基于網絡藥理學和分子對接探討天花粉治療肺癌的作用機制

崔啟迪 孫杉杉 陸梅 黃燕瑛 呂文文

1 濱州醫學院附屬醫院腫瘤科，濱州 256603；2 濱州醫學院附屬醫院藥學部，濱州 256603

天花粉（radix trichosanthis）為葫蘆科植物栝樓Trichosanthes kirilowii Maxim. 或雙邊栝樓Trichosanthes rosthornii Harms的干燥根，味甘、微苦，性微寒，歸肺、胃經，具有清熱瀉火、生津止渴、消腫排膿的功效，可用于熱病煩渴、肺熱燥咳、內熱消渴、瘡瘍腫毒的治療［1］。研究表明，天花粉的有效成分主要包括蛋白質、淀粉、植物凝血素、多糖、皂苷等，具有抗腫瘤、引產抗孕、調節免疫、抗氧化、治療缺血性腦損傷、降血糖、抗炎、抗病毒等作用［2-3］。肺癌是最常見的惡性腫瘤，直至2020年，中國新發肺癌病例數為82萬例，死亡病例數為71 萬例，均位于中國癌癥新發病例和死亡病例首位［4］。肺癌現已成為我國發病率及病死率最高的惡性腫瘤，然而肺癌的治療仍以手術治療、放療和化療為主。肺癌發病機制復雜，傳統治療方法效果有限，不良反應明顯［4］，尋求新的治療方法迫在眉睫。中藥因其治療腫瘤的獨特優勢越來越受到重視，中醫治療肺癌的機制主要包括提高機體免疫功能、改善血流變學及微循環、抑制腫瘤新生血管形成和誘導腫瘤細胞分化和凋亡［5］。中醫運用扶正祛邪法治療肺癌1 例，腫塊消除，3 個月后隨訪，未見復發［6］。周仲瑛教授從“復法大方”辨治肺癌1例，采用復法組合，多藥雜呈，邪正兼顧，以縮小腫瘤、取得良效［7］。上述方法均取得明顯效果，然而具體的作用機制尚不明確［6-7］。

網絡藥理學是以系統生物學的理論為基礎，基于“疾病-基因-靶點-藥物”相互作用網絡，運用網絡分析來系統綜合地研究藥物對疾病網絡的干預與影響，由此展現出藥物作用的一門新興學科。網絡藥理學在方法學上的特點為集整體、動態、分析于一體，與中醫的整體觀和辨證論治的原則相一致，通過網絡藥理學的方法分析中藥及其復方的多成分、多靶點、多途徑協同作用［8］。本研究運用網絡藥理學的方法研究天花粉治療肺癌的作用機制，同時為之后的實驗以及臨床應用奠定理論基礎。

材料與方法

1.收集與篩選天花粉活性成分

檢索時限為建庫至2022年7月。在中藥系統藥理學數據庫和分析平臺（TCMSP）（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）［9］中檢索“天花粉”，獲得天花粉的化學成分，以化合物的藥動力學參數中口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18為篩選條件，篩選天花粉的有效活性成分。在中醫藥綜合數據庫（TCMID）（http：//47.100.169.139/tcmid/）［10］中檢索“TIANHUAFEN”，得到天花粉化學成分后根據Lipinski 五規則方法進行篩選，Lipinski 五規則包括相對分子量小于500、脂水分配系數（ClogP）小于5、氫鍵給體數目小于5、氫鍵受體數目小于10、化合物中可旋轉鍵的數量小于10［11-12］。查閱相關文獻［13-15］，回收具有抗癌活性但因不符合條件而被刪除的化學成分。

2.收集天花粉活性成分作用靶點

整理TCMSP 數據庫中篩選出的活性化合物作用的靶點，運用Uniprot 數據庫（https：//www.uniprot.org/）［16］將藥物的靶蛋白名稱轉換為基因名，再將TCMID 數據庫中篩選出來的活性成分所對應的靶點整理歸納。然后，利用PubChem 數據庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）［17］獲取天花粉所有活性成分的canonical SMILES 結構，將其輸入SwissTargetPrediction數據庫（http：//www.swisstargetprediction. ch/）［18］預測靶點，選取可能性（probability）＞0 并且可能性排名位于前15 的靶點。將3 種途徑獲取的靶點整合，去重。

