孟德爾隨機(jī)化分析方法在非酒精性脂肪性肝病病因探索中的應(yīng)用

郭紫薇， 武慶娟， 葉永安， 陳蘭羽， 呂文良

1 中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院感染疾病科， 北京 100053

2 北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院脾胃科， 北京 100700

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是指除外酒精和其他明確肝損傷因素所致的以肝細(xì)胞內(nèi)脂肪過度沉積為主要特征的臨床病理綜合征［1-3］。近期發(fā)表的一項納入120余萬人的系統(tǒng)評價和薈萃分析報告［4］指出，NAFLD正影響著全球約30%的人群，且影響范圍仍有擴(kuò)大趨勢。2023年，歐洲肝病學(xué)會（EASL）提出將NAFLD更名為代謝功能障礙相關(guān)脂肪性肝病（metabolic dysfunctionassociated steatotic liver disease，MASLD）［5］。NAFLD的發(fā)病機(jī)制是一個復(fù)雜的過程，涉及多種因素的相互作用，如胰島素抵抗、氧化應(yīng)激、炎癥因子、腸道菌群失調(diào)等，而遺傳因素也被證明影響NAFLD的疾病進(jìn)展，這種影響被認(rèn)為是遺傳變異和環(huán)境因素之間相互作用的結(jié)果［6］。

近年來，基于全基因組關(guān)聯(lián)研究（genome-wide association study，GWAS）的大樣本的孟德爾隨機(jī)化（mendelian randomization，MR）研究方法越來越廣泛地應(yīng)用于多種疾病的高危因素探索中，其采用單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNP），也就是遺傳變異作為工具變量（instrumental variables，IV），對風(fēng)險因素和疾病之間進(jìn)行因果推斷［7-8］。隨著肝病領(lǐng)域多項大規(guī)模GWAS的公開發(fā)布，使得利用MR方法進(jìn)行相關(guān)慢性肝病危險因素的評估成為可能，且探索NAFLD的病因和高危因素具有重要臨床意義。本文將圍繞目前MR方法及其在NAFLD的病因探索中的應(yīng)用進(jìn)行綜述，從而為NAFLD的病因?qū)W研究和預(yù)防策略提供依據(jù)。

1 MR研究簡介

隨機(jī)對照研究（RCT）在循證醫(yī)學(xué)中證據(jù)級別最高［9］，其核心在于隨機(jī)分組，可最大程度地避免臨床試驗設(shè)計及實(shí)施中可能出現(xiàn)的各種偏倚，平衡混雜因素，提高統(tǒng)計學(xué)檢驗的有效性等優(yōu)勢［10］。然而，由于其受到倫理學(xué)、受試者依從性、研究期限等因素的制約，理想的設(shè)計和實(shí)施存在一定差距。另外，RCT中納入排除標(biāo)準(zhǔn)的限制可能導(dǎo)致研究樣本與真實(shí)世界的人群出現(xiàn)異質(zhì)性，致使研究結(jié)論的外推性也有待驗證［11］。傳統(tǒng)觀察性研究的方法原則為非干預(yù)性、非隨機(jī)化，因受大量混雜和反向因果干擾，結(jié)論無法推斷因果［12］。為克服上述問題，MR引入計量經(jīng)濟(jì)學(xué)中IV法的思想，其基于全基因組測序數(shù)據(jù)，以遺傳變異作為IV，用于揭露結(jié)局與暴露之間的因果關(guān)系。該研究方法以孟德爾遺傳定律為基礎(chǔ)，在減數(shù)分裂過程中，遺傳變異隨機(jī)分配到子代中，并且在此后保持不變，這使得其相比于傳統(tǒng)的觀察性研究，更少受到混雜與偏倚因素的干擾［13］。1986年，Katan［14］提出不同等位基因決定了不同載脂蛋白E亞型，進(jìn)而通過調(diào)控膽固醇水平的高低影響人群中癌癥發(fā)病率的差異，是MR概念的雛形。2004年，Thomas和Conti［15］提出使用遺傳信息作為IV來進(jìn)行流行病學(xué)的因果推斷的模型有效性。IV的選擇需要滿足3個基本條件：（1）關(guān)聯(lián)性假設(shè)，即IV和暴露因素相關(guān)；（2）獨(dú)立性假設(shè)，即IV與暴露因素和結(jié)局之間的混雜因素?zé)o關(guān)；（3）排他性假設(shè)，即IV只能通過暴露因素影響結(jié)局。利用遺傳變異作為IV的主要優(yōu)勢在于：遺傳變異的形成獨(dú)立于社會環(huán)境、生活習(xí)性和其他性狀，這一特性保證了各個混雜因素在遺傳變異的不同亞組間的均衡性，理論上避免了混雜因素的影響；另一方面，遺傳變異的形成先于環(huán)境暴露、混雜及疾病結(jié)局的發(fā)生及水平變化，由遺傳變異作為暴露的IV所解釋的暴露變異亦先于結(jié)局，由此排除了逆向因果問題［10，16］。

