氣相色譜-質譜聯用結合生物信息分析技術探討蒙藥珍寶丸揮發油治療類風濕關節炎的作用機制*

馬廣平,渠弼,布仁,蓮花,白文明

(內蒙古醫科大學1.藥學院;2.蒙醫藥學院,呼和浩特 010110)

蒙藥復方“珍寶丸”(又名額爾敦烏日勒丸、桑丕勒諾爾布、如意珍寶丸)是經典的蒙醫傳統方劑,最早記載于13世紀的《滿阿格·穆迪格坡仍瓦》,其后在《蒙醫甘露四部》《蒙醫金匾》《觀者之喜》《中華人民共和國衛生部藥品標準》(蒙藥分冊)等蒙醫藥典籍和藥品標準中均有收載[1]。經長期蒙醫臨床驗證,珍寶丸具有活血化瘀、清熱安神、舒筋活絡、除“協日烏素”等功效,結合蒙醫“異病同治”理論和法則,廣泛用于治療炎癥和自由基誘導的“薩病”“協日烏素”等頑固性疾病,特別是在治療類風濕關節炎方面療效顯著[2]。蒙醫理論認為類風濕關節炎屬于“協日烏素”“黃水病”,是由人體三根七素失去相對平衡,巴達干赫依(似氣)偏盛,赫依與奇蘇(血)相搏,巴達干黏液(痰濁)滯留在骨關節產生損傷,氣血運行受阻,導致六條顯性(外)白脈(四肢)受損,擴散于機體表里所致[3]。珍寶丸含有珍珠、牛黃、檀香、紅花、水牛角、地錦草等29味純天然藥材,按照蒙醫“君、臣、佐、使”原則配制成深紅色芳香水丸劑,方劑以具有鎮靜作用的珍珠為主,配以牛黃清熱安神,麝香清毒熱、開竅,紅花治臟腑病及調理體質,丁香以理命脈赫依為輔,再加檀香以清心肺騷熱,另加地錦草、蓽茇、苘麻子、白苣勝等為之佐使,諸藥組方嚴謹,攻補兼施、寒熱并用,共達清熱、安神、舒筋活絡之功效[4]。

珍寶丸處方組成多、化學成分復雜、起效機制不清,嚴重缺乏藥效物質基礎研究。故本研究以珍寶丸中揮發油成分治療類風濕關節炎為出發點,首先,采用高通量分析技術氣相色譜-質譜聯用(gas chromatographymass spectrometer,GC-MS)結合相應數據庫分析鑒定了珍寶丸的揮發油成分和相對含量。其次,以主要的揮發油成分為基礎,利用生物信息分析技術對珍寶丸揮發油治療類風濕性關節炎的主要活性成分、關鍵靶點及通路進行預測。最后,采用體外抗氧化活性實驗測定珍寶丸揮發油的抗氧化活性。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Agilent GC-MS:Agilent 7890A氣相色譜儀,Agilent 5975C質譜儀組成,載氣為高純度氦氣。P9型雙光束紫外-可見分光光度計(上海美譜達儀器有限公司),AL104電子天平(梅特勒托利多集團,感量:0.1 mg),HYCD-282C實驗室冷藏冷凍箱(海爾集團),1 mL移液槍(艾本德股份公司),電熱套(北京中興偉業儀器有限公司),揮發油提取器(北京博美玻璃有限公司)。

1.2試劑與藥品 珍寶丸處方中29味藥材均購自內蒙古藥材市場,由呼和浩特市蒙醫中醫醫院制劑中心提供,經內蒙古醫科大學藥學院生藥學教研室渠弼副教授鑒定,均符合2020年版《中華人民共和國藥典》中藥飲片的規定,均為正品,各藥材產地及批號信息見表1。該藥品于內蒙古醫科大學蒙醫藥學院蒙藥炮制實驗室參照處方,見表2自制而得,使用前置于室溫陰涼處保存。純化水(實驗室自制),乙醚(分析純,天津市風傳化學試劑科技有限公司,批號:20190906),甲醇(分析純,天津市津東天正精細化學試劑廠,批號:20230326)。

