接種釀酒酵母強化發酵普洱茶研究

李若愚,王藤,劉琨毅,伯年國,王啟,陳秋月,趙明,3*

1(云南農業大學 食品科學技術學院 茶學院,云南 昆明,650201)

2(宜賓職業技術學院 五糧液技術與食品工程學院,四川 宜賓,644003)

3(云南農業大學,云南省藥用植物生物學重點實驗室,西南中藥材種質創新與利用國家地方聯合工程研究中心,云南 昆明,650201)

普洱茶由大葉種茶[(Camelliasinensisn.) var.assamiea(Masters) Kitmaura]為原料制成[1],曬青茶經后發酵加工,湯色濃郁,味道醇厚,陳香特色明顯[2-3]。此外,國內外的研究也發現,普洱熟茶具有保健作用或生物活性,如降脂、瘦身、抗氧化、抗菌等[4]。普洱熟茶之所以具有獨特風味與良好的保健功能,是因為其獨特的后發酵(post-fermentation)工藝。后發酵是普洱熟茶加工的關鍵工序,是其品質特征和保健功能形成的核心步驟[5],由于采用自然接種方式發酵,發酵原料、器皿、加工環境等均未進行殺菌處理,微生物可能來自毛茶、環境(水、空氣、加工車間、器皿)以及加工人員等,其現狀是參與發酵的微生物來源多樣,種類不可控。

強化發酵是將一兩種外源微生物或人工合成的微生物菌群接入到未經滅菌的原料中進行發酵,以期提高發酵產品的品質[6]。課題組前期已應用強化發酵提升普洱熟茶品質,如強化接種地衣芽孢桿菌L1發酵中茶褐素、茶紅素、可溶性糖類品質得分顯著提升,CG、EC、GCG、C等6種兒茶素含量顯著降低(P<0.05)[7];接種枝犁頭霉A1中的茶褐素、可溶性糖分含量明顯增加,而C、EC、GCG、EGCG等7種兒茶素含量顯著降低(P<0.05),增加了甜味和厚重感在茶湯中所占的分值,苦味和酸味所占的分值也有所減少[8]。這說明強化發酵是普洱茶質量和安全的提升途徑。

作為人類最早馴化的微生物,釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)在多種食品發酵中得到廣泛應用,是安全有益的微生物。釀酒酵母廣泛用于果蔬、谷物、奶制品、豆類、肉類、水產發酵[9]。普洱茶發酵過程中出現的酒釀酵母菌也被發現,謝美華等[10]已將釀酒酵母、根霉菌(Rhizopussp.)、黑曲霉(Aspergillusniger)等微生物從普洱茶渥堆發酵樣品中分離出來。張陽等[11]還發現,黑曲霉在整個發酵過程中居于主導地位,與之類似的還有釀酒酵母、光孢青霉(Penicilliumglabrum)等。優勢酵母菌由趙騰飛等[12]從普洱茶渥堆發酵樣品中分離出來的,經過純菌接種和發酵試驗表明,由純種酵母菌株發酵的茶樣,香氣甜美,口感微苦,但也有生津感,并帶有甘甜的特性。可使生茶中的多酚類物質含量有效降低,茶褐素含量增加;單治國等[13]以酵母菌為原料發酵后的普洱茶,在散發濃郁陳香的同時,口感醇厚,甘甜爽口。茶多酚、氨基酸和茶紅素的含量相對于固態發酵的綠色木霉、黑曲霉和少根根霉這3種微生物來說是最高的。釀酒酵母強化接菌發酵普洱茶研究表明釀酒酵母是一種安全的,可以用于提高普洱茶品質的微生物。但是,普洱茶發酵是一個長達1～2個月的過程,一般通過翻堆控制發酵進程,前人都是在發酵開始時(下堆階段)接入釀酒酵母,因而什么階段接入釀酒酵母發酵值得進一步研究。本文將從普洱茶中分離鑒定得到的釀酒酵母P002分不同發酵階段接種于茶葉中,接菌強化發酵普洱茶,對發酵樣品的感官特征、化學成分及微生物群落結構進行分析,以期評估該菌用于普洱茶強化接菌發酵的可行性,為提高普洱茶品質提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