早期的MR研究通常在小樣本人群中的觀察性研究中進(jìn)行，且僅使用了少量的遺傳變異，這使得MR研究的效力較低。然而，隨著生物學(xué)界發(fā)現(xiàn)了大量與特定性狀緊密相關(guān)的遺傳變異，以及數(shù)十萬個暴露和疾病與遺傳變異相關(guān)的GWAS匯總數(shù)據(jù)的公開發(fā)布，使這一領(lǐng)域發(fā)生了一場革命。近十年來，MR分析已成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域尤其是流行病學(xué)病因探索研究的熱門統(tǒng)計學(xué)技術(shù)，不僅為多種復(fù)雜疾病的病因及治療提供科學(xué)依據(jù)，還為新藥研發(fā)、公共衛(wèi)生決策的制定提供了參考與指導(dǎo)［17］。

2 MR在NAFLD病因中的探索

2.1 驗證疾病或病理狀況與NAFLD發(fā)生風(fēng)險的因果關(guān)系 既往流行病學(xué)研究［18-19］提示，NAFLD可顯著增加心血管疾病、慢性腎病、肝外腫瘤等常見慢性病的發(fā)病風(fēng)險。NAFLD是這些疾病的“病因”之一，還是僅為此類疾病發(fā)病過程中的一個伴隨狀態(tài)，目前仍不清楚。MR在NAFLD病因的探索中，一定程度上確定和排除了一些疾病或病理狀況與NAFLD發(fā)生風(fēng)險的因果關(guān)系。如關(guān)于NAFLD在冠狀動脈疾病（CAD）的發(fā)病機(jī)制中是積極的貢獻(xiàn)者還是無辜的旁觀者，一直存在爭議。陳興棟團(tuán)隊［20］利用GWAS匯總數(shù)據(jù)，構(gòu)建出一套MR分析框架，系統(tǒng)分析NAFLD與34種常見肝外疾病的因果關(guān)聯(lián)。為了篩選合格的IV，研究人員共進(jìn)行3輪MR分析，并發(fā)現(xiàn)NAFLD與2型糖尿病、高血壓、心肌梗死、老年癡呆等9種疾病存在顯著且穩(wěn)健的因果關(guān)聯(lián)。Ren等［21］通過雙樣本MR分析，以評估遺傳預(yù)測的NAFLD與CAD風(fēng)險之間的關(guān)系，該研究結(jié)果顯示，在排除與極低密度脂蛋白（VLDL）分泌受損相關(guān)的遺傳變異后，遺傳預(yù)測的NAFLD和CAD之間存在強(qiáng)相關(guān)。此外，呂國悅等［22］首次采用英國生物銀行約30多萬人的數(shù)據(jù)，通過MR法評估肌減少癥相關(guān)指標(biāo)（肌肉量和握力）和NAFLD的關(guān)系。該研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肌肉量和握力的下降和NAFLD的嚴(yán)重程度密切相關(guān)，并提示運(yùn)動能力的改善可有效緩解NAFLD的嚴(yán)重程度。然而，該研究提示的只是一種相關(guān)關(guān)系，而非因果關(guān)系，在一定程度上表明MR研究的暴露水平是由遺傳變異決定的，并不等價于傳統(tǒng)的暴露，因此MR研究可能容易獲得陰性結(jié)果。近期還有研究發(fā)現(xiàn)NAFLD與多囊卵巢綜合征（PCOS）之間存在關(guān)聯(lián)，但這種關(guān)聯(lián)的因果性質(zhì)仍不確定。Liu等［23］基于“肝-卵巢軸”，采用雙向MR分析，檢驗NAFLD和PCOS之間的因果關(guān)系。該研究表明，遺傳預(yù)測的NAFLD與患PCOS的高風(fēng)險有關(guān)，其中，空腹胰島素和性激素可能介導(dǎo)NAFLD和PCOS之間的聯(lián)系，但反之證據(jù)較少。有研究［24］試圖在大型隊列中使用雙樣本MR分析方法探索NAFLD是否會增加患重癥新型冠狀病毒感染（COVID-19）的風(fēng)險。該研究中單變量分析表明NAFLD與重癥COVID-19之間存在顯著關(guān)聯(lián)［比值比（OR）=3.06，P=1.07×10-6］。然而，在調(diào)整了人口統(tǒng)計學(xué)和合并癥因素后，這種關(guān)聯(lián)消失了（OR=1.57，P=0.09）。筆者認(rèn)為，雖然在人群水平上，NAFLD可能與嚴(yán)重的COVID-19發(fā)病風(fēng)險相關(guān)，但這種關(guān)聯(lián)很可能受到NAFLD合并癥后的其他代謝紊亂的干擾。因此，目前尚無確切證據(jù)支持NAFLD是重癥COVID-19的致病危險因素。其他相關(guān)MR研究還探索了中風(fēng)［25］、2型糖尿病［26］、甲狀腺功能減退癥［27］、銀屑病［28］、炎癥性腸病［28］、幽門螺旋桿菌感染［29］、胰腺癌［30］等疾病或病理狀況與NAFLD發(fā)生風(fēng)險的因果關(guān)聯(lián)，亦聯(lián)合諸如美國國家健康與營養(yǎng)調(diào)查（National Health And Nutrition Examination Survey，NHANES）等數(shù)據(jù)庫，評估NAFLD患者中某一疾病與NAFLD進(jìn)展風(fēng)險之間的關(guān)系［31］，進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了預(yù)防和管理NAFLD在臨床與公共衛(wèi)生實(shí)踐中的重要性。

