單細胞RNA測序應用于繼發性腎病的研究進展

鄒皓珍 楊佳 席哲帆 紀瑞 董華

濱州醫學院附屬醫院腎內科，濱州 256603

科學技術的迅猛發展使生物醫學研究發生了翻天覆地的改變，由以前研究的器官、組織水平轉向了解單個細胞的不同組成結構發展。腎臟是一個復雜且重要的器官，在生理穩態中發揮排泄代謝產物、維持內環境穩態及內分泌等多種重要功能。腎組織含有多種固有細胞及間質細胞，各種細胞大多具有自己獨特的轉錄特征及專屬功能［1］。因此，腎臟疾病患者經常出現嚴重的并發癥如高血壓、心腦血管疾病等，該病累及的范圍廣泛，包括腎小球疾病、腎腫瘤等。既往只能檢測多種細胞的平均變化水平，無法辨別個別細胞在疾病發生、發展過程中的具體作用。而單細胞測序技術可以從單個細胞水平精確地辨別細胞類型，了解其在疾病中的作用機制，有助于腎臟疾病的治療及預防。近年來，單細胞測序技術在糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）、狼瘡性腎炎（lupus nephritis，LN）中的研究有新進展［1］。本文闡述單細胞測序技術在常見繼發性腎病的最新應用研究。

單細胞測序技術

單細胞測序可以獲得特定微環境下的細胞測序差異來研究其功能差異。通過分析基因組、轉錄組、表觀組以及空間組等信息來定義細胞類型，深入研究細胞功能、細胞譜系、細胞遷移和轉變等，主要包括單細胞基因組測序、轉錄組測序和表觀遺傳測序，這3 種測序類型各具特點和優勢，可以從各個角度揭示細胞各個階段的功能和特點。全基因組測序是對目的細胞全部基因組序列進行非選擇性、均勻擴增，隨后利用外顯子捕獲技術進而使用高通量測序的過程［2］。轉錄組測序是一種用于檢測和定量分析信使RNA 分子的方法，其過程包括將RNA 逆轉錄為cDNA，再行高通量DNA 測序［3］。近年來，轉錄組測序通常在包含數千到數百萬個細胞的樣本上進行，主要用途是評估細胞群內的轉錄相似性和差異，揭示未被認識的異質性水平，追蹤異質但相關的細胞狀態之間的譜系和發育關系［4］。表觀遺傳學測序主要在基因調控方面起作用，表觀遺傳改變是可逆的，也可以決定基因表達并負責細胞的異質性［5-7］。單細胞測序流程包括單細胞的分離制備、遺傳物質的提取擴增及高通量測序。

在繼發性腎病中的應用

1.DN

DN 是持續高血糖引起的糖尿病微血管并發癥，以進展性的腎間質纖維化為特征，是引起終末期腎?。╡nd-stage renal disease，ESRD）的首要原因。人們利用單細胞測序技術首先從細胞層面剖析DN 的發病機制，早期研究DN 小鼠和患者腎臟之間的差異性基因表達發現特定基因、靶點及相關信號通路，促進DN 的進展；現在的研究熱點是尿液細胞表達譜、藥物作用靶點的相關機制［8］。

