基于meta分析研究土壤消毒對微生物群落演替的影響

方文生，田文鳳，2，李 園，顏冬冬，王秋霞*，曹坳程*

（1.中國農業科學院植物保護研究所，植物病蟲害綜合治理全國重點實驗室，北京 100193；2.湖南農業大學園藝學院，長沙 410128）

土壤微生物在土壤生態系統中分解有機物質，促進養分循環和生物質的分解，從而影響土壤的肥力和結構[1]；并抑制土壤病原菌的生長，幫助植物吸收養分，促進植物生長，提高土壤的抗旱能力和抗病能力[2-3]。因此，土壤微生物對于維持土壤生態系統的平衡和健康起著至關重要的作用。

土壤熏蒸能夠有效抑制土傳病害的發生，降低農藥使用量，促進作物生長并顯著提高其產量，表現出一定的肥料效應，但同時對土壤微生物群落也產生了一定的影響[4-11]。Zeng等[4-5,8-9]研究表明，溴甲烷、氯化苦、威百畝、棉隆等顯著抑制了微生物的多樣性和群落組成。如氯化苦熏蒸顯著降低了土壤細菌和真菌群落的多樣性，至試驗結束（90 d）土壤細菌和真菌群落α多樣性依舊未能恢復至對照水平[7]。Fang等[12-13]研究也顯示，氯化苦顯著降低了細菌群落的多樣性，熏蒸后細菌群落α多樣性指數Shannon、Chao1和ACE顯著降低，Simpson顯著升高。但也有試驗顯示，棉隆、1,3-二氯丙烯、二甲基二硫、異硫氰酸烯丙酯熏蒸對土壤微生物群落α和β多樣性影響較小，熏蒸后第24天，4種熏蒸劑處理的土壤細菌ACE、Chao1和Shannon多樣性指數顯著增加，在第38天，4種熏蒸劑處理的土壤細菌多樣性指數與對照沒有顯著差異，表明微生物群落多樣性恢復到了未消毒水平[12]。上述結果表明，棉隆、1,3-二氯丙烯、二甲基二硫、異硫氰酸烯丙酯熏蒸均促進了土壤微生物群落α多樣性的增加，但刺激作用是短暫的。根據Zhu等[14]的研究，異硫氰酸烯丙酯熏蒸降低了細菌群落的多樣性，但增加了真菌群落的多樣性。由于土壤本身的特異性差異巨大，同一種熏蒸劑對微生物群落的影響可能存在不同的結果。

以往大多數研究均基于特定試驗進行分析，因而其結果只適用于特定的生物地理環境與熏蒸劑，導致土壤熏蒸對微生物的影響研究存在一定的不確定性。為了進一步明確土壤熏蒸對微生物群落的影響，本文基于數據整合分析方法（meta-analysis）原理，鑒于已有的研究成果，定量分析我國常用6種熏蒸劑氯化苦（chloropicrin，CP）、棉隆（dazomet，DZ）、二甲基二硫（dimethyl disulfide，DMDS）、1,3-二氯丙烯（1,3-dichloropropene，1,3-D）、乙蒜素（ethylicin，EH）和異硫氰酸烯丙酯（allyl isothiocyanate，AITC）對土壤微生物群落多樣性和結構組成的影響，為科學應用土壤消毒技術提供依據。

1 研究方法

1.1 數據收集

數據來自于web of science和中國知網2個文獻數據庫。數據收集過程中，設置“土壤消毒”“熏蒸劑”和“微生物群落”3個關鍵詞進行搜索。篩選條件：同一試驗包含配對的對照組與處理組，對照組為不熏蒸，處理組為熏蒸處理；試驗處理重復數大于或等于3。數據收集內容主要包括細菌和真菌多樣性及群落組成結構，以及每個試驗對應的相關信息，如熏蒸劑用量、采樣時間、土壤類型、pH等。共獲得符合條件的已發表文獻37篇，相匹配的有效數據117組。

