化瘀祛斑膠囊60Co-γ 射線輻照滅菌劑量的探究

★ 劉峰 王前 吳建雄 薛陽 何樞衡 （合肥億帆生物制藥有限公司 合肥 231201）

化瘀祛斑膠囊為《中國藥典》記載的中藥品種，功能主治為疏風清熱、活血化瘀。處方由柴胡、薄荷、黃芩、紅花、當歸、赤芍組成，用于黃褐斑、酒渣、粉刺的治療。其中柴胡、薄荷、當歸為生粉入藥，成品制備工序較多，工藝繁瑣。生產過程微生物滋生問題突出，因此需對成品進行滅菌［1］。藥品常用滅菌方式有濕熱滅菌、干熱滅菌、過濾滅菌、60Co-γ 射線輻照滅菌等［2］。由于柴胡、當歸、薄荷中含有大量揮發性藥效成分，不適宜加熱滅菌。60Co-γ 射線輻照滅菌具有無需加熱、穿透力強、滅菌效果好等優勢［3］。但輻照滅菌可能會對產品的穩定性和物質基礎產生影響［4-5］。故本研究建立化瘀祛斑膠囊特征圖譜，采用特征峰數量、相對保留時間和特征圖譜相似度對不同60Co-γ 射線輻照量劑量（0、3、6、9 kGy）滅菌的化瘀祛斑膠囊進行對比，結合微生物限度檢查和黃芩苷含量測定綜合分析，確定化瘀祛斑膠囊60Co-γ 射線的輻照劑量。

1 儀器設備與試劑試藥

1.1 儀器設備

Agilent 1260 高效液相色譜儀（安捷倫公司）；KQ-250DB 型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；ME204 電子分析天平（梅特勒托利多公司）；MS105DU 電子分析天平（梅特勒托利多公司）；BFT-IV 型輻照設備（北京比尼公司）。

1.2 試劑試藥

羥基紅花黃色素A（批號111637-202111，純度96.8%）、沒食子酸（批號110831-201906，純度91.5%）、芍藥苷（ 批號110736-202145，純度94.6%）、阿魏酸（ 批號110773-201915，純度99.4%）、迷迭香酸（批號111871-202007，純度98.1%）、黃芩苷（ 批號110715-202223，純度97.2%）、漢黃芩苷（批號112002-201702，純度98.5%）、黃芩素（批號111595-201607，純度98.5%）、漢黃芩素（批號111514-201706，純度100%），均購自中國食品藥品檢定研究院。乙腈（HPLC，TEDIA 公司）；無水甲醇（分析純，國藥集團股份有限公司）；磷酸（HPLC，阿拉丁公司）；純化水（娃哈哈集團有限公司）。化瘀祛斑膠囊（批號210801、211201、211202、211203、220201、220202、220901、220902、230201、230202，天長億帆制藥有限公司）。

2 方法與結果

2.1 滅菌方法

將化瘀祛斑膠囊成品包裝成箱，每箱120 盒，平放于輻照箱內。采用BFT-IV 型輻照裝置對化瘀祛斑膠囊進行60Co-γ 射線輻照滅菌，滅菌劑量分別為3、6、9 kGy。未滅菌和低中高輻照劑量（3、6、9 kGy）滅菌后的化瘀祛斑膠囊批號分別為：230513-01、230513-02、230513-03、230513-04。

2.2 輻照滅菌樣品微生物限度檢查

按照《中國藥典》2020 年版四部通則1105（微生物計數法）和通則1106（控制菌檢查法）檢查樣品微生物。按照通則1107（非無菌藥品微生物限度標準），非無菌固體制劑細菌總數應<103個、霉菌和酵母菌總數應<102個、不得檢出大腸埃希菌（1 g）。上述4 批微生物限度檢查結果見表1。結果，未滅菌的化瘀祛斑膠囊微生物超限度，低、中、高輻照劑量滅菌后的化瘀祛斑膠囊微生物限度檢查均合格。