DN 發病機制與高血壓、高血糖、氧化應激、遺傳背景、足細胞損傷密不可分，通過單細胞測序技術可檢測與DN進展相關的基因。Wang 等［8］利用單細胞RNA 測序（single-cell RNA-sequencing，scRNA-seq）數據中鑒定出13 種細胞類型，在scRNA-seq 數據和Bulk RNA-seq 中鑒定出106 種常見差異表達基因。尿液外泌體微小RNA-451-5p［9］、3 個免疫相關基因（SLIT3、PDE1A、CFH）［10］、MRTF-SRF（在系膜細胞中激活的機械敏感信號通路）［11］可作為DN 的診斷標志物和治療靶點，而EIF4B、RICTOR、PRKCB［12］、ATF3、B2M、VCAM1、CLDN4、SPP1等［13］均可能促進DN 進展，對早期DN 小鼠巨噬細胞轉錄組譜分析發現疾病進展中的動態巨噬細胞M1 樣炎癥表型增加［14］。Fu 等［15］也強調DN 中基因表達的動態變化，以及單個細胞的可變反應。Roumeliotis 等［16］發現SPP1、TPO、TTN、SGO2 等21 個氧化應激基因參與或延緩DN 的發展。有關遺傳易感性，GREM1 變異體rs1129456［17］、NCALD 基因［18］與DN 相關；Pei 等［19］對267 例DN 患者EB-1 基因進行單核苷酸多態性基因分型，發現DN 患者和非DN 患者之間有遺傳差異；Gu等［20］發現在1型糖尿?。―M）中性別決定區Y-box 2 對DN 具有性別特異性遺傳影響。足細胞損傷在DN 中起重要作用，Zhang 等［21］研究顯示，吲哚胺2，3-雙加氧酶促進DN中煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的合成，并減輕高糖誘導的足細胞損傷。Wang 等［22］應用db/db 小鼠，將1 型DM與2 型DM 的足細胞翻譯mRNA 圖譜進行比較，發現具有差異性及相似性。翁維維等［23］的實驗提示自噬活性水平與足細胞功能有關，抑制自噬活性可使足細胞受損。

單細胞測序在尿液細胞研究中也有進展。Abedini等［24］對5 例DN 患者及10 例健康對照組的尿液樣本進行分析，將尿液細胞與人類腎臟和人類膀胱數據集進行比較發現，除了巨噬細胞、淋巴細胞和膀胱細胞外，幾乎所有的腎細胞類型如足細胞、近端小管、髓袢和集合管都可以在尿液中識別。尿液細胞與人腎細胞在基因表達上具有相似性，以后可采集患者尿液細胞而非腎活檢，這種簡單的取材方式有助于疾病的診斷，并有助于患者個性化預后［25］。

單細胞測序在治療DN 的藥物作用機制方面是一大熱點，血管緊張素受體阻滯劑和鈉-葡萄糖協同轉運蛋白2 抑制劑（sodium-dependent glucose transporters 2 inhibitor，SGLT2i）被用于治療DN，但具體作用仍不清楚［26-28］。Wu等［26］鑒定db/db 小鼠10 個不同的腎細胞簇，發現血管緊張素受體阻滯劑具有較強抗炎和抗纖維化作用，而SGLT2i 影響小管線粒體功能，血管緊張素受體阻滯劑和SGLT2i 在保護腎臟中發揮疊加效應而非協同效應。SGLT2i可誘導模擬禁食和缺氧反應，對近端小管富含絲氨酸/精氨酸的剪接因子7的剪接體選擇性剪接調節是潛在作用機制［27］。Dalb?ge等［28］在db/db-UNx-ReninAAV 小鼠中發現，司美格魯肽聯合賴諾普利可顯著降低血糖、血壓和蛋白尿，改善腎小球硬化程度、足細胞過濾縫隙密度，減少炎癥。Wang 等［29］發現二肽基肽酶Ⅳ（dipeptidyl-peptidase 4，DPP4）在DN 足細胞中表達特異性上調，與足細胞增殖有關，半邊蓮通過抑制足細胞DPP4 的活性來治療DN。以上為DN 治療提供了理論依據，期待更多有關藥物作用機制的研究。

2.LN

LN 是系統性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）的腎臟損害，是ESRD 的重要原因之一。LN 的復雜性及異質性涉及多種細胞類型以及免疫和非免疫機制，對LN患者的固有腎細胞和浸潤細胞進行單細胞測序是一種新方法，可在細胞水平上明確腎損傷途徑［30］。LN 是首個應用于單細胞測序腎活檢的疾病類型，除了腎組織，血液、尿液、皮膚也可用于LN 單細胞水平檢測發現潛在的生物標志物，對LN的發病機制及治療的研究也層出不窮［30］。