1.2 數據分析

采用反應比（lnR）作為meta分析效應大小的度量標準（效應值），該指標反映了土壤消毒對微生物群落變化的影響。計算公式和方差分別為：

式中：Xe、Xc分別為熏蒸組和對照的平均值；Se、Sc分別為熏蒸組和對照的標準差；Ne、Nc分別為熏蒸組和對照的樣本數。lnR＞0，表示熏蒸對微生物產生刺激效應（正效應）；lnR＜0，則表示熏蒸對微生物產生抑制效應（負效應）。lnR及V（lnR）利用metafor包在R（4.01）中完成[15]。

1.3 統計分析

考慮到不同試驗地點熏蒸試驗的差異性，采用隨機效應模型對連續變量（熏蒸劑用量、采樣時間等）和分類變量（土壤類型）進行檢驗，圖表均采用ggplot2包進行繪制。

2 結果與分析

2.1 土壤消毒對微生物群落多樣性的影響

土壤消毒對土壤微生物群落多樣性產生了顯著影響，但不同熏蒸劑的影響程度不同，見圖1。圖中*表示顯著性，*表示p＜0.05，**表示p＜0.01，***表示p＜0.001。氯化苦和異硫氰酸烯丙酯對細菌群落的多樣性具有顯著抑制效應，其中，氯化苦對ACE指數和Shannon指數的分別為-0.16（p＜0.001）和-0.12（p＜0.001），異硫氰酸烯丙酯分別為-0.089（p=0.023）和-0.088（p=0.0014），表明氯化苦對細菌群落的抑制效應強于異硫氰酸烯丙酯。相反，乙蒜素、棉隆、二甲基二硫、1,3-二氯丙烯對細菌群里多樣性無顯著影響。

圖1 不同熏蒸劑對土壤細菌和真菌群落多樣性的效應值

真菌群落多樣性的結果表明，5種熏蒸劑中只有氯化苦對其產生了顯著的抑制效應，ACE指數和Shannon指數分別為-0.36（p＜0.001）和-0.28（p＜0.001）。而異硫氰酸烯丙酯和1,3-二氯丙烯對真菌群落的多樣性表現出一定的刺激效應（lnR＞0），但只有1,3-二氯丙烯對ACE指數具有顯著性（0.19，p＜0.01）。與細菌群落一致，乙蒜素和棉隆對真菌群落多樣性無顯著影響。

總體而言，氯化苦熏蒸對細菌和真菌群落多樣性具有顯著抑制效應，異硫氰酸烯丙酯對細菌群落多樣性有抑制作用，但對真菌群落無顯著影響；相反，1,3-二氯丙烯對細菌群落多樣性無顯著影響，但對真菌群落多樣性具有刺激效應；而乙蒜素、棉隆、二甲基二硫對細菌和真菌群落多樣性均不產生顯著影響。

2.2 土壤消毒對微生物群落結構的影響

土壤中豐度較高的優勢細菌包括Proteobacteria、Chloroflexi、Acidobacteria、Firmicutes、Gemmatimonadetes、Actinobacteria、Planctomycetes，其相加的總豐度占土壤總細菌的84.12%～92.05%。土壤消毒對優勢細菌的豐度產生顯著影響，既有抑制效應也有刺激效應，見圖2。

