骨化三醇與益生菌對帕金森小鼠模型行為學影響的對照研究

劉慧琴 楊娟

(上海市浦東新區人民醫院神經內科,上海 200230)

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是常見的神經系統進行性退行性疾病,臨床表現為運動遲緩、震顫、僵硬等運動癥狀,及以便秘、嗅覺缺失等為代表的非運動癥狀。PD 的主要病理變化是路易體(Lewy bodies,LBs)和路易神經元突起(Lewy neurites,LNs)的細胞內包涵體的聚集,以及致密部(Substantia nigra pars compacta,SNpc)的黑質多巴胺能(Dopamine,DA)神經元的丟失[1];對PD的進展病程,目前的治療只能提供暫時的癥狀緩解,丟失的神經元從病理上無法恢復[2]。近年來,腸道起源已成為PD發病機制的理論,而腸道是維生素D的主要靶組織,其中1α,25-二羥基維生素D3(1,25-(OH)2D3)負責腸上皮的屏障功能和腸道炎癥的調節是關鍵作用。本研究應用骨化三醇與益生菌進行對照研究,觀察PD小鼠的行為學變化,從而了解干預效果。

1 材料與方法

1.1 實驗動物2021年5月至2021年10月完成試驗,選取雄性SPF級健康C57BL/6小鼠45只,鼠齡8周,體重19.0～24.0 mg,均由上海復旦大學藥學院實驗動物中心提供并飼養[許可證編號:SCXK(滬)2018-0003],溫度20～25 ℃,相對濕度40%～70%,工作照度150～300 Ix,動物照度15～20 Ix,12 h光照/黑暗交替。

1.2 實驗試劑骨化三醇由青島海爾公司提供;益生菌購自上海信誼藥廠有限公司;1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)購于美國Sigma公司。

1.3 PD小鼠制模實驗小鼠給予MPTP腹腔注射,劑量為40 mg·kg-1·d-1,持續5 d,第一批制模第一天注射后次日發現死亡小鼠9只,尸體解剖顯示均為腸壞死,查閱文獻分析原因考慮為制模過程中腹腔注射過深至腸腔壞死而死亡。隨后補充實驗動物、規范穿刺方法,同時調整制模注射劑量為30 mg·kg-1·d-1,持續7 d,成功制模PD小鼠40只。正常對照組予生理鹽水每只0.1 mL,腹腔注射,每天1次,連續7 d。后期采用Western Blot檢測小鼠黑質的α-syn含量驗證制模成功。

1.4 分組及干預方法將45只健康C57BL/6小鼠隨機分為A組(正常對照,n=5)、B1組(PD模型對照,n=10)、B2組(PD模型益生菌干預,n=10)、B3組(PD模型骨化三醇干預,n=10),B4組(PD模型益生菌聯合骨化三醇干預,n=10)。A組、B1組小鼠均0.9%氯化鈉溶液1 mL·d-1進行灌胃;B2組小鼠給予益生菌溶液109個·d-1灌胃;B3組小鼠給予骨化三醇25 μg·kg-1·d-1進行灌胃;B4組小鼠給予益生菌聯合骨化三醇進行灌胃(濃度同前),用法用量分別與B2組、B3組相同;連續喂養3個月;灌胃的時間均在每日上午9:00～10:00;稱重1次/2周,并根據體重調整給藥量。