最近對SLE 血液和組織測序顯示分子異質性，并確定幾個不同的亞群是SLE 發病機制的關鍵參與者［31］。Nehar-Belaid 等［32］分析外周血單核細胞發現，SLE 患者的干擾素刺激基因（interferon stimulating gene，ISG）表達增加，富含ISG 和/或單基因狼瘡相關基因的獨特亞群的擴增與疾病活動性相關。Vanarsa 等［33］對SLE 患者尿液進行篩選，發現尿血管生成素樣蛋白4（Angptl4）、L-選擇素和轉化生長因子（TGF）-β1 為LN 疾病活動的潛在生物標志物。同樣，Arazi等［34］發現2種趨化因子受體CXCR4和CX3CR1廣泛表達，免疫細胞在尿液和腎臟中的基因表達密切相關。干擾素（interferon，IFN）-γ 誘導的趨化因子較高為增生性LN，首次應用尿液蛋白質組學結合腎活檢單細胞轉錄組發現尿液趨化因子主要由浸潤CD8+T 細胞、自然殺傷（NK）細胞和骨髓細胞產生，而尿液趨化因子數目與腎浸潤性CD8+細胞數相關［35］。早期增生性LN 患者腎小球樣本間基因表達有很大的異質性，可鑒定IFN 誘導基因特征等4 個主要簇［36］。Der 等［37］對21 個腎臟和17 個皮膚樣本進行研究發現，小管細胞和角質細胞IFN 評分之間以及小管細胞和角質細胞纖維化評分之間的相關性，并證明慢性指數、免疫球蛋白G（IgG）沉積和蛋白尿量與腎小管細胞中由IFN 誘導基因組成的基于轉錄組的評分相關［38］。以上研究表明血液、尿液、皮膚的scRNA-seq 分析可作為腎臟疾病的生物標志物，說明了scRNA-seq 的潛在用途，為LN 的發病機制提供新見解。

近來研究發現，TNFSF13B［39］、白細胞介素（IL）16［40］、可溶性CD163［41］、循環免疫復合物［42］與LN 的發病機制有關，轉化生長因子β 信號傳導參與LN 的發展［43］，microRNA-199a通過靶向Klotho調節核因子（NF）-κB的激活而參與LN發病機制［44］。通過蛋白質組學方法發現殺菌/通透性增加蛋白在T 細胞衍生的外泌體或外周血T 細胞中的過表達可能是LN 的生物標志物和致病因素［45］。IFN 信號有IFN-α、IFN-β和IFN-γ 3種反應基因，含有細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4（CTLA4）rs17268364 的狼瘡易感區通過結合EWSR1 在功能上降低CTLA4 的表達，并與IFN-α 信號相關［46］。

Zhou 等［47］研究顯示，間充質干細胞通過減少CD4+、CD8+、巨噬細胞、長壽命漿細胞、促炎中性粒細胞和樹突狀細胞對腎臟區域免疫細胞的影響來治療LN。Peng 等［48］發現一種新的DDX58致病性變體R109C可提高IFN信號傳導而致病，Janus蛋白酪氨酸激酶（JAK）抑制劑可用于LN 的治療。厚樸酚可抑制NLRP3/IL-33/ST2 軸的激活來抑制腎臟固有巨噬細胞和腎小管上皮細胞之間的異常串擾，從而對LN起到預防和治療作用［49］。

結語與展望

近幾年隨著單細胞測序技術的深入研究，scRNA-seq技術與常規組學或單細胞組學的聯合分析會成為大熱點，如結合scRNA-seq 與批量RNA 測序可以發現組織轉錄數據特異性信息，識別細胞與組織水平的共同特征；腎scRNA-seq 與尿蛋白組學聯合分析有助于挖掘疾病活動的生物特異性標志物，尋找反映腎臟復雜分子生物學活動的尿蛋白［50］。最后，還有利于生物標志物和新藥的研發，scRNA-seq 可能會取代大量基因表達實驗，包括腎臟疾病。雖然在腎臟疾病領域應用較少［51］，但是隨著單細胞測序相關方法變得更加精練、更高通量、更廉價，以及在靈敏度、準確性、成本效益、處理時間和每個細胞可評估的參數方面的改進，相信未來幾年該項技術在腎臟領域的基礎和臨床方面的研究將更加廣泛，也可能會改變對腎臟疾病分子發病機制的理解［52］。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻聲明鄒皓珍、紀瑞：起草文章，指導；楊佳：對文章的知識性內容作批評性審閱，指導，支持性貢獻；席哲帆：分析/解釋數據，起草文章，指導；董華：對文章的知識性內容作批評性審閱，獲取研究經費，行政、技術或材料支持，指導，支持性貢獻