肌層浸潤性膀胱癌分子分型研究進展

孫楊 馬強 鄭克文 魏義舉 居紅格

膀胱癌是泌尿生殖系統常見的惡性腫瘤。據統計，2020 年全球新增膀胱癌近60 萬例，膀胱癌死亡超21 萬例[1]。根據2022 年國家癌癥中心最新數據統計，2016 年我國膀胱癌年新增8.23 萬例，死亡3.37 萬例[2]。目前關于膀胱癌的致病原因尚未明確，可能與長期吸煙、工業染料接觸有關，同時與年齡、性別及家族史也有一定的關系[3]。在膀胱癌患者中，約75%在初診時為非肌層浸潤性膀胱癌（non-muscle invasive bladder cancer，NMIBC）[4]，且超過50%的NMIBC 術后2 年內復發。肌層浸潤性膀胱癌（muscle invasive bladder cancer，MIBC）具有進展快、易復發、預后差的特點[5-6]，約占膀胱癌的15%～20%。目前對于MIBC 的標準療法是新輔助化療（neoadjuvant chemotherapy，NAC）后行膀胱根治性切除術[7]，與單獨行根治性膀胱切除術相比，NAC 聯合根治性膀胱切除術后患者5 年生存率提高5%～8%[8]。同一種病理類型、分級、分期的膀胱癌患者對化療藥物的敏感性亦有差異，因此相同治療方式可能產生不同的治療效果[9]，這種膀胱癌的生物異質性給治療帶來了很大的困難和挑戰。在臨床上，因年齡、腎功能不全及心理因素等導致無法行NAC 的MIBC 患者高達50%[8]，而自2016 年獲批的免疫檢查點抑制劑為這些患者提供了新的輔助治療思路，且其不良反應發生率較全身化療明顯降低。近年來，隨著基因組學和高通量測序技術的發展，人們對MIBC 分子分型有了初步的認識，這將有助于更好地理解膀胱癌的發病機制，尋找對治療和預后有潛在價值的生物標志物，以進一步指導臨床治療。因此，本文從MIBC 分子特征及7 種分子分型展開，對MIBC 分子分型研究進展作一綜述。

1 MIBC 分子特征

分子遺傳學證據表明，膀胱癌發生的2 條不同致病途徑對應于2 種不同生物學及臨床表型[10]；但在這2條不同致病途徑中都會發生且發生最早的基因變化是9 號染色體缺失，它是導致尿路上皮細胞異常增殖并向尿路上皮癌進展的關鍵因素，常見于9q34.1 至9p12 雜合性缺失。由于該區域存在著某些腫瘤抑制基因，缺失后會導致細胞過度增殖。NMIBC 通常由尿路上皮過度增生發展而來，受到多條通路及多個基因的影響，如成纖維細胞生長因子受體3（fibroblast growth factor receptor 3，FGFR3）/RAS 通路、磷脂酰肌醇3 激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（AKT）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）通路的改變。RAS 可通過自身突變激活下游的絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK），也可被上游的FGFR3 激活[11]，誘導腫瘤細胞過度增殖。FGFR3 可以激活PI3KAKT-mTOR 通路，從而促進膀胱癌的發生、發展。腫瘤蛋白53（tumor protein 53，TP53）/視網膜母細胞瘤基因1（retinoblastomal 1，RB1）通路的改變以及其下游基因p14、p16、p21、p27、細胞周期蛋白（cyclin，CCN）D1、CCND3 的突變可使尿路上皮異型增生進展為原位癌甚至MIBC。MIBC 遺傳改變主要涉及各種腫瘤抑制基因，這些基因編碼調控細胞周期和凋亡途徑的蛋白，包括TP53、細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑（cyclin dependent kinase inhibitor，CDKN）2A、RB1、染色體10上缺失的磷酸酶及張力蛋白同源物（phosphate and tension homology deleted on chromosome ten，PTEN）、CCND1、CDKN1B 等。p53 蛋白可以通過其下游的RB蛋白來調節細胞周期，RB 基因通過結合E2F 導致基因突變失活，影響細胞周期G1/S 期，從而抑制細胞周期進展，進而抑制膀胱癌的發生、發展[12-14]。p53、RB 基因突變后，MDM2（p53 抑制因子）、CCND1、CCNE1 基因被活化，進而發生擴增或過表達并抑制CDKN2A，導致p53 蛋白活性完全喪失，上述這些基因改變導致MIBC具有較高的增殖活性。