1.5 行為學觀察各組分別于制模后15 d、1個月、2個月、3個月每組每批每時間段,在預定時點12時、14時、16時進行行為學觀察。爬桿實驗:將一直徑為25 cm的軟木球固定于一根長50 cm、粗1 cm的木桿頂端,木桿上纏上紗布以防打滑,然后將被測小鼠放到小球上,并記錄小鼠從小球上下來所需要的時間、小鼠爬完桿子的上半部所需要的時間、小鼠爬完桿子下半部所用的時間;然后按以下標準記分:3 s內完成上述某一動作的記3分,6 s內完成的記2分,超過6 s的記1分;最后計算得分情況,并作統計學分析。懸掛實驗:將受試小鼠懸掛于一水平電線上,如小鼠用兩后爪抓住電線則記3分,如小鼠用一后爪抓住電線則記2分,如果小鼠兩后爪均抓不住電線則記1分,最后計算得分情況,并作統計學分析。游泳實驗:將受試小鼠放入一個20 cm×30 cm×20 cm規格的水箱中10 min,水溫為22～25 ℃,先讓動物在實驗箱中自由活動1～2分,以適應環境;將受試小鼠按順序放入水箱,進入水箱后開始計時,每只小鼠的游泳時間限定為6 min,用秒表記錄限定時間內的漂浮時間,記錄評分標準如下:在受試時間內能連續不斷游泳者記 30分,大部分時間游泳(占總受試時間70%～80%)僅偶爾漂浮者記25分,游泳時間占整個受試時間50%～70%記20分,偶爾游泳者(占受試時間30%～50%)記15分,偶爾用后肢游動者(少于受試時間30%)并漂浮在一邊記10分,最后計算得分情況,并作統計學分析。

2 結 果

2.1 各組小鼠存活情況A組小鼠全部正常存活至實驗結束;B1組小鼠制模成功10只,1只在第73天喂養過程中出現進食減少、消瘦、毛發逐漸脫落而死亡,考慮與PD制模衰老所致,另2只在第90天采血過程中失血過多而死亡;B2組小鼠制模成功10只,其中2只小鼠分別在第40天、第51天灌胃時操作不慎至小鼠窒息而死亡,1只在第90天采血過程中失血過多而死亡;B3組小鼠制模成功10只,其中1只小鼠在第25天灌胃時操作不慎至小鼠窒息而死亡,2只在第90天采血過程中失血過多而死亡;B4組小鼠制模成功10只,其中1只在第90天采血過程中失血過多而死亡。

2.2 各組爬桿實驗分值情況

2.2.1 爬桿實驗中從小球上下來的計分時間、干預方法在實驗分值上存在統計學差異(P<0.05),說明各時間點、干預方法的不同都會影響實驗分值;時間與干預方法在實驗分值上無交互效應;B1組、B2組、B3組與B4組相比,均存在統計學差異(P<0.05)。見表1及圖1。

注:group:1=A組、2=B1組、3=B2組、4=B3組、5=B4組;time:1=第15天、2=第1個月、3=第2個月、4=第3個月。

表1 各組爬桿實驗中小鼠從小球上下來的計分分]

2.2.2 爬桿實驗中小鼠爬完桿子的上半部的計分時間、干預方法在實驗分值上存在統計學差異(P<0.05),說明各時間點、干預方法的不同都會影響實驗分值;時間與干預方法在實驗分值上無交互效應;B1組實驗分值低于A組和B2組,且實驗分值存在統計學差異(P<0.05);B2組實驗分值高于B4組,且存在統計學差異(P<0.05)。見表2及圖2。

注:group2:1=A組、2=B1組、3=B2組、4=B3組、5=B4組;time:1=第15天、2=第1個月、3=第2個月、4=第3個月。

表2 各組爬桿實驗中小鼠爬完桿子的上半部分的計分分]

2.2.3 爬桿實驗中小鼠爬完桿子的下半部的計分時間、干預方法在實驗分值上存在統計學差異(P<0.05),說明各時間點、干預方法的不同都會影響實驗分值;時間與干預方法在實驗分值上無交互效應;B1、B2、B3、B4組實驗分值低于A組,且實驗分值存在統計學差異(P<0.05);B4組實驗分值高于B1組,且存在統計學差異(P<0.05)。見表3及圖3。

注:group3:1=A組、2=B1組、3=B2組、4=B3組、5=B4組;time:1=第15天、2=第1個月、3=第2個月、4=第3個月。

表3 各組爬桿實驗中小鼠爬完桿子的下半部分的計分分]

2.3 懸掛實驗的計分時間、干預方法在實驗分值上存在統計學差異(P<0.05),說明各時間點、干預方法的不同都會影響實驗分值;時間與干預方法在實驗分值上無交互效應;B1、B2、B3、B4組實驗分值均低于A組,且實驗分值存在統計學差異(P<0.05);B2、B3、B4組實驗分值均高于B1組,且存在統計學差異(P<0.05)。見表4及圖4。