表1 藥材產地及批號

表2 珍寶丸處方組成

2 方法與結果

2.1方法

2.1.1珍寶丸揮發油提取工藝篩選 采用單因素考察法,分別對提取液體積、提取液浸泡時間、回流提取時間等進行優化篩選,最終以揮發油產量為標準,確定最佳揮發油提取工藝。

具體提取工藝流程如下:稱取經粉碎、過篩后的珍寶丸粉末200 g,置于3 000 mL圓底燒瓶中,加入指定體積純化水作為提取液,室溫浸泡指定時長后,加熱回流提取指定時間,提取結束后冷卻至室溫,打開出口活塞放水,由揮發油提取器底端刻度直接讀出揮發油體積,作為揮發油提取工藝篩選標準。

2.1.2珍寶丸揮發油成分的GC-MS分析

(1)供試品溶液制備 粉碎,過篩孔內徑0.25 mm(60目)篩,稱取珍寶丸粉末200 g,置于圓底燒瓶中,加入10倍體積的純化水室溫浸泡2 h,水蒸氣蒸餾4 h,收集揮發油于鋁箔紙覆蓋的微量離心管中,-20 ℃儲存,以供進一步的GC-MS分析。

(2)測定條件 GC-MS條件:HP-5MS毛細管柱(0.25 μm×30 m,0.25 μm),高純度氦氣為載氣,流速為0.5 mL·min-1;分流比1：50;進樣量0.5 μL;進樣溫度240 ℃;程序升溫:初始溫度50 ℃,持續2 min,50→100 ℃(3 ℃·min-1),100→200 ℃(2 ℃·min-1),200→260 ℃(8 ℃·min-1),保持2 min;電離源為電子轟擊源(electron impact ion source,EI),電離電壓69.9 eV,離子源溫度250 ℃,四極桿溫度150 ℃;質譜掃描范圍為35～625m/z,溶劑延遲2 min;全掃描模式。

(3)數據解析 按上述測定條件測得揮發油成分的質譜數據,通過檢索美國國家標準技術研究院(national institute of standards and technology,NIST)質譜庫,對揮發油成分進行定性鑒定,并計算各成分的相對峰面積百分比,作為各成分的相對百分含量。

2.1.3生物信息學分析

(1)珍寶丸揮發油成分靶點與疾病靶點的獲取 根據GC-MS鑒定結果,以相對含量前48的成分(97.66%)為基礎,利用pubchem數據庫獲得各成分的2D結構,并將其導入Swiss Target Prediction數據庫進行靶點預測,整合去重后,獲取成分靶點。以“Rheumatoid arthritis”為檢索詞在Genecards、OMIM、TTD和DRUGBANK數據庫中收集與RA相關疾病靶點信息,整合去重后,獲取RA疾病靶點。通過Venny軟件獲取珍寶丸治療RA的潛在作用靶點。

(2)蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)網絡構建與關鍵靶點的篩選 將上述靶點導入STRING數據庫,獲取PPI網絡,之后利用Cytoscape3.9.1版軟件中CytoNCA 插件對PPI網絡進行拓撲學分析,計算各節點的度值(degree)、介數中心性(betweenness centrality,BC)和接近中心性(coseness centrality,CC),篩選出各參數值大于中位值的關鍵靶點。

(3)GO和KEGG通路富集分析 利用DAVID數據庫對潛在作用靶點進行基因本體(gene ontology,GO)分析和京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)信號通路富集分析,預測珍寶丸治療RA的生物學過程(biological process,BP)、細胞組成(cellular component,CC)、分子功能(molecular function,MF)和相關信號通路的關系,并借助微生信在線平臺對結果進行可視化輸出。

(4)“活性成分-疾病靶點”網絡圖構建 利用Cytoscape軟件構建珍寶丸揮發油“活性成分-疾病靶點”網絡圖,并采用Network Analysis插件分析Degree值,根據Degree值的大小篩選主要活性成分。