2 MIBC 分子分型

美國國家癌癥研究所于1999 年首次提出癌癥分子分型的概念，旨在通過基因分析技術將傳統的腫瘤形態學分型轉變為以分子生物學特征為基礎的分子分型，從而為腫瘤的精準診療提供依據。目前常用的MIBC 分子分型方法有以下7 種，主要包括UNC 分型、MDA 分型、癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）分型、Lund 分型、Bold 分型、基于NAC 反應的分子分型、基于共識的MIBC 分子分型。

2.1 UNC 分型 2014 年Damrauer 等[15]通過對262 例MIBC 患者的基因表達進行共識聚類分析，提出了2 個亞型：管腔型和基底型。管腔型高表達尿路上皮傘細胞的標志物低分子量角蛋白（keratins，KRT）20 以及尿路上皮特異蛋白UPK1B、UPK2 和UPK3A，患者預后較好。基底型尿路上皮基底細胞中高表達高分子量KRT14、KRT5、KRT6B 以及CD44，患者預后較差。基底型腫瘤常有RB1 通路的基因發生改變，如RB1 突變或缺失，還有CCND1、CCNE1、E2F 轉錄因子3（E2F transcription factor 3，E2F3）等?；仔湍[瘤中有1 個特殊類型，即Claudin-low 亞型，此亞型高表達上皮-間充質轉化（epithelial to mesenchymal，EMT）標志物和干細胞標記基因，但低表達緊密連接蛋白。

2.2 MDA 分型 2014 年Choi 等[16]通過對73 例MIBC患者的mRNA 進行分析，提出了3 個亞型：基底型、管腔型、p53 型?；仔透弑磉_KRT5、KRT6、KRT14，并存在CD44、CDH3、p63 高表達；且其具有肉瘤樣特征，易發生轉移，患者總體生存期較短，預后較差。管腔型高表達KRT20 以及尿路上皮細胞分化相關標志物，過氧化物酶體增殖因子激活受體（peroxisome proliferator activated receptor，PPAR）相關通路活性很強，高表達過氧化物酶體增生激活受體γ（peroxisome proliferative activated receptor gamma，PPARG）及FABP4 基因。此外，轉錄因子叉頭框家族蛋白A1（forkhead box protein Al，FOXA1）、谷氨?；?tRNA 酰胺轉移酶連接蛋白3（glutamyl-tRNA amidotransferase binding protein 3，GATA3）、UPK、FGFR3、erb-b2 受體酪氨酸激酶（erbb2 receptor tyrosine kinase，ERBB）2 和ERBB3 基因激活突變也很常見，故針對ER、PPARG、FGFR3 靶向藥物的治療可能在這一型中起作用。由于許多管腔型腫瘤對NAC 有反應，靶向治療應與常規化療結合應用，以獲得最大療效。p53 型和管腔型腫瘤mRNA 表達譜類似，均表達管腔樣標志物，但在p53 型中，野生型p53基因顯著激活。

2.3 TCGA 分型 2014 年TCGA 研究團隊基于131 例患者的RNA、DNA 和蛋白質表達譜進行數據分析，提出了4 個分子分型：ClusterⅠ型、Cluster Ⅱ型、Cluster Ⅲ型、Cluster Ⅳ型[17]。隨后，Aine 等[18]研究發現不同分子分型方法之間存在一定的對應規律，其中Cluster Ⅰ型對應MDA 分型的管腔型，Cluster Ⅱ型對應MDA 分型的p53 型，Cluster Ⅲ型和ClusterⅣ型對應UNC 分型的基底型。ClusterⅠ型腫瘤具有FGFR3 基因高突變率，病理類型上大部分為乳頭狀癌，預后較好。ClusterⅡ型腫瘤對程序性死亡配體1（programmed death-ligand 1，PDL1）抑制劑高度敏感，而對NAC 敏感性較差。Cluster Ⅲ型高表達細胞角蛋白KRT5、KRT14，這2 種角蛋白為標記干細胞的蛋白，此型具有鱗狀分化和干細胞表達特征，預后較差。Cluster Ⅳ型則以EMT 為特征，表達波形蛋白和N-鈣黏蛋白，并表現出黏附基因CDH1、claudin等缺失，以及EMT轉錄因子SNAI2過表達。

2017 年Robertson 等[19]對412 例MIBC 患者的基因表達數據進行分析，將MIBC 分成5 個分子亞型：單純管腔型、管腔乳頭型、管腔浸潤型、基底鱗狀細胞癌型和神經元型。單純管腔型高表達UPK1A、UPK2、CK20和SNX31。管腔乳頭型基因改變包括FGFR3 基因高突變率、轉錄相關酸性卷曲蛋白3（transforming acidic coiledcoil containing protein 3，TACC3）融合和（或）擴增、低甲基化水平。管腔浸潤型腫瘤高表達平滑肌和肌纖維母細胞基因，并表達免疫標記基因程序性細胞死亡蛋白1（programmed death-1，PD-1）和PD-L1。Rosenberg 等[20]認為抗PD-L1 治療對管腔浸潤型腫瘤最有效?；作[狀細胞癌型高表達CD44、CK5、CK6A和鱗狀分化標記基因，也有免疫標記基因高表達。神經元型高表達神經分化和發育標記基因PLEKHG4B、SOX2、MSI1 和GNG4 等，也存在p53 通路的基因改變，是各亞型中預后最差的一種。

