DCLK1在胃癌干細胞中的作用及機制研究*

張 威， 王光輝， 劉輝琦， 劉永年

（青海大學醫學部，青海 西寧 810001）

胃癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，是腫瘤相關死亡的第四大原因［1］。即使在手術聯合放化療后，晚期胃癌患者的預后仍然很差［2］。靶向治療目前在提高抗腫瘤療效的特異性、顯著降低非選擇性耐藥性和毒性方面已成為研究熱點。胃癌干細胞是一類存在于胃癌中少量具有干細胞特性并能誘導分化產生腫瘤譜系異質性的腫瘤細胞［3］。研究提示，GCSCs 與胃癌的侵襲、轉移和治療耐藥特性密切相關，在胃癌的復發和轉移中發揮著關鍵性作用［4］。目前，現有的治療手段無法有效針對胃癌干細胞，是導致胃癌治療失敗、復發和轉移的主要原因［5］。因此若能靶向殺滅胃癌干細胞將有望有效治療胃癌的轉移和復發，延長患者生存期，改善預后。

雙皮質素樣激酶1（doublecortin-like kinase 1，DCLK1）最初是在神經系統中發現的一種蛋白激酶，屬于微管相關蛋白的雙皮質素家族和蛋白激酶超家族成員，具有調節微管聚合以及促進神經元遷移的功能［6］。DCLK1 在多種腫瘤中過表達，其高表達與腫瘤轉移和復發及預后差密切相關［7-8］。重要的是，DCLK1 目前被認為是胰腺癌、結腸癌及膽管癌中特異性表達的腫瘤干細胞標志物［9-11］。在小鼠中，敲除DCLK1表達可降低腸腫瘤的發生，而靶向DCLK1 的治療可以抑制小鼠體內腫瘤生長，提示DCLK1 可作為潛在的抗腫瘤靶點［12］。DCLK1也被證明是宮頸癌及結腸癌的潛在診斷和治療靶點［13-14］。然而作為一個重要的腫瘤干細胞標志物及潛在的臨床治療靶點，DCLK1 在胃癌干細胞中的潛在作用知之甚少。本研究初步證明了DCLK1 在胃癌干細胞中的潛在生物學作用及其分子機制，可為胃癌分子靶向治療的開發和應用提供新的思路。

材料和方法

1 主要試劑

DMEM 培養液、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）和磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）購自武漢普諾賽生命科技有限公司；DMEM/F-12 培養液購自HyClone；無血清添加劑B27 和0.25% EDTA 胰蛋白酶購自Gibco：表皮生長因子（epidermal growth factor， EGF）和堿性成纖維細胞生長因子（ba‐sic fibroblast growth factor， bFGF）購自PeproTech；DCLK1 抑制劑DCLK1-IN-1 購自Selleck；DCLK1、SOX2、OCT4、E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（vi‐mentin）、Snail、cyclin D1、c-MYC、ABCG2、TOP2A、mTOR、p-mTOR 和β-actin 抗體均購自Proteintech；AKT、p-AKT、PI3K 和p-PI3K 抗體購自CST；Matrigel和Transwell小室購自Corning。

2 實驗方法

2.1 細胞培養 HGC-27 胃癌細胞來自于中國醫學科學院腫瘤醫院。用含10% FBS的高糖DMEM 培養液，于37 ℃、5% CO2的培養箱中培養，常規換液傳代。之后接種入含EGF、bFGF 和B27 的DMEM/F-12的無血清培養液中懸浮培養，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養3 d，收獲胃癌Sphere細胞用于后續實驗。

2.2 總蛋白提取和Western blot 檢測 待細胞生長狀態良好且密度達到80%～90%左右時，常規處理后收集細胞。加入細胞裂解液提取細胞總蛋白，通過BCA 法測定總蛋白濃度。取蛋白樣品進行SDSPAGE，經濕轉轉至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h 后，孵育Ⅰ抗4 ℃過夜。次日用TBST 洗膜3次，每次10 min，室溫孵育Ⅱ抗1 h，TBST 洗膜后顯影，用ImageJ軟件分析結果。

2.3 CCK-8 法檢測DCLK1 對胃癌干細胞活力的影響 使用DCLK1 抑制劑DCLK1-IN-1 抑制胃癌Sphere細胞中DCLK1活性。將兩組細胞懸液以每孔2×103個接種至96 孔板，每組設置3 個平行孔，同時制備4 塊相同的96 孔板，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養；取出96 孔板，加入10%的CCK-8 試劑，用酶標儀測定450 nm 處的吸光度（A450）。以后每間隔24 h測定各孔A450值，記為相應時點的細胞活力。