(5)分子對接驗證 選取PPI網絡中度值前5的核心靶點和“活性成分-疾病靶點”網絡中度值前7的主要活性成分進行分子對接。在Chem 3D軟件中將要對接的成分進行結構優化并下載其3D結構的pdb格式文件。在蛋白質數據庫(protein data bank,PDB)數據庫中下載大分子靶蛋白的pdb格式文件。使用AutoDock和PyMOL軟件進行分子對接和結果可視化。

2.1.41,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-trinitrophenyl hydrazine,DPPH)活性試驗 在濃度為1 mg·mL-1的甲醇中制備珍寶丸揮發油和維生素E儲備液。將這些儲備液用甲醇稀釋,制備13份工作溶液,濃度分別為0.1、0.5、1、2、4、8、10、20、40、50、80、100、200 μg·mL-1。將新鮮制備的DPPH溶液(0.002%,W/V)與甲醇和上述各工作溶液以1：1：1的比例混合。此外,將上述DPPH溶液與甲醇以1：1的比例混合,制備陰性對照溶液。然后,將所有溶液在室溫下的暗處放置40 min。使用甲醇作為空白溶液,使用分光光度計在517 nm處測量溶液的吸光度。珍寶丸揮發油和維生素E的抗氧化活性用以下公式計算:抑制DPPH活性的百分比(%)=(A-B)/A × 100%。A=空白的吸光度,B=樣品的吸光度。使用Graphpad prism 8.3.0版軟件計算珍寶丸揮發油和維生素E溶液的抗氧化半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration,IC50)。所有樣品均重復測定3次。

2.2結果

2.2.1不同提取條件對揮發油產量的影響

(1)不同蒸餾時間對揮發油產量的影響 粉碎,過篩孔內徑0.25 mm(60目)篩,稱取珍寶丸粉末200 g,加10倍量純化水,浸泡2 h,分別測得不同水蒸氣蒸餾時間(h)對應的揮發油產量(mL)。揮發油的產量隨水蒸氣蒸餾時間的變化關系見圖1A。結果表明,水蒸氣蒸餾時間超過4 h時,揮發油的產量不再隨著蒸餾時間的延長而增加,故確定水蒸氣蒸餾時間為4 h。

A.不同蒸餾時間與揮發油產量相關關系;B.不同浸泡時間與揮發油產量相關關系;C.不同料液比與揮發油產量相關關系;D.40目藥粉顆粒的不同蒸餾時間與揮發油產量的相關關系。

(2)不同浸泡時間對揮發油產量的影響 粉碎,過篩孔內徑0.25 mm(60目)篩,稱取珍寶丸粉末200 g,加10倍量純化水,水蒸氣蒸餾10 h,分別測得不同浸泡時間(h)對應的揮發油產量(mL)。揮發油的產量隨水浸泡時間的變化關系見圖1B。結果表明,浸泡時間為2 h時,揮發油的產量最大,故確定浸泡時間為2 h。

(3)不同提取液體積對揮發油產量的影響 粉碎,過60目篩,稱取珍寶丸粉末200 g,純化水浸泡2 h,水蒸氣蒸餾10 h,分別測得不同倍率提取液對應的揮發油產量(mL)。揮發油的產量隨提取液倍率的變化關系見圖1C。結果表明,提取液倍率為10倍時揮發油的產量最大,故確定提取液倍率為10倍。

(4)不同藥粉粒徑對揮發油產量的影響 粉碎,過40目篩,稱取珍寶丸粉末200 g,加10倍量純化水,浸泡2 h,分別測得不同水蒸氣蒸餾時間(h)對應的揮發油產量(mL)。揮發油的產量隨水蒸氣蒸餾時間的變化關系見圖1D。結果表明,相較于粉末顆粒為40目而言,粉末顆粒為60目的樣品(圖1A)可在更短的時間內(4 h)達到揮發油產量最大,故選擇藥粉經60目過篩。

2.2.2GC-MS分析 采用GC-MS技術分析鑒定珍寶丸的揮發油成分,共鑒定出化合物115個,其中相對百分含量排名前48的化學成分,即反式-異丁香酚(35.5%)、茴香腦(13.6%)、桉樹腦(10.9%)等,占總揮發油含量的97.66%,具體信息和對應化學文摘社(Chemical Abstracts Service,CAS),見表3。