2.4 Lund 分型 2010 年Lindgren 等[21]對144 例膀胱癌數據進行全基因組陣列比較基因雜交和基因表達分析，確定了2 個分子亞型：MS1 型和MS2 型。MS1 型常見FGFR3 和磷脂酰肌醇3-激酶催化亞基α（phosphoinositide 3 kinase catalytic alpha polypeptide，PIK3CA）基因的突變；MS2 型表現出顯著的基因組不穩定性，常見RB1 缺失、E2F3 擴增及TP53/MDM2 改變。大多數MIBC 為MS2 型，而NMIBC 為MS1 型。

2012 年來自Lund 大學的Sjodahl 等[22]收集了308份膀胱癌樣本的轉錄組數據，提出了5 個分子亞型：Urobasal A 型、Urobasal B 型、基因不穩定型、鱗狀細胞癌型、浸潤型。Urobasal A型過表達FGFR3、TP63、CK5，與早期細胞周期相關基因（CCND1）和細胞黏附相關基因的表達也升高，此型常見于淺表性癌?；蚪M不穩定型有TP53 突變、ERBB2 表達以及PTEN、CK 低表達，與免疫標記和晚期細胞周期相關基因（CCNA、CCNB、CCNE）的表達升高。Urobasal B 型、鱗狀細胞癌型、浸潤型均高表達免疫標記基因；Urobasal B 型有TP53 突變，同時存在Urobasal A 型亞型的基因突變；鱗狀細胞癌型高表達基底型角蛋白CK5、CK6 和CK14等。2017 年Lund 大學研究團隊進一步采取免疫組織化學方法分析了307 例MIBC 組織標本，使用28 種蛋白的抗體和基因表達進行分析并將MIBC 分為以下5個分子亞型：尿路上皮型、基因不穩定型、基底鱗狀細胞癌型、間充質型、小細胞/神經內分泌型[23]。

2.5 Bold 分型 2019 年Tan 等[24]分析了來自TGGA、UROMOL、IMvigor 210 發表研究的2 411 例膀胱癌基因表達數據，把膀胱癌重新劃分為6 個分子亞型：管腔型、乳頭型、神經元型、HER2 型、鱗狀細胞癌型、間充質型。管腔型具有更強的MAPK 信號轉導，KRAS 和KMT2 C/D 基因突變也較多，其主要為NMIBC，預后較好。乳頭型高表達尿路上皮分化基因以及FGFR3 突變、擴增和FGFR3-TACC3 融合，其主要為NMIBC。神經元型腫瘤的特點是高表達WNT/β-catenin 信號，主要為MIBC。HER2 型腫瘤在NMIBC 與MIBC 中所占比例較為均衡，以ERBB2 高擴增和信號轉導為特點。鱗狀細胞癌型表達鱗狀上皮分化基因，還高表達PD-1、細胞毒性T 淋巴細胞相關蛋白4（cytotoxicT-lymphocyte-associatedprotein 4，CTLA4）信號以及存在相關免疫通路的激活，此型預后最差，在晚期和高級別腫瘤中豐富，易發生淋巴結轉移。間充質型主要為MIBC，高表達AXL 信號。神經元型、間充質型和鱗狀細胞癌型中PD1 和CTLA4 高表達，提示它們可能是免疫檢查點的潛在治療靶點。

2.6 基于NAC 反應的分子分型

2.6.1 GSC 2017 分型 Seiler 等[25]對343 例MIBC 患者的基因表達數據進行分析，根據已公開發表的4 種分子分型方法（UNC 分型、MDA 分型、TCGA 分型、Lund分型）建立1 個單樣本基因組亞型分類器GSC，并研究其對NAC 的反應性，同時與未經NAC 的患者進行比較，最終根據對NAC 的反應性將MIBC 分為4 個亞型：claudin-low 型、基底型、管腔型、管腔浸潤型。管腔型患者的預后最好，NAC 的使用與否影響不大。管腔浸潤型腫瘤患者的病理分期和預后明顯差于管腔型腫瘤患者，無論有無NAC，預后較差。claudin-low 型腫瘤患者從NAC 中獲益很少或根本沒有，其預后最差。NAC 對基底型腫瘤患者具有巨大的益處，使用NAC 后患者預后得到明顯改善。