注:group4:1=A組、2=B1組、3=B2組、4=B3組、5=B4組;time:1=第15天、2=第1個月、3=第2個月、4=第3個月。

表4 各組小鼠懸掛實驗的計分分]

2.4 游泳實驗的計分干預方法在實驗分值上存在統計學差異(P<0.05),說明干預方法的不同都會影響實驗分值;時間在實驗分值上無統計學差異(P>0.05);時間與干預方法在實驗分值上無交互效應;B1組實驗分值低于A組,且實驗分值存在統計學差異(P<0.05);B2組實驗分值高于B1組,且存在統計學差異(P<0.05)。見表5及圖5。

注:group5:1=A組、2=B1組、3=B2組、4=B3組、5=B4組;time:1=第15天、2=第1個月、3=第2個月、4=第3個月。

表5 各組小鼠游泳實驗的計分分]

3 討 論

PD是中老年中僅次于阿爾茨海默病的第二常見神經系統退行性疾病。世界范圍內PD發病率為0.4%～2.0%,目前我國PD患者人數約260萬人,預計2030年該數字將達到500萬人。但是PD的發病機制不明確、早期診斷方法不夠、根治性治療手段缺乏,因此面臨嚴峻的挑戰。傳統的觀念認為PD僅表現為運動遲緩等運動癥狀,但是近年來研究發現以便秘、嗅覺缺失為代表的非運動癥狀在運動癥狀發生前甚至十年前就出現,并貫穿PD整個發生發展過程,和運動癥狀一起嚴重影響患者的生命質量。目前認為PD的發病病理改變是神經元多巴胺變性,其中變性神經元為大量聚集的α-Syn,而這種異常折疊的α-Syn是PD發生發展中的重要病理標志。近年來,微生物群-腸-腦軸(Microbiota-Gut-Brain-Axis,MGBA)被提出,其認為腸道微生物參與PD的發生發展過程,而維生素D和腸道微生物存在相關性。本研究旨在通過建立MPTP致PD小鼠模型,從PD腸源理論出發,對照分析骨化三醇、益生菌對PD小鼠模型行為學的影響,進一步探討PD的治療方法。

MPTP致PD小鼠模型是目前常用的PD動物模型之一[3],其在一定程度上再現了PD的主要特征。本研究結果顯示,爬桿實驗中小鼠爬完桿子的上、下半部分、懸掛實驗及游泳實驗中B1組小鼠的實驗分值均低于A組,且具有統計學差異(P<0.05),與PD的運動遲緩癥狀相符。本研究結果發現,干預方法與實驗分值存在組間主效應,說明骨化三醇、益生菌影響PD小鼠的行為學,除游泳實驗,其余各項實驗分值均與時間點存在組內效應,具有統計學差異(P<0.05),同時第2、3個月節點PD模型組實驗分值呈下降趨勢,PD小鼠癥狀呈逐漸加重趨勢,與PD的進行性退行性病變的病理生理基本符合[4]。本研究中爬桿實驗上半部分的分值、游泳實驗的分值結果均提示:B2組的實驗分值高于B1組,存在統計學差異(P<0.05),說明益生菌干預可某種程度改善PD小鼠行為學,與其他研究結論[5-6]基本相符。而爬桿實驗下半部分中B2組的實驗分值高于B1組,但未達到統計學意義,考慮與以下因素有關:本研究的樣本量偏少,后期可進一步擴展樣本量;益生菌對PD小鼠行為學的改變存在偏差,腸道微生物群(Gut microbiota,GM)的改變對α-Syn聚集存在選擇性,從而導致改善癥狀的程度不同。一些數據表明,α-Syn聚集可能開始于腸道自主神經叢,并向中樞神經系統擴散[7],這可能受到GM的影響[8]。近年來,GM在PD和其他神經退行性疾病發病機制中的作用引起了越來越多的關注。發病機制包括DA合成和代謝的改變、免疫系統失調和炎癥以及腸黏膜通透性的改變等[9]。健康的腸道微生物積極調節中樞神經免疫反應,菌群的失調可能導致一種不良的神經炎癥狀態,從而增加神經退行性疾病的風險[10]。因此,維持健康腸道微生物菌群可能降低PD患病率。有研究[8-11]評估了移植GM是否導致PD,與無菌小鼠相比,未消滅微生物組的小鼠的大腦中存在更多的α-Syn聚集;進一步將PD患者的糞便樣本移植到無菌小鼠中會加劇α-Syn誘導的運動癥狀。因此,GM成分對大腦中α-Syn聚集具有聯合作用。有關PD的研究[12-14]表明,與非PD對照組相比,GM存在顯著差異。GM組成的變化可能與PD的不同臨床表型有關,腸道菌群調節干預,如益生菌和糞便菌群移植,有可能恢復腸道生態失調,減少炎癥,調節PD的臨床表型[15]。服用含有乳酸桿菌、雙歧雙歧桿菌、羅伊氏乳桿菌和發酵乳桿菌的益生菌(活性微生物膳食補充劑)的PD患者,其統一帕金森氏病評分量表(UPDRS)評分總分較安慰劑組顯著降低[16],我們前期的行為學變化證實了益生菌對PD行為學的改變,但糞便菌群、病理改變是否有相關的陽性發現,需待后期的研究結果進一步驗證。