表3 珍寶丸揮發油的主要化學成分

2.2.3生物信息學分析

(1)珍寶丸揮發油成分靶點與疾病靶點的篩選 通過Swiss Target Prediction數據庫共篩選到珍寶丸中48個主要成分的作用靶點425個。在Genecards、OMIM、TTD和DRUGBANK數據庫共篩選到疾病靶點1 317個RA。通過Venn圖獲得珍寶丸治療RA的潛在作用靶點147個,見圖2。

圖2 珍寶丸揮發油成分-RA靶點韋恩圖

(2)PPI網絡構建與核心靶點的篩選 將上述作用靶點導入STRING數據庫,并通過Cytoscape 軟件繪制PPI網絡圖,見圖3。利用CytoNCA插件計算各節點的degree、 BC和 CC,以degree≥11,BC≥53.54和CC≥0.35為篩選標準,篩選出核心靶點24個,選取度值較高的前5個靶蛋白作為關鍵核心靶點,即STAT3(信號傳導和轉錄激活因子3)、HSP90AA1(熱休克蛋白90α家族A類成員1)、SRC(細胞凋亡及周期相關蛋白)、Akt1(絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶)、ESR1(雌激素受體1)。見表4。

點的大小和顏色深淺表示節點連接度大小,一個節點與其他節點連接越多,節點越大顏色越深。

表4 珍寶丸揮發油成分治療RA關鍵靶點的拓撲參數

(3)GO和KEGG通路富集分析 以P<0.05為閾值,在David數據庫中共富集到GO條目683個,包括BP488條,MF69條和CC126條。將P值按從小到大進行排序,選取BP、MF和CC排名前10的條目繪制條形圖,見圖4。同樣,以P<0.05為閾值,進行KEGG通路富集分析,得到相關通路140條,選取最具顯著性的前20條通路繪制氣泡圖,見圖5。

圖4 珍寶丸揮發油成分-RA交集靶點GO分析

圖5 珍寶丸揮發油成分-RA交集靶點KEGG通路富集分析

GO富集分析篩選后發現,主要涉及的BP包括信號轉導、炎癥反應和蛋白質磷酸化等。MF主要涉及與相同蛋白質結合、腺苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)結合及酶結合等。CC主要涉及胞質溶膠、質膜和細胞質等。

KEGG 通路富集分析結果顯示,珍寶丸治療RA的靶點主要富集在癌癥、感染、炎癥及免疫等相關通路上,包括癌癥信號通路、PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路、RAS信號通路等。因此,通過以上結果表明蒙藥珍寶丸通過多種作用多條通路發揮治療RA的作用。

(4)“活性成分-疾病靶點”網絡圖構建 運用Cytoscape軟件構建珍寶丸“活性成分-疾病靶點”網絡圖,見圖6。圖中含節點169個及邊314條。紅色箭頭代表疾病,綠色菱形代表靶點,黃色六邊形代表藥物,橙色圓形代表成分,其中圓的形狀越大、顏色越深表示該成分越重要。拓撲學分析結果顯示,珍寶丸化學成分的平均degree為8.35,>8.35的成分共7個,即97-54-1、104-46-1、607-91-0、87-44-5、470-82-6、20126-76-5、301-00-8。則這7個成分可能是發揮抗RA作用的主要活性成分,見表5。

圖6 珍寶丸“活性成分-疾病靶點”網絡圖

表5 珍寶丸揮發油核心活性成分基本信息

(5)分子對接 將5個核心靶點(STAT3、HSP90AA1、SRC、Akt1、ESR1)分別與7個潛在活性成分[trans-isoeugenol,anethole,myristicin,caryophyllene,eucalyptol,(-)-terpinen-4-ol,methyl linolenate]進行分子對接,結果見表6。結果顯示,所有組合的結合能均小于-17.70 kJ·moL-1,表明活性成分與靶點均能自發結合并發生相互作用。分子對接部分可視化結果見圖7。