普洱普山茶葉有限公司提供一芽二葉、三葉的曬青茶原料;苯丙氨酸(Phe)、丙氨酸(Ala)、脯氨酸(Pro)、賴氨酸(Lys)、亮氨酸(Leu)、異亮氨酸(Ile)、精氨酸(Arg)、半胱氨酸(Cys)、酪氨酸(Tyr)、蘇氨酸(Thr)、甲硫氨酸(Met)、甘氨酸(Gly)、谷氨酸Glu)、組氨酸(His)、絲氨酸(Ser)、天冬氨酸(Asp)、茶氨酸(Thea)、沒食子酸(GA)、表沒食子兒茶素(EGC)、表兒茶素沒食子酸酯(ECG)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、兒茶素(C)、表兒茶素(EC)、兒茶素沒食子酸酯(CG)、沒食子兒茶素沒食子酸酯(GCG)、沒食子兒茶素(GC)、咖啡堿(CA)、沒食子酸(GA)、鞣花酸(EA)、楊梅素(Myr)、木犀草素(Lut)、槲皮素(Que)、山奈酚(Kea)、茶氨酸(Thea)、茶堿(Theo)等標準品,成都曼思特生物科技有限公司;酵母菌 DNA 提取試劑盒,莊盟國際有限公司(北京);麥芽汁培養基,環凱微生物科技有限公司(廣東);DNA聚合酶(2×RapidTaqMaster Mix),諾唯贊生物科技公司(南京);DNA Ladder Marker(DNA分子質量標準試劑)、5×Loading Buffer for Agarosegels(DNA 染料),上海捷瑞生物工程公司;DNA引物,擎科生物科技有限公司(北京)。

1.2 儀器與設備

CT15RE型離心機,日立公司;LRHS-250-Ⅱ型生化培養箱,上海躍進醫療器械有限公司;SW-CJ-1B型超級工作臺,蘇州安泰空氣技術有限公司;JM-80電熱恒溫水浴鍋,上海丹陽包裝機械;CP214型電子分析天平,奧豪斯儀器(上海)有限公司;756CRT型紫外可見分光光度計,上海菁華科技儀器有限公司;1200型高速液相色譜,配TSKgel ODS-80TM色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),安捷倫公司;DW-86L626型醫用低溫保存箱,青島海爾生物醫療股份有限公司;Trident 960型基因擴增儀,力新儀器(上海)有限公司;YS6 060型色差儀,深圳市三恩時科技有限公司;XB.K.25型血球計數板,上海求精生化試劑儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 釀酒酵母P002鑒定

對菌株P002進行ITS序列DNA測序分析,根據其ITS的DNA序列進行系統發育分析,確定菌株P002的分類地位。

1.3.2 釀酒酵母P002優化發酵試驗

優化接菌階段試驗:在10 L蒸餾水中加入30 kg曬青茶,將曬青茶分為5層裝入發酵筐(50 cm×40 cm×60 cm),不同接菌階段對應不同層,每次翻堆前順次接入茶葉質量0.1%的發酵劑,以5 d為周期進行茶葉發酵,每一周期翻堆接菌并靜置發酵,為期25 d。對茶樣進行五點取樣,樣本存于-80 ℃冰箱,其中接菌樣品命名為F1～F4;將每一翻自然發酵的樣品(未接入釀酒酵母P002)命名為CK。每組樣品進行3個重復。

1.3.3 釀酒酵母P002強化發酵普洱茶放大試驗

強化發酵普洱茶試驗:稱取30 kg曬青毛茶,量取茶樣質量30%的純凈水進行潮水靜置12 h,次日適當補水,保證茶葉潮水到位。將茶葉裝入發酵筐(50 cm×40 cm×60 cm),第四翻接入茶葉質量0.1%的發酵劑,進行為期25 d的靜置發酵。對茶樣進行五點取樣,樣本存于-80 ℃冰箱,其中接菌樣品命名為S1;將未接入釀酒酵母P002自然發酵的樣品命名為CK。每組樣品進行3個重復。

1.3.4 茶葉化學成分測定及感官審評

根據GB/T 8305—2013《茶 水浸出物》測定水浸出物含量;根據GB/T 8314—2013《茶 游離氨基酸總量的測定》測定游離氨基酸含量;根據GB/T 8313—2018測定茶多酚含量;蒽酮硫酸法測定可溶性糖含量[14],茶色素含量[15],測定兒茶素組分、咖啡堿及氨基酸組分含量高效液相色譜法[16],審評茶葉樣品由5位評茶員進行,根據GB/T 23 776—2018采用定量描述分析法[17]評價茶湯特征滋味,同時對茶湯的顏色用色差儀進行測定。