圖2 不同熏蒸劑對細菌群落結構效應值

盡管乙蒜素對Proteobacteria、Chloroflexi、Acidobacteria、Firmicutes、Gemmatimonadetes、Actinobacteria、Planctomycetes等7個門細菌水平無顯著影響，但棉隆和異硫氰酸烯丙酯對Proteobacteria和Planctomycetes產生顯著負效應，且對Planctomycetes的抑制效應大于Proteobacteria（DZ，-0.55與-0.12，p＜0.05；AITC，-0.94與-0.18，p＜0.05），同時對Firmicutes和Actinobacteria（AITC除外）產生顯著正效應。棉隆和異硫氰酸烯丙酯具有相似的微生物物種選擇性作用，可能是因為兩者均為異硫氰酸酯類物質[16]。二甲基二硫和1,3-二氯丙烯熏蒸對Acidobacteria產生顯著負效應，對Chloroflexi、Firmicutes、Gemmatimonadetes產生正效應但無顯著性。相反，氯化苦熏蒸除了對Proteobacteria無顯著影響外，對其他6種細菌均產生顯著影響，如對Planctomycetes（-0.86，p＜0.001）、Chloroflexi（-0.89，p＜0.001）、Acidobacteria（-0.59，p＜0.001）具顯著抑制作用，對Firmicutes（0.87，p＜0.001）、Gemmatimonadetes（0.44，p＜0.01）、Actinobacteria（0.36，p＜0.01）具顯著刺激作用?？梢姡然鄬毦郝浣M成的影響較其他幾種熏蒸劑更顯著。

由于真菌通常以菌絲或孢子的形式存在土壤中，其應對外界脅迫比細菌具有更強的抵抗力。通過比較4種優勢真菌Ascomycota、Mortierellomycota、Basidiomycota、Chytridiomycota的lnR（圖3），發現1,3-二氯丙烯和異硫氰酸烯丙酯只對Mortierellomycota產生了顯著正效應（lnR=2.25，p=0.02；lnR=0.99，p＜0.001），氯化苦只對Basidiomycota產生了顯著負效應（lnR=-1.22，p＜0.05），而乙蒜素和棉隆對4種優勢真菌均無顯著影響。相比于細菌，熏蒸劑對土壤真菌群落物種組成的影響較小，大部分物種在門水平無顯著變化。

圖3 不同熏蒸劑對真菌群落結構效應值

總體而言，土壤消毒對微生物群落結構產生了顯著的抑制和刺激作用，且對細菌群落的影響大于真菌。多數熏蒸劑對Firmicutes、Gemmatimonadetes、Mortierellomycota具正向刺激效應，而對Proteobacteria、Planctomycetes、Acidobacteria 和Basidiomycota具負向抑制效應。其中乙蒜素對細菌和真菌群落結構均無顯著影響，棉隆對真菌群落無顯著影響。

2.3 土壤消毒后微生物群落演替的影響因素

以上分析表明，無論是對細菌還是真菌群落，氯化苦與其他幾種熏蒸劑相比，均產生更顯著的影響，因此，選用氯化苦作為代表藥劑以進一步分析影響熏蒸效應值的關鍵變量。收集的117組數據中包含紅壤、潮土、黏土3種土壤類型。土壤類型顯著影響熏蒸劑對細菌群落的效應值（異質性統計量Qm=34.73，p＜0.001），但對真菌群落多樣性無顯著影響（Qm=5.62，p=0.23）。

氯化苦田間用量通常為30～60 g/m2[17-18]，本文收集的文獻中氯化苦用量范圍為11～123 g/m2，涵蓋了其常規用量。將效應值與熏蒸劑用量進行相關性繪圖，發現細菌群落多樣性效應值與氯化苦用量呈顯著負相關（R=-0.93，p＜0.001），見圖4～圖5。圖中細菌和真菌群落多樣性均選用Shannon指數。圖4表明氯化苦對細菌群落的抑制效應隨著劑量增加而顯著增加。相反，由圖5可見，真菌群落多樣性效應值與氯化苦用量呈正相關但無顯著性（p=0.13），表明隨著用量增加，氯化苦對真菌群落的抑制效應逐漸減弱。分析其原因，可能是由于高劑量作用下，氯化苦促進了某些真菌的生長[19]。