2.4 CCK-8 法檢測DCLK1 對胃癌干細胞耐藥的影響 使用DCLK1抑制劑DCLK1-IN-1抑制胃癌Sphere細胞中DCLK1活性。將兩組細胞懸液以每孔5×103個接種于96 孔板中，每組設3 個平行孔，于37 ℃、5% CO2培養箱中孵育24 h；細胞貼壁后，吸棄孔內培養液，每孔加入200 μL 含0、0.062 5、0.125、0.25、0.5、1、2和4 mg/L 順鉑的完全培養液，每組細胞中每個藥物濃度設置3個平行孔，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養；3 d后，用CCK-8法檢測A450值，計算IC50值。

2.5 甲基纖維素成球實驗檢測 DCLK1 對胃癌干細胞自我更新能力的影響 使用DCLK1 抑制劑DCLK1-IN-1 抑制胃癌Sphere 細胞中DCLK1 活性。用無血清培養液重懸胃癌Sphere 細胞，以每孔5×102個接種于低黏附24孔板中，每組設3個平行孔，每孔中提前加入2 mL 含0.8%甲基纖維素的半固態無血清培養基，37 ℃、5% CO2培養箱中培養7～14 d，于倒置顯微鏡觀察各組細胞成球情況。

2.6 劃痕愈合實驗和Trasnwell 實驗檢測DCLK1 對胃癌干細胞遷移的影響 （1）劃痕愈合實驗：使用DCLK1 抑制劑DCLK1-IN-1 抑制胃癌Sphere 細胞中DCLK1 活性。將兩組細胞懸液以每孔5×105個接種在6孔板中，每組設3個平行復孔。當細胞生長匯合率達到約80%～90%時，使用移液槍頭垂直底面劃線，PBS 洗去劃下細胞，然后將細胞置于含1% FBS的完全培養液中培養。分別于劃線后0、24 和48 h觀察細胞劃痕愈合程度，即反映細胞遷移能力。（2）Transwell實驗：使用DCLK1抑制劑DCLK1-IN-1抑制胃癌Sphere 細胞中DCLK1 活性，常規處理后用無血清培養液重懸胃癌Sphere細胞。取200 μL細胞懸液接種到Transwell 小室上室，每個小室內細胞數為4×104，下室加入650 μL 含10% FBS 的完全培養液。置于37 ℃，5% CO2培養箱培養24 h 后，取出小室，棄去孔中培養液，用4%多聚甲醛固定30 min，0.1%結晶紫染色30 min，干燥后，于顯微鏡下觀察并計數。

2.7 Transwell 實驗檢測DCLK1 對胃癌干細胞侵襲的影響 使用DCLK1 抑制劑DCLK1-IN-1 抑制胃癌Sphere 細胞中DCLK1 活性，用無血清培養液重懸胃癌Sphere 細胞。Matrigel 以1∶8 稀釋并均勻鋪于Transwell 小室底部的上室面，置于37 ℃培養箱30 min。將兩組細胞懸液以每室4×104接種到小室上室，下室加入650 μL 含10% FBS 的完全培養液。置于37 ℃，5% CO2培養箱培養24 h 后，取出小室，棄去孔中培養液，用4%多聚甲醛固定30 min，0.1%結晶紫染色30 min，干燥后于顯微鏡下觀察并計數。

3 統計學處理

本實驗采用GraphPad Prism 9.1 軟件進行數據處理和統計分析。實驗數據以均數±標準差（mean±SD）表示。對照組和實驗組的比較采用獨立樣本t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 Sphere細胞的培養

經無血清培養液懸浮培養，HGC-27 胃癌親本細胞成球懸浮生長，形成Sphere細胞球，見圖1。

Figure 1. Formation of Sphere cells in serum-free culture（ ×40）.圖1 無血清培養Sphere細胞

2 DCLK1在胃癌干細胞中的表達

Western blot 結果顯示，Sphere 細胞中DCLK1 表達明顯高于HGC-27親本細胞（P<0.01），見圖2。

Figure 2. The protein expression of DCLK1 in gastric cancer stem cells. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs parent group.圖2 胃癌干細胞中DCLK1的表達

3 干性相關蛋白在胃癌干細胞中的表達

Western blot 實驗結果顯示，Sphere 細胞中干性相關蛋白SOX2和OCT4表達水平顯著高于親本細胞（P<0.01），見圖3。這表明DCLK1 可能在維持胃癌干細胞干性特征中發揮重要作用。