1.3.5 微生物多樣性分析

采用接種發酵普洱茶樣品的真菌DNA提取試劑盒提取,聚合酶鏈式反應(PCR)應用DNA聚合酶(2×RapidTaqMaster Mix)進行。其中,以引物ITS5-1737F和ITS2-2043R擴增真菌ITS1的V2區。委托諾禾致源科技股份有限公司(北京),對PCR產物應用Illumina MiSeq測序平臺進行基因測序。對嵌合體序列等疑問序列通過QIIME軟件檢查并剔除,對獲得的序列選擇序列比對工具按97%的相似度進行聚類和OTU劃分,計算Alpha多樣性指數,評估每個樣本的多樣性水平。

1.4 數據處理

統計分析和數據處理選用IBM SPSS Statistics 22.0軟件,以平均值±標準差表示數據;主成分分析選用SIMCA 14.1軟件。

2 結果與分析

2.1 釀酒酵母P002的鑒定

麥芽汁瓊脂培養基接種菌株P002,培養期3 d后菌落呈乳白色圓形,色澤均勻,表面潤澤光滑(圖1-a);菌形卵圓形,直徑8～15 μm,出芽生殖明顯(圖1-c);ITS系統發生學分析發現,P002與Saccharomycescerevisiae(MK439 496.1)(LC413 770.1)等聚為一支(圖1-b),因此認定P002為釀酒酵母(S.cerevisiae)。

a-釀酒酵母P002的菌落形態;b-真菌ITS 核苷酸序列系統發育樹;c-顯微形態(400×,“→”表示出芽生殖)

2.2 強化發酵接菌階段優化

為了應用釀酒酵母P002發酵普洱茶,首先在第1～第4次翻堆階段時,分別接入茶葉質量0.1%的發酵劑,發酵普洱茶,得到5組發酵樣品。感官審評結果見圖2。由圖2-a可知干茶外形除CK茶樣色澤灰褐、含梗、條索較松外,其余茶樣干茶外形均為色澤烏褐、含梗、條索較松。茶湯顏色中CK、F2、F3和F4為紅褐明亮;F2的湯色為烏褐明亮。葉底均為烏褐色、有紅梗紅葉。由圖2-b得出結果,CK(63.35±0.02)和F2(63.72±1.18)的L*值較高,說明其亮度較高;F1(46.25±0.03)的a*值較高,說明其湯色更紅顏色更深;CK的b*值(91.56±0.2)較高,說明其黃色程度更高。

a-發酵樣干茶、茶湯、葉底的感官特征;b-發酵樣茶湯的顏色參數;c-發酵樣茶湯的滋味特征

對發酵茶樣的苦、澀、酸、厚、甜和香度進行評分,結果見圖2-c,F4茶樣在香氣(7.50±0.84)、甜度(6.67±0.82)和厚度(7.00±0.89)上都比CK及其他階段接菌茶樣分數高(P<0.05),說明其在品質上發生了變化導致香氣更明顯,甜度更高,更醇厚。F4茶樣酸味(1.17±0.41)分數比CK茶樣分數低,說明F4接菌導致的成分變化減弱了茶葉的酸味。F1茶樣和F2茶樣在香氣[(5.33±1.03)、(5.83±1.47)]和甜度[(5.83±0.41)、(5.67±0.52)]評分都低于CK茶樣,說明在F1和F2的茶樣香氣和甜度都不如CK茶樣,這兩翻接入酵母菌對滋味的提升作用不佳。整體而言,第4翻接入酵母菌進行強化發酵,茶味最佳,符合單治國等[13]研究得出的酒釀酵母菌發酵茶味醇厚甘爽的結論,因此,初步確定了第4翻接入酵母菌的方法。

對發酵樣品的含水量、水浸出物、可溶性糖、茶多酚、游離氨基酸及兒茶素等化學成分進行進一步測定(表1和圖3)。發酵茶樣的可溶性糖含量為4.08%～6.42%。F1、F2與CK相比可溶性糖含量顯著降低(P<0.05),推測酵母菌可能將可溶性糖當作碳源消耗[18],F4的可溶性糖含量顯著升高(P<0.05),推測在第四翻接入酵母菌會促進糖類物質的生成。F2茶樣的茶多酚含量為46.20～77.40 mg/g,加入酵母菌發酵后F1、F2和F3的茶多酚含量顯著降低。接入酵母菌樣品中,茶褐素含量均增加,其中F1和F4的茶褐素含量顯著增加(P<0.05)。推測接入酵母菌進一步促進茶褐素的生成。發酵過程中,接入釀酒酵母可以增加茶褐素含量,不接菌和接菌茶樣游離氨基酸含量變化情況也與趙騰飛等[12]研究一致,釀酒酵母可將茶多酚分解產生單糖而改變可溶性糖及茶多酚的含量[10]。

