中性粒細胞胞外誘捕網（NET）與肝臟疾病的關系

仁增卓嘎， 楊康潔， 蘆永良， 王志鑫， 王海久

1 青海大學附屬醫院 a.肝膽外科， b.檢驗科， 西寧 810001

2 拉薩市人民醫院麻醉科， 拉薩 850000

中性粒細胞胞外誘捕網（neutrophil extracellular traps，NET）可由致病菌、免疫復合物、血小板、佛波酯（phorbol myristate acetate，PMA）和脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）等刺激中性粒細胞產生［1］。其釋放過度會導致多種免疫細胞相互作用，促使IL-8、IL-6、TNF-α等多種細胞因子分泌，從而促進炎癥引發組織損傷［2］。NET不但與自身免疫疾病、癌癥和血栓形成在內的幾種疾病的病理生理有關，而且近些年研究表明，NET在肝臟疾病中發揮重要作用，且NET的過度釋放還可加速肝臟疾病向肝癌的進展。本文通過綜述NET在乙型肝炎、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、缺血再灌注損傷、肝臟腫瘤中的最新研究進展，為相關肝病的診療和肝癌的預防提供新的思路。

1 NET形成機制與肝臟病理機制

1.1 NET形成機制 NET是細菌、病毒、細胞因子、LPS和PMA等物質刺激中性粒細胞產生的，其中PMA［3］能夠最大限度激活中性粒細胞，形成由中性粒細胞彈性酶（neutrophil elastase，NE）、髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）、瓜氨酸化組蛋白（H3 citrullination，H3cit）等組成的纖維網狀結構［4］。此過程不同于凋亡和壞死的死亡方式，被稱為“NETosis”。且根據是否導致中性粒細胞死亡分為可溶性NET和非可溶性NET兩種，又稱為氧化依賴性和非氧化依賴性。

可溶性NET是中性粒細胞在PMA［3］刺激下，結合PKC和RAF-MEK-MARK信號通路，使NADPH酶激活釋放氧自由基（ROS），從而激活肽基精氨酸脫亞胺酶4（peptidyl arginine deiminase 4，PAD4）使組蛋白上精氨酸正電消失，并轉化為瓜氨酸，導致DNA和組蛋白間電荷破壞，染色質解體。解體的染色質和顆粒蛋白釋放到細胞外空間形成NET，其中，ROS產生是NET形成的關鍵。在可溶性NET形成后，由于染色質的解體，中性粒細胞喪失吞噬和趨化作用。非可溶性NET是細菌［5］、Toll樣受體2（TLR2）［6］刺激中性粒細胞，激活PAD4，使NE易位進入細胞核，細胞核中的染色質通過囊泡形式排出細胞外形成的。此過程不依賴NADPH酶，且不破壞質膜，因此，在非可溶性NET形成過程中中性粒細胞仍具有吞噬和趨化能力。

1.2 NET形成與肝臟病理機制 NET在肝臟中通過Kupffer細胞和中性粒細胞清除血源性細菌，發揮先天自身免疫的關鍵任務。其中，Kupffer細胞具有免疫球蛋白超家族補體受體（CRIg），可識別補體C3調理顆粒、外源性抗原及病原體，捕獲及吞噬病原體［7］。另外，Kupffer細胞可通過招募血小板，使Kupffer細胞表面血管性血友病因子（vWF）與血小板糖蛋白（GPIb）相結合，導致血小板聚集，促進細菌的清除（圖1）。其機制尚未清楚，可能原因是Kupffer細胞激活內皮細胞Toll樣受體4（TLR4），使得中性粒細胞黏附于肝竇內皮細胞，包圍感染的Kupffer細胞，從而阻止病原體通過血液傳播。研究表明，黏附的中性粒細胞能與整合素介導的血小板相結合觸發NET釋放，通過中性粒細胞-血小板-NET軸刺激顆粒蛋白，其中組蛋白激活凝血酶［8］，使其進而形成纖維蛋白原，導致肝竇內微血管血栓的形成（圖1）。凝血酶的產生不僅導致纖維蛋白原凝塊的形成，還可通過蛋白酶激活受體增強血小板的活性。NE和MPO又通過蛋白酶激活受體激活血小板，釋放NET。綜上所述，NET在肝臟中形成過程是一種循環，即肝臟中性粒細胞-血小板-NET軸，血小板誘導NET形成，NET自身蛋白顆粒又激活血小板，此循環既有利于致病菌的清除，又加重了炎癥的進展，促進凝血和組織損傷。