表1 不同輻照劑量滅菌的化瘀祛斑膠囊微生物限度檢查結果

2.3 輻照滅菌樣品黃芩苷含量測定

按照《中國藥典》2020 年版一部化瘀祛斑膠囊的黃芩含量測定項對不同輻照劑量滅菌后的化瘀祛斑膠囊進行黃芩苷含量測定。結果，未滅菌的化瘀祛斑膠囊和低、中、高輻照劑量滅菌后的化瘀祛斑膠囊黃芩苷含量基本一致。見表2。

表2 不同輻照劑量滅菌的化瘀祛斑膠囊黃芩苷含量測定結果

2.4 特征圖譜研究

2.4.1 色譜條件 色譜柱：Welch Xtimate C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈（A）-0.05%磷酸水溶液（B）梯度洗脫，洗脫程序為0～2 min:2%（A），2～5 min:2%→15%（A），5～10 min:15%→19%（A），10～20 min:19%（A），20～25 min:19% →24%（A），25～35 min:24%（A），35～40 min:24% →27%（A），40～50 min:27%→45%（A），50～60 min:45%→60%（A），60～65 min:60% →65%（A），65～65.1 min:65%→90%（A），65.1～75 min：90%→90%（A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長為240 nm；柱溫：35 ℃；進樣量：10 μL。

2.4.2 對照品溶液的制備 分別取羥基紅花黃色素A、沒食子酸、芍藥苷、阿魏酸、迷迭香酸、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素對照品適量，加甲醇制成每1 mL 約含50 μg 的混合對照品溶液。

2.4.3 供試品溶液的制備 取化瘀祛斑膠囊樣品約0.5 g，精密稱定，精密加入70%甲醇25 mL，超聲處理（300 W，40 kHz）30 min，放冷，濾過，取續濾液，即得。

2.4.4 特征圖譜方法學考察

2.4.4.1 精密度試驗 取230202 批化瘀祛斑膠囊供試品溶液，連續進樣6 次進行測定。以黃芩苷為參照峰，計算特征圖譜中各特征峰的相對保留時間和相對峰面積。結果12 個特征峰的相對保留時間RSD<1.0%，相對峰面積RSD<2.0%，表明儀器精密度良好。

2.4.4.2 穩定性試驗 取230202 批化瘀祛斑膠囊供試品溶液，分別于0、3、6、9、12、15、18、21、24 h 進樣測定特征圖譜。以黃芩苷為參照峰，計算特征圖譜中各特征峰的相對保留時間及相對峰面積。結果12 個特征峰的相對保留時間RSD<1.0%，相對峰面積RSD<2.0%，表明供試品溶液在24 h 內穩定性良好。

2.4.4.3 重復性試驗 取230202 批化瘀祛斑膠囊6 份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，記錄色譜圖。以黃芩苷為參照峰，計算特征圖譜中各特征峰的相對保留時間及相對峰面積。結果12 個特征峰的相對保留時間RSD<1.0%，相對峰面積RSD<2.0%，表明該方法重復性良好。

2.4.4.4 對照特征圖譜的生成及特征峰指認 取10 批化瘀祛斑膠囊（批號210801、211201、211202、211203、220201、220202、220901、220902、230201、230202），按“2.4.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.4.1”項下色譜條件測定，記錄色譜圖。將10 批供試品色譜圖導入“中藥指紋圖譜相似度評價系統”（2012 版）軟件進行分析，采用Mark 峰匹配，生成化瘀祛斑膠囊對照特征圖譜。根據單位飲片制劑供試品色譜圖和對照品色譜圖，指認了13 個特征峰。10 批供試品色譜圖和對照特征圖譜見圖1、圖2。其中8 號峰黃芩苷出峰時間適中，峰面積較大，選為S 峰。