Figure 3. The expression of stemness-related proteins in gastric cancer stem cells. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs parent group.圖3 胃癌干細胞中干性相關蛋白的表達

4 抑制DCLK1對胃癌干細胞活力的影響

鑒于DCLK1 在胃癌干細胞中顯著高表達，我們用DCLK1 抑制劑DCLK1-IN-1 處理Sphere 細胞抑制DCLK1 活性，以探究DCLK1 對胃癌干細胞的生物學作用。CCK-8細胞活力實驗顯示，48 h后Sphere組細胞活力顯著高于DCLK1 抑制組（P<0.01），見圖4A。甲基纖維素成球實驗結果顯示，Sphere 組與DCLK1抑制組的細胞成球數分別為124.000±3.742 和79.667±2.867，DCLK1 抑制組較Sphere 組自我更新能力更低（P<0.01），見圖4B。以上研究表明，抑制DCLK1 可顯著降低胃癌干細胞活力和自我更新能力。

Figure 4. Effect of inhibiting DCLK1 on the viability and self-renewal capacity of Sphere cells. A： the cell viability was detected by CCK-8 assay； B： the self-renewal capacity of the cells was detected by methylcellulose spheroid-forming assay （×40）.Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs Sphere group.圖4 抑制DCLK1對胃癌干細胞活力的影響

5 抑制DCLK1對胃癌干細胞耐藥作用的影響

順鉑耐藥結果顯示，DCLK1 抑制組的IC50值為0.145 mg/L，Sphere 組的IC50值為0.814 mg/L，說明抑制DCLK1后胃癌干細胞耐藥性降低，見圖5。

Figure 5. Effect of inhibiting DCLK1 on drug resistance capaci‐ty of gastric cancer stem cells.圖5 抑制DCLK1對胃癌干細胞耐藥性的影響

6 抑制DCLK1 對胃癌干細胞遷移和侵襲能力的影響

強侵襲能力是胃癌干細胞區別于普通腫瘤細胞的重要特征，我們接著探究了DCLK1 在胃癌干細胞侵襲和遷移中的作用。劃痕愈合實驗表明，DCLK1抑制組細胞在24和48 h的劃痕愈合率分別為3.21%和8.23%，而Sphere 組細胞劃痕愈合率為17.33%和27.22%，DCLK1 抑制組劃痕愈合率顯著低于Sphere組（P<0.01），見圖6A。Transwell 遷移實驗表明，DCLK1抑制組穿出的細胞數（13.000±1.633）顯著少于相應的對照組（140.333±2.055），說明抑制DCLK1可顯著抑制胃癌干細胞的遷移能力（P<0.01），見圖6B。Transwell 侵襲實驗表明，DCLK1 抑制組穿出的細胞數（2.667±0.471）顯著少于Sphere 組（116.667±2.867），DCLK1 抑制組侵襲能力低于對照組，見圖6C。以上研究表明，抑制DCLK1 可顯著抑制胃癌干細胞的遷移和侵襲能力。

Figure 6. Effect of inhibiting DCLK1 on migration and invasion capacity of Sphere cells. A and B： the effect of inhibiting DCLK1 on the migration of Sphere cells was deteced by wound-healing assay and Transwell assay （×20）； C： the effect of inhibiting DCLK1 on the invasion of Sphere cells by Transwell assay（ ×20）. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs Sphere group.圖6 抑制DCLK1對胃癌干細胞遷移和侵襲能力的影響

7 DCLK1對胃癌干細胞作用機制研究

Western blot 結果顯示，抑制DCLK1 可顯著下調增殖相關蛋白cyclin D1 和c-MYC 的表達（P<0.01），見圖7A；抑制DCLK1 可顯著下調耐藥相關蛋白ABCG2 和TOP2A 的表達（P<0.01），見圖7B。上皮-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition， EMT）過程與腫瘤細胞侵襲和遷移相關，為了探究DCLK1是否在胃癌干細胞中通過EMT影響細胞的侵襲和遷移能力，我們用Western blot 檢測了EMT 相關轉錄因子。結果表明，抑制DCLK1 顯著上調了EMT 過程中上皮標志物E-cadherin蛋白的表達，而降低了間充質標志物vimentin 和Snail 的表達水平（P<0.01），見圖7C，表明DCLK1通過調控EMT 過程促進了胃癌干細胞的侵襲和遷移。上述結果表明，DCLK1 通過促進增殖、耐藥等相關基因的表達，以及改變EMT相關基因的表達，促進了胃癌干細胞相關生物學行為。

