17A 拮抗劑可以抑制IPF 小鼠肺組織的慢性炎癥和纖維化進程［24］。

本研究通過網絡藥理學對扶正化纖方治療IPF的作用機制進行了全面、系統的分析，發現扶正化纖方具有復雜的活性成分，并可以通過多靶點、多系統、多通路發揮對IPF 的治療作用，為治療IPF 的新藥研發提供了一定的科學依據。