3.收集肺癌疾病靶點

在GeneCards 數據庫（https：//www.genecards.org/）［19］、DrugBank 數據庫（https：//www.drugbank.com/）［20］、人類孟德爾遺傳綜合數據庫（OMIM）（https：//omim.org/）［21］和TTD 數據庫（http：//db.idrblab.net/ttd/）［22］中以“lung cancer”作為關鍵詞進行搜索，得到肺癌相關靶點。將以上4 個數據庫獲得的靶點歸納整理并去重。

4.構建蛋白-蛋白相互作用（PPI）網絡

利用Venny 2.1（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）［23］對肺癌疾病靶點和天花粉活性成分作用靶點取交集，獲得交集基因，并繪制韋恩圖。通過String 數據庫（https：//cn.string-db.org/）［24］，選擇Multiple Proteins 選項，Organism選擇為Homo Sapiens，獲得交集基因的蛋白互作網絡，以TSV 格式保存文件并將其導入Cytoscape 3.8.2軟件進行分析，以連接度（degree）值為依據篩選核心靶點。

5.基因本體（gene ontology，GO）和京都基因和基因組數據庫（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析

運用Metascape 數據庫（https：//metascape.org/gp/index.html）［25］對交集基因進行GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析。

6.構建“藥物-靶點-通路-疾病”與“藥物-化合物-交集靶點”網絡

運用Cytoscape 3.8.2 軟件，構建藥物-靶點-通路-疾病網絡。網絡圖中的節點分別代表藥物、化合物、靶點、通路及疾病，連線表示節點間的相互作用。

7.分子對接驗證

從PubChem 數據庫中下載關鍵小分子化合物的3D 結構，保存為SDF格式，運用Open Babel軟件轉化為pdb格式；從蛋白質結構（PDB）數據庫中下載核心靶點蛋白的3D 結構圖，利用PyMOL 軟件去水，去配體。運用AutoDock 軟件進行分子對接，并用PyMOL軟件將對接結果可視化。

結果

1.天花粉的活性成分

通過檢索TCMSP 數據庫，按照OB≥30%、DL≥0.18 條件進行篩選，得到2 種天花粉的活性成分，為菠菜甾醇（spinasterol）和仙人掌甾醇（schottenol）；查閱相關文獻發現［13-15］，葫蘆素B（cucurbitacin B）雖不符合篩選標準，但已被證實具有較好的抗腫瘤活性，因此，將該化學成分也納入其中。見表1。檢索TCMID 數據庫，根據Lipinski 五規則篩選得到活性成分25種（表2）。共計得到28種活性成分。

表1 天花粉活性成分（TCMSP數據庫）

表2 天花粉活性成分（TCMID）

2.活性成分作用靶點

通過SwissTargetPrediction數據庫和TCMSP、TCMID數據庫收集活性成分的靶點，一共獲得314個靶點，去重后為201個。

3.肺癌疾病靶點

通過檢索GeneCards 數據庫，選取score≥20 分的靶點，得到798 個疾病靶點；檢索OMIM、DrugBank 和TTD 數據庫分別獲得908、17和158個肺癌相關靶點。通過標準化并去重后共獲得肺癌相關靶點1 645個。

4.PPI網絡構建及核心靶點篩選

利用Venny 2.1 將獲得的天花粉活性成分靶點與肺癌靶點取交集并繪制韋恩圖，得到天花粉與肺癌共同靶點37 個（圖1）。將交集靶點提交至String 平臺，得到交集靶點的PPI 網絡（圖2）。將PPI 網絡導入Cytoscape 軟件進行分析，獲得靶點degree 值。degree 表示靶點連接的邊的數目，數值越大，說明該靶點在網絡中的重要性越高。分析PPI網絡中靶點degree值，計算出平均值為8.167，以degree值大于平均值為篩選條件，由此獲得關鍵靶點共13 個（表3）。這些關鍵靶點可能在天花粉治療肺癌中具有重要作用。

圖1 天花粉（radix trichosanthis）治療肺癌（lung cancer）交集靶點韋恩圖

圖2 天花粉治療肺癌交集靶點蛋白-蛋白相互作用（PPI）網絡圖

表3 天花粉治療肺癌的關鍵靶點

5.GO和KEGG富集分析

將交集基因上傳至Metascape 數據庫進行GO 功能和KEGG 通路富集分析，設置顯著性（P值）的界值為0.01，選擇生物過程（Biological Processes）、分子功能（Molecular Functions）、細胞組成（Cellular Components）、KEGG 通路（KEGG Pathway）進行富集分析。將分析結果分別保存至Excel文件中，按照P值進行排序。