圖1 NET形成與肝臟病理機制Figure 1 NET formation and hepatic pathology

2 NET與肝臟疾病的聯系

肝臟是殺死致病菌，發揮免疫防御的重要器官。NET被報道參與一系列疾病的發生發展，如自身免疫性疾病、血液性疾病、癌癥等。現有研究表明，NET也在肝臟疾病中扮演著重要的角色。

2.1 HBV感染 慢性HBV感染與肝纖維化、肝硬化及肝癌的發生密切相關。越來越多的研究表明，HBV感染與NET間存在一定聯系。當機體感染HBV時，中性粒細胞功能降低，ROS的產生出現障礙，進而抑制NET形成。Hu等［9］研究表明，HBV C蛋白或HBV E蛋白通過減少ROS的產生和自噬來抑制NET釋放，其中自噬機制是纖維蛋白原樣蛋白2（Fgl2）與粘脂蛋白3（Mccoln3）直接結合，調節鈣離子內流啟動自噬，引發Fgl2-Mccoln3-自噬軸，從而觸發NET的形成，加重病毒性肝炎的肝損傷［10］（圖2）。另外，對HBV感染小鼠模型的研究發現，NET形成區域有大量的纖維蛋白沉積。這意味著NET與血栓可能存在關聯，可能是由于Fgl2將凝血酶原轉化為凝血酶，促進纖維蛋白沉積，其具體機制值得進一步研究。綜上所述，在HBV感染時，NET不僅能捕獲病毒，還能引起纖維蛋白的沉積和血栓的形成，也可加重病毒性肝炎的肝損傷。

圖2 NET與肝臟疾病的聯系Figure 2 The association of NET with liver disease

2.2 NASH NASH是最常見的肝病之一，可由肝纖維化發展為肝硬化和肝細胞癌（HCC）［11］。研究發現，NET中的標志蛋白MPO和NE在NASH的發生發展過程中發揮著重要作用。Puli等［12］通過NE基因敲除的小鼠和野生型小鼠建立NASH模型，發現野生型NASH小鼠肝組織中NE表達增加，且NASH患者血清標志物MPO-DNA水平升高，抑制MPO能顯著降低肝星狀細胞的激活，導致肝纖維化發展和肝細胞損傷。Xu等［13］發現丹參酮（TⅡA）能夠抑制MPO和H3cit，進而抑制NET釋放，同時也證明TⅡA能夠改善NASH小鼠的肝脂肪變性，降低血清中肝功能障礙標志物的表達水平。其次，多種細胞因子也可作用于NET與NASH，如IL-6和TNF-α促炎因子，刺激NASH患者NET的形成，且增強NASH促凝血活性［14］。另外，Wang等［15］通過小鼠模型研究發現，NET可通過促進調節性T淋巴細胞（Treg）分化，促進NASH脂肪變性，導致肝臟腫瘤的發生和發展（圖2），抑制NET可降低NASH肝臟中Treg活性及腫瘤的發生。