圖4 細菌多樣性效應值與熏蒸劑用量、時間、土壤pH 相關性

圖5 真菌多樣性效應值與熏蒸劑用量、時間、土壤pH 相關性

田間操作時一般熏蒸30 d后再敞氣30 d才可移栽作物，本文考察了120 d時間跨度土壤微生物群落的演替。由圖4可知，隨著時間的推移，氯化苦熏蒸對細菌多樣性的效應值逐步向0靠攏，表明熏蒸抑制效應隨時間顯著減弱。相關性表明細菌群落多樣性效應值與時間成顯著正相關（R=0.70，p=0.043），表明氯化苦消毒對細菌群落的抑制效應具顯著的時間性。同樣，由圖5可見，氯化苦對真菌多樣性效應也隨時間緩慢減弱，但相關性較弱且無顯著性。

本文收集的文獻中土壤pH從5.4～7.6，包括了酸性、中性和弱堿性土壤。相關性結果表明（圖4～圖5），氯化苦對細菌群落多樣性抑制效應隨著pH升高而增加，真菌群落多樣性抑制效應隨著pH升高而降低，表明弱堿性條件下增加了氯化苦對細菌群落的抑制效應，減少了對真菌群落的抑制效應。

2.4 討論

本文中熏蒸劑的用量分別為氯化苦11～123 g/m2、乙蒜素10～105 g/m2、棉隆40～90 g/m2、二甲基二硫60～80 g/m2、異硫氰酸烯丙酯10～80 g/m2、1、3-二氯丙烯20～44 g/m2，各藥劑用量均涵蓋了其田間常規和高低劑量[20-23]。Meta分析結果表明：

（1）氯化苦熏蒸對土壤細菌和真菌群落多樣性均產生顯著抑制效應，細菌和真菌群落結構發生顯著變化，這與前期的研究結果一致。Li等[24-25]采用宏基因組測序手段，發現氯化苦熏蒸之后，細菌群落多樣性顯著下降，群落組成在屬水平和OTU水平發生顯著改變；Ibekwe等[26]發現氯化苦對土壤微生物群落的影響作用能持續到第8周，其作用強度弱于溴甲烷，但強于1,3-二氯丙烯，同時，氯化苦熏蒸后土壤某些物種的豐度也顯著增加，如熏蒸10 d后土壤中好氧性革蘭氏陰性菌數量增加10倍，假單胞菌Pseudomonas生物量增加70%以上，而Pseudomonas正是降解氯化苦的主要微生物[19]。

（2）異硫氰酸烯丙酯對細菌多樣性和群落結構產生顯著抑制效應，對真菌具有刺激效應。Zhu等[14]研究認為，異硫氰酸烯丙酯熏蒸暫時降低了土壤細菌群落的多樣性，但長期刺激了真菌群落的多樣性，顯著改變了真菌群落結構；同時，異硫氰酸烯丙酯熏蒸后顯著促進了植物益生菌如Sphingomonas、Streptomyces、Hypocreales、Acremonium、Aspergillus、Pseudallescheria等的相對豐度[14,27]。熏蒸后微生物群落的重建為植物及其有益菌群之間的潛在相互作用提供了重要信息，通過調控真菌群落種間關系可以強化優勢菌對潛在病原真菌的拮抗作用，進而提高對土傳病害的抑制效果。

（3）棉隆對細菌和真菌群落多樣性無顯著影響，但顯著改變了細菌群落的結構，刺激了Firmicutes 和Actinobacteria 門水平的生長而抑制Proteobacteria和Planctomycetes豐度，對真菌群落結構無顯著影響。Chen等[28-31]研究表明，棉隆熏蒸后土壤優勢菌門發生變化，細菌多樣性明顯下降。不同物種對棉隆耐受性不同，如部分細菌經2 000 mg/kg棉隆處理后仍可存活；而經100 mg/kg棉隆處理后的土壤真菌只有木霉菌存活，但該劑量下病原菌均被殺滅；線蟲對棉隆具較高的抗性[32]。土壤生物對棉隆的敏感性因物種而異，有耐受性的生物可能會進行再定殖。Yakabe等[33]認為，棉隆熏蒸后可以顯著減少根癌農桿菌和疫霉菌種群數量，且熏蒸后的土壤更利于病原菌或有益菌的定植。

