食品微生物檢驗中大腸桿菌的快速檢測方法研究

◎ 朱炳華

（膠州市疾控中心，山東 青島 266300）

食品微生物檢驗在食品安全領域具有至關重要的作用，其中大腸桿菌的檢測頗受關注。大腸桿菌作為一種常見的食源性病原體，廣泛存在于人們的生活中，其可能導致腸胃不適，出現腹瀉等癥狀，人類健康因此受到極大影響。所以，快速精確地檢測食品中的大腸桿菌，顯得尤為重要。

傳統的食品微生物檢驗途徑主要由培養方法與免疫學手段構成，然而，這些方式耗時較長、靈敏度不足。隨著分子生物學與免疫學領域的持續突破，一些新興的靈敏度高的檢測方式被應用于食品微生物檢測領域。其中，免疫磁珠技術與PCR 技術，近年成為人們矚目的焦點，備受推崇。

免疫磁珠技術是通過磁性微球與抗體相結合，借助磁場之力，捕獲微生物，具有獨特的分辨能力和反應速度。PCR 技術通過擴增目標微生物的核酸片段，可以迅速辨識目標。將兩種技術相互融合，能最大限度地展現各自優勢，快速檢測大腸桿菌。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

免疫磁珠分離儀器；擴增基因儀器；顯微鏡；微生物之核；基因采樣器；大腸桿菌特異性引物與探針；塔克DNA 聚合酶；dNTPs[1]；10×PCR buffer。

1.2 樣品來源

本次研究共測試了50 個食品樣本，包括肉類、乳制品、蔬菜等，所有樣本都源自附近的超市與農貿市場。

1.3 實驗方法

1.3.1 免疫磁珠富集

取25 g 樣本，溶入225 mL 消毒生理鹽水中，制備成1 ∶10 的稀釋液，確保充分混合。將稀釋后的樣品液經過免疫磁珠分離柱進行處理，采用免疫磁珠分離技術，成功篩選出目標大腸桿菌。將免疫磁珠上的大腸桿菌清理干凈，進而將其收集至離心管內，備用。

1.3.2 DNA 提取與PCR 擴增

（1）借助細菌基因組DNA 提取試劑盒，成功提取大腸桿菌的基因組DNA。具體操作步驟如下：免疫磁珠上的大腸桿菌被清洗，最終匯集到離心管里，添加適量裂解液，輕輕攪拌使之均勻；蛋白酶K 與硅藻土混合均勻后移至吸附柱內，遵循試劑盒操作手冊進行后續步驟，獲取清澈的基因組DNA。

（2）采用特異性引物與探針實施PCR 擴增[2]。反應體系50 μL，內含DNA 模板、特異性引物、探針、Taq DNA 聚合酶、dNTPs 以及PCR 緩沖液。PCR 反應的過程，PCR 擴增開始于95 ℃下的5 min 預變性步驟，接著進行40 個循環，每個循環包括90 ℃下的變性步驟持續30 s，55 ℃下的退火步驟持續30 s，以及72 ℃下的延伸步驟持續30 s。最后，進行一個最終延伸步驟，在72 ℃下持續10 min。

2 結果與分析

2.1 免疫磁珠分離結果

通過免疫磁珠分離技術，本研究從50 份食品樣品中成功分離出大腸桿菌，分離率達100%，具體數據如表1、圖1 所示。

圖1 免疫磁珠分離結果折線圖

表1 免疫磁珠分離結果表

總體來說，針對各類食品樣本，免疫磁珠分離技術皆能實現100%的分離效果，為大腸桿菌的檢測賦予了極高的精確度和可信度[3]。然而，對于食品安全性的全面評估，還需依賴多種檢測手段與深入的綜合分析。

2.2 PCR 擴增結果

對大腸桿菌分離物進行PCR 擴增，擴增產物隨之呈現。PCR 產物經過2%瓊脂糖凝膠電泳進行分析，所有樣本皆呈陽性反應，確認已檢測到大腸桿菌，具體數據如表2 所示。

表2 PCR 擴增結果表

如表2 所示，PCR 擴增結果顯示，在肉類、乳制品和蔬菜這3 類樣品中，每一類的所有樣本都呈陽性反應。具體來說，肉類樣品有20 個，乳制品和蔬菜樣品各有15 個，它們的陽性率均達到了100%。這表明在所有測試的樣品中，目標DNA 都成功地被擴增出來。

陽性率的百分比，就是成功擴增的樣品在總樣品數量中所占的比重[4]。在本研究中，肉類、乳制品與蔬菜的陽性率皆達到100%，由此可見，在這3 種食物中，所有樣本皆檢出大腸桿菌，PCR 擴增過程得以順利進行。

2.3 大腸桿菌數量檢測結果

對50 份食品樣品進行大腸桿菌數量檢測，結果如表3 所示。

表3 大腸桿菌數量檢測結果表

本研究對50 份食品樣本進行了剖析，結果顯示[5]，在肉制品樣本中，大腸桿菌含量介于<10～104 CFU·mL-1區間，平均數值約為5.3×103 CFU·mL-1，說明肉類樣本里存在一定規模的大腸桿菌。乳制品樣品中大腸桿菌的數量區間為<10～9.8×103 CFU·mL-1，平均值為4.2×103 CFU·mL-1，可見，乳制品中的大腸桿菌含量相對較少。蔬菜樣本中，大腸桿菌的數量分布為<10～7.6×103 CFU·mL-1，平均值為3.4×103 CFU·mL-1。相較于肉類與乳制品，蔬菜的大腸桿菌含量相對較低，但食品安全問題仍需密切關注。

3 結語

本研究運用免疫磁珠與PCR技術相結合的方式，對食品中大腸桿菌實施了迅速檢測。經實驗證實，此法具備較高的精確性與敏感度，可以用于食品微生物檢驗中大腸桿菌的快速檢測。①免疫磁珠技術可以成功地從食品樣本中篩選出大腸桿菌，其分離效果高達100%，可提升檢測的專一性。②采用PCR技術，可以對免疫磁珠分離出的大腸桿菌進行核酸擴增。借助特異性引物與探針，可以保證擴增結果的專屬性與敏銳度。③PCR 產物經過瓊脂糖凝膠電泳分析，檢測結果顯示，所有樣本皆為陽性，進一步驗證了此方式的穩定性。④本研究進一步探討了各類樣品中大腸桿菌的數量分布特點。數據顯示，肉類與乳制品中大腸桿菌含量相對較多，蔬菜中大腸桿菌的含量相對較少，其原因與食品的加工方式和儲存環境有關。

免疫磁珠與PCR 技術相結合，具備高效、精確、靈敏度高的特點，可以為大腸桿菌的快速檢測提供有力保障。未來，結合其他新興技術，如納米科技、生物傳感器等，可以增強檢測的敏銳性與專一性。