2.2 確認(rèn)和揭示生活方式、代謝相關(guān)指標(biāo)、血清參數(shù)對NAFLD的潛在影響 生活方式的改變可能會對公眾健康產(chǎn)生重大影響，諸多流行病學(xué)證據(jù)表明，咖啡攝入、糖攝入、久坐等生活方式均是NAFLD發(fā)生的危險因素，但這些生活方式是否與NAFLD之間有明確的因果關(guān)系以及改變這些因素是否會降低NAFLD的患病風(fēng)險尚不清楚［32］。此外，循環(huán)脂質(zhì)等代謝相關(guān)指標(biāo)、血清參數(shù)與NAFLD之間的關(guān)系也一直是研究的熱點(diǎn)。然而，上述相關(guān)研究均是風(fēng)險因素或生物標(biāo)志物的“相關(guān)性”研究，而鮮有大隊列研究聚焦因果關(guān)聯(lián)，全面、系統(tǒng)地評估NAFLD和危險因素的“因果性”仍具挑戰(zhàn)。Xie等［33］基于單變量和多變量MR分析，發(fā)現(xiàn)飲酒頻率、血清肝功能相關(guān)酶升高、身體狀況不佳、肥胖、2型糖尿病、高血壓可增加NAFLD的發(fā)病風(fēng)險，而高學(xué)歷和高密度脂蛋白膽固醇與NAFLD風(fēng)險降低相關(guān)。此外，輕度體育鍛煉與NAFLD呈弱相關(guān)，而吸煙、咖啡、睡眠、劇烈運(yùn)動等均無顯著相關(guān)性。既往觀察性研究顯示，NAFLD與血清尿酸（SUA）水平高度相關(guān)，但由于反向因果關(guān)系，這些研究存在固有的偏倚風(fēng)險。Li等［34］通過雙向MR分析支持NAFLD導(dǎo)致SUA水平升高的因果關(guān)系，但該研究并未證實(shí)SUA水平與NAFLD風(fēng)險之間的潛在因果關(guān)聯(lián)，且仍需更深入的研究來解釋相關(guān)機(jī)制。盡管在一些臨床試驗中觀察到維生素D具有改善肝臟對胰島素的反應(yīng)以及減輕肝臟炎癥和改善肝功能等治療效果，但其與NAFLD之間的因果關(guān)系尚未闡明。Yuan等［35］的一項MR研究通過大樣本數(shù)據(jù)證實(shí)，維生素D水平的增加在歐洲人群的NAFLD預(yù)防中發(fā)揮作用。Chen等［36］采用9個與全基因組血漿磷脂花生四烯酸（AA）顯著相關(guān)的SNP作為IV，旨在通過MR分析確定AA與NAFLD之間的因果關(guān)系。研究表明，AA水平每增加一個標(biāo)準(zhǔn)差，NAFLD的發(fā)生風(fēng)險隨之增加（OR=1.06，95%CI：1.02～1.11，P=0.008），即高水平的AA與NAFLD風(fēng)險存在潛在因果關(guān)聯(lián)。既往研究亦發(fā)現(xiàn)，在NAFLD發(fā)生發(fā)展過程中，補(bǔ)體系統(tǒng)被激活，且補(bǔ)體水平與肝臟損傷程度呈平行關(guān)系，關(guān)于補(bǔ)體系統(tǒng)與NAFLD因果關(guān)系的研究證據(jù)目前尚不充分。Li等［37］基于廣西防城港男性健康隊列，在橫斷面和縱向研究設(shè)計基礎(chǔ)上，結(jié)合雙向MR分析方法，探討了血清補(bǔ)體C3和C4與NAFLD發(fā)生發(fā)展的因果關(guān)系。該研究結(jié)果證實(shí)，NAFLD是導(dǎo)致人體血清補(bǔ)體C3水平升高的原因，但血清補(bǔ)體C3水平升高并不是導(dǎo)致NAFLD發(fā)生風(fēng)險升高的原因。該研究為遺傳因素決定的補(bǔ)體C3、C4與NAFLD之間的因果關(guān)系提供了新的證據(jù)，血清補(bǔ)體C3水平的變化可考慮作為NAFLD患者臨床治療中判斷疾病進(jìn)展程度的輔助觀察指標(biāo)。此外，一些研究也采用MR法分析了其他因素如習(xí)慣性咖啡攝入量［38］、睡眠特征［39］、大麻的攝入［40］、486種血液代謝物［41］、同型半胱氨酸及葉酸［42］、循環(huán)半乳糖凝集素［43］等生活方式、代謝相關(guān)指標(biāo)或血清參數(shù)與NAFLD發(fā)病風(fēng)險的潛在關(guān)聯(lián)。基于以上相關(guān)研究，筆者認(rèn)為，在解釋MR結(jié)果時尚需考慮其局限性，如連鎖不平衡（LD）、樣本重疊、弱IV偏倚的存在、統(tǒng)計能力不足以及難以通過結(jié)果解釋潛在作用機(jī)制等，以最大限度地減少研究結(jié)果因水平多效性而可能產(chǎn)生的偏倚。