（4）1,3-二氯丙烯對細菌群落多樣性無顯著影響，但增加了真菌群落的多樣性，改變了細菌和真菌群落結構。Liu等[34]研究表明，1,3-二氯丙烯對土壤細菌群落有短暫的抑制效應，但該抑制效應很快消失，細菌豐度在后期逐漸恢復。對30 cm和60 cm土層研究發現，1,3-二氯丙烯熏蒸對不同深度土壤微生物群落結構的總體影響很小[4]，可能是因為試驗所用熏蒸劑用量較低（14 g/m2）。1,3-二氯丙烯熏蒸短期內引起了直接參與氮循環的微生物種類組成和數量發生顯著變化，如降低了酸性紅壤和堿性潮土中涉及固氮、硝化和反硝化的11個功能基因的豐度，且含有nifH、nxrB、napA和qnorB基因的微生物對1,3-二氯丙烯熏蒸較為敏感，但所有功能微生物在24～59 d孵育階段均恢復到未熏蒸水平[35]。

（5）二甲基二硫和乙蒜素對細菌多樣性和群落結構均無顯著影響。二甲基二硫和乙蒜素均為植物源熏蒸劑，具有優異的殺線蟲活性[36-37]，相比其他熏蒸劑，對土壤微生物的影響較少。Li等[38]發現，乙蒜素雖然輕微降低了土壤細菌群落的多樣性，但增加了真菌群落的分類多樣性，同時促進了部分有益菌如Firmicutes、Steroidobacter和Chytridiomycota的生長。對于功能微生物而言，二甲基二硫對大部分氮循環基因nifH、AOA、narG、qnorB等無顯著影響[39]。二甲基二硫是目前公認的溴甲烷最有潛力的替代品，但目前尚無其對土壤真菌群落的報道。

熏蒸劑對土壤微生物群落的影響程度高度依賴熏蒸劑類別、用量和時間尺度。氯化苦對土壤細菌群落的抑制效應隨著用量增加而增加，但隨著時間推移顯著減弱。Zhu等[14，39]研究表明，異硫氰酸烯丙酯對細菌群落的抑制效應只持續24～42 d，之后抑制效應消失。棉隆熏蒸短期增加了固氮微生物Rhizobium、反硝化微生物Alcanivorax、Bacillus、Streptomyces等的豐度，但59 d后恢復至對照水平[40]。熏蒸劑的抑制效應或刺激效應在熏蒸后期逐步減弱，微生物也逐步恢復，而且細菌群落恢復力快于真菌群落[41]。

3 結論

氯化苦和異硫氰酸烯丙酯對細菌群落多樣性產生了顯著的抑制效應，乙蒜素、棉隆、1,3-二氯丙烯、二甲基二硫對細菌群落多樣性無顯著影響；對于真菌群落多樣性，只有氯化苦對其有顯著的抑制效應。在物種組成方面，除乙蒜素外，其他5種熏蒸劑對細菌群落同時產生正向刺激和負向抑制作用，其中氯化苦的影響較其他幾種熏蒸劑影響更顯著。相比于細菌，熏蒸劑對土壤真菌群落物種組成影響較小，大部分物種在門水平無顯著變化。熏蒸劑用量和采樣時間是影響土壤熏蒸對微生物群落正負效應的最主要因素，抑制效應隨著熏蒸劑用量的增加而增加，隨著時間延長而顯著減弱。

土壤消毒技術是一項涵蓋了多種熏蒸劑的土傳病害防控措施，其對土壤微生物的影響需要具體到特定的熏蒸劑種類，否則容易以偏概全；同時，熏蒸劑用量的大小、取樣時間的長短、土壤特性如酸堿性的差異等因素均顯著影響了熏蒸劑對土壤微生物的作用強度。綜合考慮上述兩點，才能全面而準確地了解熏蒸劑的土壤微生態效應。