2.6.2 Seiler 2018 分型 腫瘤的生物學行為和臨床特點會受到NAC 的影響，NAC 可能誘導亞型轉換，導致腫瘤分子分型在NAC 前、后出現不一致。Seiler 等[26]利用轉錄組全基因表達檢測和免疫組織化學方法對133例NAC 前、后的MIBC 組織樣本進行研究，將NAC 耐藥患者分為4 個主要分子亞型：CC1-基底型、CC2-管腔型、CC3-免疫型、CC4-瘢痕型。CC1-基底型和CC2-管腔型的表型不受NAC 影響，無論是否使用NAC 都分別表現為基底和管腔表型，表達其對應相關標志物。CC3-免疫型和CC4-瘢痕型在NAC 后，缺乏基底樣和管腔樣標志物的表達。CC4-瘢痕型在4 個亞型中免疫活性最高[27]，趨化因子、細胞因子、免疫相關基因的表達均較高。CC4-瘢痕型高度表達纖維化和ECM 標志物，與導致瘢痕形成的傷口愈合反應一致。

2.7 基于共識的MIBC 分子分型 2020 年Kamoun等[28]使用來自18 個數據集的1 750 個MIBC 轉錄圖譜進行數據分析，得出一個共識分類，定義了以下6 個亞型：管腔乳頭型、管腔不穩定型、管腔非特異型、基底/鱗狀型、神經內分泌型、富基質型。管腔乳頭型高表達FGFR3、賴氨酸去甲基化酶6A（lysine demethylase 6A，KDM6A）基因，也存在CDKN2A 的丟失[29]。管腔非特異型腫瘤主要表現為E74 樣因子3（E74 like ETS transcription factor 3，ELF3）和PPARG 的突變，存在間質浸潤的特征表達，高表達纖維母細胞標志物，同時有T 細胞和B 細胞免疫浸潤。管腔不穩定型腫瘤具有更頻繁的PPARG 改變和含有E2F3 和S0X 4 的6p22.3區域的高水平擴增。與其他管腔類型不同，管腔不穩定型腫瘤與TP53 和切除修復交叉互補基因（excision repair crosscomplementing rodent repair deficiency gene 2，ERCC2）突變相關，此型是6 個亞型中基因組改變最多的類別，具有較高的細胞周期活性表達?；?鱗狀亞型腫瘤主要是TP53 和RB1 突變，也與3p14.2 基因組缺失密切相關，其伴有STAT3、HIF1A、EGFR 調節因子活性增強，并富于細胞毒性及自然殺傷淋巴細胞群。富基質型腫瘤主要特征為平滑肌、內皮細胞、成纖維細胞和肌成纖維細胞基因過表達，并伴有T 細胞和B細胞免疫浸潤。神經內分泌亞型腫瘤主要為TP53 和RB1 基因同時突變或缺失，高度表達神經內分泌相關標志物，對NAC 治療敏感[30]。

3 小結與展望

綜上所述，MIBC 主要分為管腔型、基底型、神經元型。其中管腔型根據病理特點、分子表現的不同又分為單純管腔型、管腔乳頭型、管腔浸潤型；基底型中有一類伴鱗狀上皮細胞分化的腫瘤較為特殊，稱為基底鱗狀細胞癌型。管腔型高表達尿路上皮分化標記相關基因Uroplakins 和FOXA1，此型預后較好。許多管腔型腫瘤對NAC 有反應，但敏感性較低，管腔型主要表現為FGFR3 基因突變，故聯合應用FGFR3 靶向藥物和常規化療可以獲得最大療效?；仔湍[瘤高表達尿路上皮基底細胞標志物KRT5、KRT6、KRT14 以及CD44?；仔湍[瘤患者NAC 后預后得到明顯改善，但在單純外科手術治療時預后較差，因此對于基底型腫瘤患者應該優先接受NAC。神經元型高表達與神經內分泌標記相關基因，以高增殖性為特點，此型預后最差，對NAC 治療敏感，該亞型腫瘤建議聯合應用依托泊苷和順鉑治療。

隨著單細胞高通量測序技術、質譜檢測、免疫分析和其他技術的迅速發展，MIBC 分子分型標準也在不斷完善，但仍存在一定的局限性。目前，腫瘤分子分型以基因組和轉錄組的研究為主，但蛋白質組學和腫瘤的免疫狀態也與腫瘤進展密切相關。因此，有關腫瘤分子分型的研究應考慮納入更多組學，以期得到更加精確可靠的分子分型標準。在未來，這些分子分型標準將是對傳統病理學分類的一種有力補充。