2.3 探索社會經(jīng)濟(jì)因素及社會環(huán)境與疾病的關(guān)聯(lián) 目前，探索社會經(jīng)濟(jì)因素及社會環(huán)境與疾病相關(guān)聯(lián)的研究相對有限。Kong等［44］旨在探索低出生體質(zhì)量與NAFLD的因果關(guān)聯(lián)，并確定潛在的代謝介質(zhì)及其與該關(guān)聯(lián)的中介作用。該研究顯示出生體質(zhì)量每降低1個標(biāo)準(zhǔn)差，未來NAFLD的風(fēng)險增加45%，并且在調(diào)整兒童肥胖、成年人肥胖特征以后，這種關(guān)聯(lián)仍然存在。同時，通過兩步MR法確定了其中潛在的中介變量，包括空腹胰島素、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸和單不飽和脂肪酸等，而空腹血糖、糖化血紅蛋白、高密度脂蛋白等被證明不在其中發(fā)揮中介作用。此外，抑郁癥與胃腸道疾病之間關(guān)聯(lián)的因果關(guān)系尚未確定，有研究者通過MR分析，系統(tǒng)地探索了抑郁癥與包括NAFLD在內(nèi)的24種胃腸道疾病的關(guān)聯(lián)。該研究在全基因組顯著性水平上選擇與抑郁癥相關(guān)的獨(dú)立遺傳變異作為IV，同時采用多變量MR分析探討體質(zhì)量指數(shù)（BMI）、吸煙和2型糖尿病的中介作用。經(jīng)過多次測試校正后，結(jié)果顯示抑郁癥的遺傳易感性與NAFLD風(fēng)險增加有關(guān)（OR=1.46，95%CI：1.15～1.85，P=0.002），且二者之間的關(guān)聯(lián)在很大程度上由BMI介導(dǎo)［45］。過去的觀察性研究中一直將高等教育等社會經(jīng)濟(jì)因素與疾病風(fēng)險的降低聯(lián)系起來，如冠心病［46］、COVID-19［47］等。因此，從社會經(jīng)濟(jì)角度評估諸如教育年限、母親在懷孕期間吸煙、兒童認(rèn)知能力、精神分裂癥等與NAFLD的關(guān)聯(lián)，對于探索NAFLD的早期干預(yù)具有重要意義。