2.3 肝缺血再灌注損傷 缺血再灌注損傷是先天免疫性的無菌炎癥反應，常發生于肝移植術后和肝切除術后。越來越多的研究發現，中性粒細胞作為肝缺血再灌注損傷的主要驅動力，缺血后釋放ROS，促進NET形成，進而加重肝損傷［16］。如高遷移率族蛋白1（nuclear factor high mobility group box 1，HMGB1）通過TLR4誘導染色體解聚，形成NET發揮促炎作用［17］，而羥氯喹通過阻斷TLR9抑制PAD4的表達來抑制NET形成［16］，保護肝缺血再灌注損傷。除這些化學物質外，一些炎性因子也會導致肝缺血再灌注損傷加劇，研究人員［18］通過計算機動態網絡分析，發現肝缺血再灌注損傷后，IL-17A促進中性粒細胞浸潤和NET形成，加重肝損傷。在富含組氨酸糖蛋白（histidine-rich glycoprotein，HRG）小鼠模型中發現，HRG小鼠存在嚴重肝損傷且伴有中性粒細胞和NET形成增加，通過HRG預處理后可抑制中性粒細胞和NET形成，減輕小鼠缺血再灌注損傷［19］。另外，黃姜素也可通過抑制MEK/ERK信號通路來減輕肝缺血再灌注損傷［20］。此外，研究［21］發現苯甲酸酰肼、西維來司等化學物質也可通過抑制NET的形成減輕缺血再灌注損傷（表1）。綜上所述，抑制NET的釋放可減輕肝缺血再灌注損傷，這為肝移植術后和肝切除術后的缺血再灌注損傷提供了治療策略。

表1 影響肝缺血再灌注損傷的因素Table 1 Factors that influence hepatic ischemia and reperfusion injury

2.4 NET與肝癌 HCC是我國發病率和病死率較高的惡性腫瘤，超過90%的HCC發生于HBV、NASH等代謝性疾病和缺血再灌注損傷引起的肝損傷［23］。研究［24］表明，腫瘤細胞通過釋放趨化因子、蛋白酶及活化的血小板觸發腫瘤微環境，將中性粒細胞招募至腫瘤微環境形成腫瘤相關中性粒細胞釋放NET。相反，NET釋放的NE、基質金屬蛋白酶9（MMP-9）、組織蛋白酶G（CG）也可刺激癌細胞的增殖和遷移，進而促進腫瘤轉移（圖2）。隨著研究深入，人們發現NET能促進HCC的生長和轉移，主要表現為血管生成增加、上皮-間質轉化（EMT）相關細胞遷移、細胞外基質降解和細胞捕獲。研究［25］發現，NET血漿標志物在肝硬化中升高，與肝硬化和/或HCC患者的肝功能障礙程度相關。Kaltenmeier等［26］和Wang等［27］通過對肝臟惡性腫瘤患者的血清和組織進行回顧性分析證明，NET能促進HCC的生長和轉移，通過阻斷CXCL2可減弱中性粒細胞向腫瘤的募集和NET的形成，并抑制HCC進展，同時該研究表明NET血清標志物可作為術前判斷HCC復發風險的指標。Guan等［28］研究發現NET可捕獲HCC細胞，被捕獲的HCC細胞通過中和Toll樣受體TLR4/9-CCOX2信號傳導，激發肝細胞的轉移潛能，若抑制TLR4/9-CCOX2信號傳導或DNaseⅠ直接破壞NET，就可減少小鼠模型HCC的轉移。Yang等［29］研究發現，HCC能夠刺激富含氧化線粒體DNA的NET，從而促進HCC的轉移。綜上所述，NET在HCC中發揮了重要作用，干預腫瘤相關中性粒細胞抑制NET形成可成為肝癌治療的新靶標［30］。

3 小結

近年來，國內外研究表明，NET除發揮免疫防御作用外，還從多方面參與肝臟疾病的病理生理過程，其關鍵成分MPO、H3cit等蛋白對疾病的發生發展都起著關鍵作用。本文總結了NET在乙型肝炎、NASH、缺血再灌注損傷等多種疾病發生發展中的作用。雖然NET在肝臟疾病中的具體作用機制研究尚處于起步階段，但已有的研究［31］結果表明，DNase Ⅰ或PAD4抑制劑通過抑制NET形成，可減少多種原因所致肝損傷及肝癌的發展，使用此類抑制劑可減少中性粒細胞向腫瘤的募集。但目前NET在肝臟疾病中的研究尚處于初級階段，未來深入研究NET對肝臟疾病的影響及機制，以期為肝臟疾病治療和預后的早期識別提供新的思路。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明：仁增卓嘎負責課題設計，收集文獻，撰寫論文；楊康潔參與圖片制作；王志鑫參與論文修改；蘆永良、王海久等負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。