GO 功能富集分析結果顯示，其主要參與的生物過程為腺體發育、細胞增殖的調控、分解代謝過程的負性調控、炎癥反應、細胞對氧化應激的反應、細胞黏附的調節、細胞對白細胞介素6 的反應、DNA 損傷刺激反應的調節、白細胞遷移的負性調控、細胞內類固醇激素受體信號通路的調控、免疫系統過程的負性調控等；主要細胞組分即靶點所在的細胞位置為細胞質核周區、線粒體膜、核膜、轉錄調節復合物、軸突、膜筏等；主要分子功能為調控血紅素結合、核受體活性、激酶結合、蛋白磷酸酶結合、激素結合、雙加氧酶活性、蛋白質N 末端結合、電子轉移活性、核受體結合、裂解酶活性、信號受體調節劑活性、肽酶活性等。見圖3。count值代表富集在該生物過程或者功能上的基因數，count 值越大，富集的基因數目越多。

圖3 天花粉治療肺癌交集靶點基因本體（GO）富集分析

KEGG通路富集分析結果顯示，天花粉治療肺癌的靶點主要涉及化學致癌受體激活、癌癥通路、缺氧誘導因子1（HIF-1）信號通路、表皮生長因子受體（EGFR）酪氨酸激酶抑制劑耐藥、癌癥中的微RNA、癌癥中的蛋白聚糖、程序性死亡受體配體1（PD-L1）在癌癥中的表達和程序性死亡受體1（PD-1）檢查點通路等信號通路，依據P值選取排名前20 位的通路繪制氣泡圖，見圖4。其中，圓點由小到大代表分值逐漸升高，靶點富集數目增多，通路顯著性增強；顏色由藍到紅代表-log10（P-value）值逐漸增大，P值逐漸減小。

圖4 天花粉治療肺癌交集靶點京都基因和基因組數據庫（KEGG）富集分析

6.“藥物-靶點-通路-疾病”與“藥物-化合物-交集靶點”網絡構建

運用Cytoscape 3.8.2 構建天花粉治療肺癌的藥物-靶點-通路-疾病網絡，藥物、靶點、通路與疾病之間的相互網絡見圖5。其中綠色方形代表天花粉，藍色圓形代表靶點，黃色菱形代表通路，紅色方形代表疾病。利用Network Analyzer 插件對該網絡進行拓撲分析，獲得節點degree 值，根據degree 值判斷節點在網絡中的重要性，結果Chemical carcinogenesis - receptor activation 通路，BCL2 靶點和Pathways in cancer 通路的degree 值最高，分別為15、14、14，說明其在該生物網絡中發揮了重要作用。

圖5 天花粉治療肺癌的藥物-靶點-通路-疾病網絡圖

運用Cytoscape 3.8.2 軟件構建天花粉的藥物-化合物-交集靶點的網絡圖，見圖6。其中紅色方形代表天花粉，藍色菱形代表化合物，橙色圓形代表靶點。對該網絡進行拓撲分析，獲得節點degree 值，發現仙人掌甾醇、菠菜甾醇的degree 值最高，為7，推測此2 種成分可能為天花粉治療肺癌的關鍵小分子化合物。

圖6 天花粉藥物-化合物-交集靶點網絡圖

7.分子對接

將活性成分菠菜甾醇和仙人掌甾醇分別與核心靶點雌激素受體1（ER1）、信號轉導和轉錄激活因子3（STAT3）、孕激素受體（PGR）、CXC 趨化因子配體8（CXCL8）、多聚腺苷酸轉移酶1（PARP1）進行分子對接，AutoDock軟件對接結果見表4。通常認為，蛋白質與化合物之間的結合能數值＜0，說明二者能夠自發結合，結合能數值越低，二者的親和力越強。分子對接結果顯示，菠菜甾醇和仙人掌甾醇與蛋白的結合能均＜-7 kJ/mol，表明具有較好的結合活性。其中，2種活性成分與PARP1靶點的結合能最低，繪制對接模式圖，見圖7。