此外，除上述MR在NAFLD病因探索中具有廣泛應(yīng)用外，MR也被越來越多地運(yùn)用于尋找NAFLD治療的新藥物作用靶點(diǎn)。如觀察性研究發(fā)現(xiàn)，血脂異常是NAFLD的危險因素，他汀可能會降低NAFLD的發(fā)生風(fēng)險。吳永健團(tuán)隊的一項MR研究［48］結(jié)果顯示，他汀、貝特類藥物、依折麥布、PCSK9抑制劑、膽汁酸螯合劑、血管生成素樣3（ANGPTL3）抑制劑、靶向載脂蛋白C-Ⅲ（APOC3）mRNA的反義寡核苷酸等降脂藥物均無助于降低脂肪肝風(fēng)險。同時，各血脂指標(biāo)對NAFLD風(fēng)險均無明顯影響，且在9個降脂藥物靶點(diǎn)（HMGCR、NPC1L1、PCSK9、ABCG5/ABCG8、APOB、LDLR、ANGPTL3、APOC3、LPL）中，脂蛋白脂肪酶（LPL）是唯一可顯著降低NAFLD風(fēng)險的藥物靶點(diǎn)。LPL在NAFLD中的作用機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)胰島素水平而非通過降脂發(fā)揮作用。因此，筆者認(rèn)為，MR作為藥物靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)的一個有效工具，涉及受體、酶、離子通道、轉(zhuǎn)運(yùn)體、免疫系統(tǒng)、基因等，將其越來越多地運(yùn)用于NAFLD相關(guān)藥物的探索中，對于識別和篩選NAFLD潛在的藥物靶點(diǎn)、致病因子和生物標(biāo)志物具有重要的臨床意義。

3 小結(jié)與展望

MR遵循“親代等位基因隨機(jī)分配給子代”的遺傳定律，推斷暴露與結(jié)局是否存在因果關(guān)聯(lián)，能有效避免遺傳變異受到后天混雜因素的影響，為流行病學(xué)研究中因果關(guān)聯(lián)的推斷提供了新的視角。此外，筆者認(rèn)為MR研究通過構(gòu)建“遺傳變異-風(fēng)險因素-疾病結(jié)局”的模型，探索各種因素如疾病、環(huán)境、社會、行為、心理等與疾病之間潛在因果關(guān)聯(lián)等設(shè)想與中醫(yī)整體和辯證論治觀念不謀而合，對于某一危險因素與疾病間存在相關(guān)性但先后順序不明的情況，可將中醫(yī)臨床與雙向MR研究進(jìn)行結(jié)合，從而檢驗兩者間的因果效應(yīng)及效應(yīng)的方向。然而，MR研究應(yīng)用于中醫(yī)藥領(lǐng)域面臨諸多挑戰(zhàn)，如中醫(yī)藥相關(guān)的GWAS可用數(shù)據(jù)庫相對局限，且暫無傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)診斷及證型分類數(shù)據(jù)。因此，MR在中醫(yī)藥領(lǐng)域的研究將處于長期探索階段。

隨著GWAS數(shù)據(jù)生成成本的降低以及MR模型應(yīng)用規(guī)范的制訂，MR將進(jìn)一步豐富NAFLD疾病關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，成為研究NAFLD等疾病中因果關(guān)系的有力工具之一，越來越多地被用于探索該病的危險因素、中間機(jī)制和與其他復(fù)雜疾病間的雙向因果關(guān)系，這些研究將更兼顧科學(xué)性與可行性的統(tǒng)一，有望成為因果證據(jù)鏈中連接傳統(tǒng)觀察性研究和RCT的重要紐帶。未來研究者應(yīng)當(dāng)注意避免該研究方法本身存在的局限性，遵循相關(guān)指南和共識規(guī)范，發(fā)現(xiàn)更多與NAFLD發(fā)病風(fēng)險相關(guān)的遺傳變異，為干預(yù)和治療NAFLD提供可靠的指導(dǎo)性意見，從而更好地為臨床服務(wù)。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：郭紫薇參與選題，撰寫論文；武慶娟參與檢索文獻(xiàn)，數(shù)據(jù)提取，修改論文；葉永安、陳蘭羽、呂文良負(fù)責(zé)擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。