本研究中爬桿實驗下半部分的分值、懸掛實驗分值結果均顯示,B3組實驗分值高于B1組,且存在統計學差異(P<0.05),提示骨化三醇可改善PD小鼠的某些行為學;爬桿實驗上半部分的分值結果顯示,B2組的實驗分值高于B4組,存在統計學差異(P<0.05),僅能提示益生菌的效果好于聯合組,但益生菌與骨化三醇之間的優劣性尚無明確證據;同時結果提示兩者對PD小鼠行為學的改變僅1或2項,而非全部改變,考慮與以下因素有關:本研究中益生菌及骨化三醇均采取灌胃的方式,而小鼠的消化吸收不均一,后期是否可尋找更科學,誤差更小的干預方法,如靜脈注射等;PD的致病因素復雜,而非僅單一的表現,需待后期的樣本量擴大、糞便菌群檢測、病理等進一步研究。腸道菌群失調與炎性反應直接相關,腸道是維生素D的主要靶組織,其中,其活性形式1,25-(OH)2D3負責腸上皮的屏障功能和腸道炎癥的調節是關鍵作用。體外數據表明[17],在維生素D缺乏和維生素D受體基因敲除的動物中, 腸道微生物群出現紊亂而導致代謝失調;亦有研究[18]證實,膳食中維生素D和 25-(OH)-D3 的攝入量與糞球菌和雙歧桿菌呈負相關;而腸道微生物群本身也可通過成纖維細胞生長因子影響維生素D的代謝[19]。因此,維生素D對GM具有明顯影響。有報道[20]稱,維生素D可以通過將M1促炎反應轉移到M2抗炎反應來減輕炎癥反應,上調抗炎標志物的表達,抑制誘導型一氧化氮合成酶(iNOS)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1β(L-1β)等炎性因子的表達。此外,骨化三醇可通過調節TNF基因轉錄的機制減弱TNF在小膠質細胞中的表達起到抗炎作用[21]。同時維生素D缺乏和功能不全在PD患者中較常見[22-23],以往人們往往將之歸結為PD患者活動能力受限從而減少了日光照射,同時PD患者的胃腸功能降低進一步影響維生素D的吸收。

綜上所述,骨化三醇、益生菌均可改善PD小鼠的行為學,但兩者間的差異不明確;骨化三醇對于PD小鼠行為學的改善可能源于對腸道微生物的作用,調節腸道炎癥反應,通過MGBA抑制α-Syn在中樞神經系統的異常折疊與沉積,從而改善PD相關癥狀,可以成為PD潛在的治療方法。

利益沖突說明/Conflict of Intetests

所有作者聲明不存在利益沖突。

倫理批準及知情同意/Ethics Approval and Patient Consent

本研究通過上海市浦東新區人民醫院倫理委員會批準,為動物實驗,故知情同意免除。