圖7 天花粉活性成分與靶點分子對接模式圖。A 為菠菜甾醇（spinasterol）與多聚腺苷酸轉移酶1（PARP1）分子對接圖；B 為仙人掌甾醇（schottenol）與PARP1分子對接圖

表4 天花粉活性成分與靶點蛋白的分子對接結果

討論

肺癌是我國最常見的惡性腫瘤，發病率和病死率均居首位。天花粉是一種常見的中草藥，應用廣泛，且具有抗腫瘤的作用。研究表明，天花粉可抑制人惡性黑色素瘤A375 細胞的增殖和遷移［26］。天花粉蛋白能在體外顯著抑制結直腸癌細胞增殖，促進凋亡［27］。天花粉多糖也可誘導人乳腺癌細胞凋亡［28］。此外，天花粉中的小分子化合物也具有抗腫瘤活性，其中鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）可顯著抑制肺巨細胞癌細胞（PG 細胞）和人早幼粒白血病細胞（HL-60）的增殖，且都是通過誘導細胞凋亡來發揮作用［29］，其中的萜類化學成分葫蘆素B 具有顯著抗腫瘤作用，其通過抑制細胞增殖、阻滯細胞周期、誘導細胞凋亡、抑制細胞遷移和侵襲、破壞細胞骨架、抗血管生成、誘導細胞衰老、改善腫瘤耐藥等而發揮作用［30］。本研究采用網絡藥理學的方法初步探討了中藥天花粉治療肺癌的作用機制。

通過構建交集靶點的蛋白互作網絡，運用Cytoscape 3.8.2 軟件進行拓撲分析發現ER1、STAT3、EGFR等為天花粉治療肺癌的核心靶點。ER1 基因編碼ERα，也稱為NR3A1，是雌激素受體的2 種主要類型之一，ER 是由性激素雌激素激活的核受體。非小細胞肺癌細胞在細胞核和核外部位同時表達ERα 和ERβ，并且阻斷其中任何一個都會導致細胞增殖顯著減少［31-32］。STAT3 是一種原癌基因，是信號傳導途徑中重要的核轉錄因子，STAT3 與惡性腫瘤的發生有著密切關系。STAT3 參與了小細胞肺癌的發生發展，且STAT3可以直接激活血管內皮生長因子（VEGF）的表達［33］。STAT3 在非小細胞肺癌組織中高表達且持續激活，它的持續激活與腫瘤的增殖、分化、細胞凋亡、浸潤轉移等密切相關［34］。因此，STAT3與肺癌的發生發展密切相關，有望成為肺癌治療的有效靶點。EGFR 作為上皮生長因子（EGF）細胞增殖和信號傳導的受體，是人類表皮生長因子受體（HER）家族成員之一。EGFR在腫瘤的細胞增殖、血管生成、侵襲轉移及抑制細胞凋亡中發揮重要作用。在非小細胞肺癌中，EGFR 基因突變廣泛，與患者性別、年齡、吸煙史、病理類型等相關，且基因突變的患者靶向治療效果顯著［35］。

GO 和KEGG 富集分析結果顯示，天花粉可作用于多種生物進程，進而影響腫瘤的發生發展過程，參與肺癌的治療。PD-1/PD-L1 信號通路阻止T 細胞的增殖和擴散，導致腫瘤細胞免疫逃逸，進而促進腫瘤細胞生長［36］。HIF-1 是哺乳動物中廣泛存在的轉錄因子，在缺氧狀態下由血管生成，在肺癌中呈現高表達［37］。在低氧環境下，HIF-1α 通過磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）通路、熱休克蛋白（HSP）90通路、促分裂原活化的蛋白激酶（MAPK）通路對腫瘤細胞的血管生成、增殖、侵襲、轉移及凋亡進行調控［38］。

綜上所述，運用網絡藥理學的研究方法分析天花粉治療肺癌的有效成分及靶點，初步揭示了天花粉治療肺癌的可能作用機制，為后續研究提供了參考，但本研究仍存在許多局限性，文中數據主要是利用數據庫進行推測，其結論有待進一步實驗研究加以驗證。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻聲明崔啟迪：設計文章的思路與框架，繪制圖表，撰寫論文初稿；孫杉杉、陸梅：文獻收集、整理和提煉；黃燕瑛：論文的修訂；呂文文：論文終稿的審定，文章的質量控制及審校；崔啟迪、呂文文：對文章整體負責，監督管理