Figure 7. Expression of related mechanism proteins in DCLK1-inhibiting gastric cancer stem cells. A： the expression of proliferationrelated proteins； B： the expression of drug resistance-related proteins； C： the expression of epithelial-mesenchymal transi‐tion-related proteins. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs Sphere group.圖7 抑制DCLK1對胃癌干細胞中相關機制蛋白表達的影響

8 DCLK1 在胃癌干細胞中PI3K/AKT/mTOR 信號通路的作用機制

Western blot 實驗結果顯示，抑制DCLK1 后PI3K/AKT/mTOR 信號通路中相關轉錄因子總蛋白表達下調，其磷酸化水平降低（P<0.01），見圖8。上述結果說明DCLK1 通過PI3K/AKT/mTOR 信號通路的作用機制調控胃癌干細胞增殖、耐藥及侵襲遷移等生物學功能。

Figure 8. Expression of PI3K/AKT/mTOR signaling pathway-related proteins in DCLK1-inhibiting gastric cancer stem cells. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs Sphere group.圖8 抑制DCLK1對胃癌干細胞中PI3K/AKT/mTOR 信號通路相關蛋白表達的影響

討 論

胃癌是一種全球性重大疾病，每年新發病例超過100 萬，是全球第五大常見的惡性腫瘤，也是腫瘤相關死亡的第三大原因［15］。胃癌干細胞是一類存在于胃腫瘤中少量具有干細胞特性，與腫瘤復發、轉移和耐藥有關的腫瘤細胞，而目前的治療主要針對胃癌細胞而無法有效殺傷或抑制胃癌干細胞，但干細胞激活后能再次產生胃癌子代細胞導致腫瘤復發。近年來，靶向治療因其對腫瘤細胞的特異性使其在腫瘤治療中的地位變得越來越重要。靶向胃癌干細胞的治療為腫瘤治療提供了新的研究思路，尋找高特異性治療的靶點是提高胃癌療效乃至根治的重要途徑。

本研究采用無血清懸浮法培養胃癌干細胞，結果表明HGC-27 胃癌親本細胞成球懸浮生長，形成Sphere 細胞球，即為本研究細胞模型。腫瘤干細胞在無血清環境下可以持續存活，但腫瘤親本細胞則因失去相關生長因子的支持而逐漸死亡。存活的腫瘤干細胞持續分裂，成球生長而形成緊密的Sphere細胞球。研究顯示無血清培養液懸浮培養的Sphere細胞球在多種腫瘤培養液中顯示出更強的致瘤、耐藥和侵襲等干細胞特性，因而無血清培養液培養腫瘤Sphere 細胞球成為目前腫瘤干細胞研究的細胞模型［16-17］。

腫瘤干細胞標志物DCLK1 已被證實在胃癌及多種腫瘤中表達上調，是胃腸道腫瘤獨立的預后因素，并促進腫瘤細胞干性形成［18-21］。本研究顯示DCLK1 在胃癌Sphere 細胞中表達顯著高于HGC-27親本細胞。緊接著我們對Sphere 細胞進行了相關干性轉錄因子SOX2 和OCT4 的表達檢測，發現其表達量顯著高于親本細胞，表明DCLK1 可能在維持胃癌干細胞干性特征方面發揮一定作用。在結腸癌體內外研究中，抑制DCLK1 活性后，其腫瘤細胞自我更新能力及腫瘤增殖能力顯著降低，有效減弱了腫瘤細胞干性［22］。本研究中使用DCLK1 抑制劑DCLK1-IN-1 處理Sphere 細胞后，其增殖、耐藥、自我更新及體外遷移和侵襲能力均顯著降低，表明DCLK1 可能參與了胃癌干細胞的增殖、耐藥、自我更新及遷移和侵襲，其在維持胃癌干細胞干性特征方面發揮重要作用。

快速增殖是惡性腫瘤的重要生物學特性。c-MYC 是一種多效轉錄因子，可調節細胞增殖、分化、細胞周期、代謝和凋亡。c-MYC 在70%的人類腫瘤的啟動和維持過程中都異常表達，可作為腫瘤起始和維持的驅動因素。體內研究表明，抑制c-MYC 具有顯著的抗增殖作用和持續的腫瘤消退作用［23-24］。cyclin D1 是另一種常用的細胞增殖蛋白生物標志物，通過調節細胞周期轉換在腫瘤的發生和發展中起關鍵作用。我們研究發現在抑制DCLK1 活性的胃癌干細胞中c-MYC 和cyclin D1 表達顯著降低，提示DCLK1 可能通過激活c-MYC 及cyclin D1 等細胞增殖相關蛋白促進胃癌干細胞的增殖。