圖1 10批供試品色譜圖

圖2 化瘀祛斑膠囊對照特征圖譜及峰指認圖

2.4.4.5 輻照滅菌樣品與對照特征圖譜對比分析 取上述4 批化瘀祛斑膠囊，按“2.4.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.4.1”項下色譜條件測定，記錄色譜圖。將4 批供試品色譜圖和對照特征圖譜導入“中藥指紋圖譜相似度評價系統”（2012 版）軟件進行分析，計算相似度均大于0.99。4 批化瘀祛斑膠囊特征圖譜與對照特征圖譜的疊加圖見圖3。結果不同輻照劑量化瘀祛斑膠囊特征圖譜與對照特征圖譜的相似度、特征峰數量和特征峰相對保留時間差異均無統計學意義（P>0.05）。表明低、中、高不同劑量輻照滅菌后的化瘀祛斑膠囊與未滅菌的化瘀祛斑膠囊質量無明顯差異。

圖3 不同輻照劑量的化瘀祛斑膠囊色譜圖與對照特征圖譜的疊加圖

2.5 輻照滅菌樣品穩定性考察

將低、中、高輻照劑量滅菌的化瘀祛斑膠囊置40 ℃，75%RH 條件下放置3 個月后，按“2.4.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.4.1”項下色譜條件測定，記錄色譜圖。將試品色譜圖和對照特征圖譜導入“中藥指紋圖譜相似度評價系統”（2012 版）軟件進行分析，計算相似度均大于0.99。同時檢測穩定性樣品的黃芩苷含量和微生物限度。結果，低、中、高輻照劑量滅菌的化瘀祛斑膠囊置40 ℃，75%RH 條件下放置3 個月后，整體化學成分無明顯變化，黃芩苷含量無明顯變化，無微生物滋生。穩定性樣品黃芩苷含量測定結果和微生物限度檢查結果見表3 和表4。

表3 穩定性樣品黃芩苷含量測定結果表

表4 穩定性樣品微生物限度檢查結果表

2.6 化瘀祛斑膠囊最佳滅菌劑量確定

綜合對不同輻照劑量滅菌的化瘀祛斑膠囊的特征圖譜分析、微生物限度檢查和黃芩苷含量測定，最終確定最佳輻照劑量為6 kGy。

3 討論

化瘀祛斑膠囊是由薄荷、當歸、柴胡混合細粉與處方其他藥味的水提浸膏制得的中成藥，所含有效活性成分多樣復雜。60Co-γ 射線輻照滅菌的穿透力強，滅菌效果好，但是可能會對產品的穩定性和物質基礎產生影響。研究者采用《中國藥典》微生物檢查方法評價滅菌后樣品的微生物負載符合要求。化瘀祛斑膠囊藥品標準的黃芩苷含量測定方法僅可評價樣品中黃芩苷一項指標，無法評價60Co-γ射線輻照滅菌對化瘀祛斑膠囊整體質量的影響。研究者建立了化瘀祛斑膠囊特征圖譜，指認了13 個特征峰，13 個特征峰分別歸屬于化瘀祛斑膠囊處方藥味柴胡、薄荷、黃芩、紅花、當歸、赤芍。其中沒食子酸、羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸、迷迭香酸、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素均是重要的藥物活性成分，化瘀祛斑膠囊特征圖譜可以較全面地評價化瘀祛斑膠囊的質量。通過輻照滅菌前后化瘀祛斑膠囊特征圖譜對比，確定輻照滅菌未對化瘀祛斑膠囊的質量產生明顯影響。

根據原國家衛生部發布的《60Co 輻照中藥滅菌劑量標準》（內部試行）和國家藥品監督管理局審評中心發布的《中藥輻照滅菌技術指導原則》，中藥60Co-γ 射線輻照滅菌的劑量應不高于10 kGy。因此研究者確定化瘀祛斑膠囊60Co-γ 射線輻照較佳的劑量為6 kGy。