表1 茶樣化學成分含量

a-可溶性糖含量;b-茶多酚含量;c-茶色素含量

應用高效液相色譜法測定茶樣中兒茶素和氨基酸含量(圖4)。發酵茶樣的兒茶素含量為7.48～12.05 mg/g,F4的兒茶素含量顯著增加,其中,F4中GC、C、EC和CG的含量顯著高于CK(P<0.05)。茶樣的黃酮及黃酮苷類含量為0.02～0.10 mg/g,F4中花旗松素、楊梅素、木犀草素和山奈酚含量顯著增加(P<0.05)。茶樣的酚酸含量為0.31～1.36 mg/g,F4的鞣花酸含量顯著增加(P<0.05)。茶樣的生物堿含量為5.53～8.42 mg/g,F4的咖啡堿和茶堿含量顯著增加(P<0.05)。茶樣的茶氨酸含量為0.34～1.02 mg/g,F4的茶氨酸和天冬氨酸含量顯著降低(P<0.05)。推測釀酒酵母對咖啡堿的生物合成有幫助[19]。

圖4 發酵茶樣中36種茶葉特征成分含量

綜上,F4茶樣的香氣較為明顯,甜度較高,較為醇厚,同時酸味較低;可溶性糖、茶褐素、兒茶素、花旗松素、楊梅素、木犀草素、山奈酚、鞣花酸、咖啡堿和茶堿含量均有明顯提高(P<0.05)。因此,第4翻接入釀酒酵母P002的茶樣品質最佳,確定第4翻接菌的方法。

2.3 釀酒酵母P002強化發酵普洱茶

確認第4翻接入酵母的方法,并擴大進行強化接菌發酵。采用麥芽汁培養基,對發酵樣品的真菌菌落計數,研究發酵過程真菌的生長情況(圖5)。由表2可知,空白樣的真菌菌落數最少,為4.9×104CFU/g。人工接入酵母菌后S1酵母菌為7.8×105CFU/g。由此可知接入酵母菌發酵的茶樣,干燥后存在大量酵母菌,表明酵母菌可以在普洱茶的渥堆發酵過程中存活,并作用于發酵過程。

表2 茶樣酵母菌落數

圖5 菌落計數平板

測定強化發酵樣品的含水量、水浸出物、可溶性糖、茶多酚、游離氨基酸、黃酮、兒茶素及生物堿等化學成分(表3和表4)。強化發酵樣品的ECG、C、EC、花旗松素、蘆丁、咖啡堿和茶堿的含量顯著高于自然發酵茶葉(P<0.05),該結果與強化發酵接菌階段優化茶樣檢測結果一致,表明強化發酵可以提高茶葉品質,且與之前報道一致[20]。進一步證明在茶葉中接入釀酒酵母強化發酵可以提高普洱熟茶的品質。

表3 普洱茶樣品中生化成分含量

表4 普洱茶樣品中黃酮、兒茶素、生物堿、酚酸的含量 單位:mg/g

對強化接菌發酵樣進行群落結構分析。由主成分分析可知發酵樣CK與S1聚為不同兩簇(圖6-a),兩樣品中優勢菌為酵母目和散囊菌目,相對豐度分別達到了99.14%和99.53%(圖6-b)。相對于CK,釀酒酵母強化顯著改變了微生物的相對豐度,其中酵母目由CK的45.66%增加到73.31%,而散囊菌目的相對豐度由53.48%降低到26.22%。

a-真菌群落的主成分分析;b-真菌目水平群落結構

3 結論

在曬青茶中接種釀酒酵母P002,與其他階段強化接菌發酵樣相比,經第4翻強化接菌發酵后,其茶多酚、茶褐素和可溶性糖含量顯著增加(P<0.05);與傳統自然發酵相比,GC、C、EC、CG、花旗松素、楊梅素、木犀草素、山奈酚、鞣花酸、咖啡堿和茶堿的含量顯著提高(P<0.05);茶湯的香氣、甜味、厚重感數值都有所上升,酸味數值也有所下降。釀酒酵母P002強化發酵,增加了酵母目真菌的相對豐度,降低了散囊菌目的相對豐度。因此,接種釀酒酵母P002進行的強化發酵,可改變發酵微生物群落結構和茶葉特征成分含量,進而提高感官品質。