腫瘤細胞的多藥耐藥（multidrug resistance，MDR）是指腫瘤細胞對多種結構和功能不同的抗腫瘤藥物產生耐藥性。這一現象已成為腫瘤化療的一大障礙，嚴重影響臨床療效。MDR 與細胞藥物外流增加有關，這種機制涉及ATP 結合盒（ATP-binding cassette， ABC）轉運體，主要是P-糖蛋白（ABCB1）、MDR 相關蛋白1（ABCC1）和乳腺癌耐藥蛋白（ABCG2）。ABCG2 介導MDR，且ABCG2 蛋白自被發現以來一直是深入研究的主題，其過表達已在多種類型的腫瘤耐藥細胞系中被檢測到［25］。而TOP2A是一種關鍵的腫瘤促進基因，參與多種類型的腫瘤，與腫瘤生長、轉移、復發和化療耐藥密切相關［26］。靶向TOP2A與其他治療藥物聯合使用可顯著抑制腫瘤生長且增強患者對治療的反應，減少化學耐藥性的發展［26-27］。本研究中抑制DCLK1 活性顯著下調TOP2A 和ABCG2 表達，提示DCLK1 可能 通過調控TOP2A 和ABCG2 參與胃癌細胞耐藥特性形成。此外，現有數據表明ABCG2 在多種腫瘤細胞中表達，在促進干細胞增殖和維持干細胞表型方面起著重要作用，在干細胞和腫瘤治療中具有應用價值，可能是一種潛在的腫瘤干細胞標志物［28］。

EMT 是細胞表型在上皮細胞和間充質細胞之間互相轉化的過程。通過EMT 過程，細胞失去其上皮特征，如頂端-基底細胞極性和細胞-細胞接觸，并獲得間充質特性，包括細胞遷移、侵襲和抗凋亡等。越來越多的研究表明，EMT 與腫瘤干細胞特征密切相關，在腫瘤的發生、侵襲轉移和治療耐藥性中起重要作用。研究表明，DCLK1的敲除可以抑制不同腫瘤背景下腫瘤細胞的體外遷移和侵襲，并抑制體內腫瘤生長，在食管鱗癌中已被證明其可通過抑制EMT進程影響其腫瘤細胞的遷移和侵襲［29-31］。在本研究中，抑制DCLK1 活性后，EMT 過程中的上皮標志物E-cadherin蛋白的表達顯著上調，而間充質標志物vi‐mentin 和Snail 的表達水平則明顯下調。因此，我們推測DCLK1通過調控EMT過程中E-cadherin、vimen‐tin 和Snail 等蛋白的表達促進了胃癌干細胞的侵襲和遷移。

惡性腫瘤的發生和發展是多種信號轉導途徑相互作用的結果。PI3K/AKT/mTOR 信號轉導通路在許多腫瘤發生過程中異常激活，參與調節腫瘤細胞的存活、增殖、凋亡、自噬、化療耐藥、侵襲遷移和葡萄糖代謝等多個生物學過程［32-34］。AKT 可通過GSK-3和FoxOs 作用于cyclin D1 和c-MYC，介導細胞增殖和細胞周期［35］。在急性髓系白血病和急性淋巴細胞白血病中，PI3K 激活上調了ABCG2 的表達，并增加了腫瘤干細胞的百分比［36］。同時PI3K/Akt/mTOR 信號通路的激活會導致EMT 相關標志物表達上調，而抑制其活性可使EMT過程發生逆轉并降低腫瘤干細胞標志物的表達［37-38］。本研究中抑制DCLK1 后PI3K/AKT/mTOR 通路蛋白及其磷酸化蛋白表達下調，表明DCLK1通過調控PI3K/AKT/mTOR 信號通路作用于胃癌干細胞增殖、耐藥及侵襲遷移等相關生物學功能。

綜上所述，胃癌干細胞中DCLK1 表達上調，并通過作用于PI3K/AKT/mTOR 信號通路促進增殖、耐藥、EMT 等相關基因的表達而促進了胃癌干細胞相關生物學特性，提示DCLK1 在胃癌干細胞中發揮著重要的生物學作用，可能作為靶向胃癌干細胞治療的潛在靶點。