圖7 活性成分與核心靶點分子對接模式圖

表6 珍寶丸揮發油治療RA關鍵活性成分與核心靶點結合能

2.2.4抗氧化活性實驗 以維生素E為參比,采用DPPH法測定珍寶丸揮發油成分的自由基清除活性,見表7。結果表明,揮發油和維生素E的濃度范圍為0.1～200 μg·mL-1,珍寶丸具有良好的抗氧化活性,其IC50為14.16 μg·mL-1,而維生素E的IC50為6.65 μg·mL-1,故珍寶丸揮發油成分是維生素E的46.96%。

表7 珍寶丸揮發油成分和維生素E抑制DPPH活性的百分比

3 討論

RA作為一種以慢性多關節滑膜炎癥為主要臨床表現的自身免疫性疾病,其發病機制目前尚不明確,故現有藥物無法達到臨床治療的目標[5]。珍寶丸是蒙醫臨床除“協日烏素”的常用蒙成藥,但其藥效成分和具體治療機制尚不清楚。故本研究借助GC-MS技術、生物信息學分析技術及抗氧化實驗,探討珍寶丸揮發油防治RA的潛在作用機制及體外抗氧化活性。

GC-MS分析結果顯示,珍寶丸中共鑒定出揮發油成分115個,其中相對百分含量前48的成分占總揮發油含量的97.66%。進一步通過生物信息學研究發現,珍寶丸抗RA的主要活性成分包括trans-Isoeugenol,Anethole,Myristicin,Caryophyllene,Eucalyptol,(-)-Terpinen-4-ol,Methyl linolenate。據報道[6-13],以上7個化合物均具有良好的鎮痛、抗炎、抗氧化等作用,并可預防自由基誘導的慢性疾病,如癌癥、炎癥、自身免疫性疾病和其他年齡相關疾病。此外,有研究發現[14],trans-Isoeugenol能夠抑制脂多糖誘導產生的炎癥遞質釋放,并且可能通過調控NF-κB、p65等相關通路抑制促炎因子及其轉錄,從而緩解炎癥癥狀。MORADI等[15]發現,Anethole作為一種藥用植物化合物,其抗炎作用主要通過減少促炎因子TNF-α和IL-1β的產生來實現。Myristicin可以通過鈣離子通道抑制的NO、IL-6、IL-10和LIF等相關的因子,緩解炎癥反應[16]。

PPI和KEGG結果顯示,珍寶丸揮發油成分治療RA主要作用于STAT3、HSP90AA1、SRC、Akt1等靶點,通過PI3K-Akt、MAPK和RAS等信號通路發揮作用。STAT3作為信號轉導與轉錄激活因子(STAT)家族成員之一,其激活可導致促炎細胞因子的產生和免疫反應增加,通過抑制STAT3的表達可以限制免疫炎癥反應,從而緩解RA癥狀[17]。研究發現[18],作為最重要的熱休克蛋白之一,發熱會上調T細胞中HSP90(包括HSP90AA1和HSP90AB1)的表達,故減輕滑膜炎癥和關節軟骨破壞可通過降低HSP90AA1表達水平。SRC作為一種原癌基因酪氨酸蛋白激酶,參與能量代謝、細胞增殖等多種生物學功能調節,有研究發現[19],SRC的高表達也與RA疾病的發生密切相關。Akt1作為Akt激酶的成員之一,是P13K/Akt通路的重要組成部分,在受到體內細胞因子和內部環境中各種物理和化學因素刺激后Akt蛋白被位于Akt上游的PI3K磷酸化激活,磷酸化的Akt蛋白參與NF-κB、mTOR和JNK等炎癥信號通路的激活[20],從而抑制RA炎性反應。 PI3K/Akt信號通路可參與多種細胞的增殖和凋亡,在RA炎癥反應中發揮重要作用[21]。

分子對接結果顯示,珍寶丸7個主要活性成分與5個核心靶點均能穩定地結合,并顯示出較好的結合活性(結合能<-17.70 kJ·mL-1)。

綜上所述,珍寶丸揮發油成分治療RA具有多靶點、多成分、多通路的特點,其可能通過trans-Isoeugenol,Anethole,Myristicin等主要活性成分作用于STAT3、HSP90AA1、SRC、Akt1等靶點,參與PI3K-Akt、MAPK等信號通路調節免疫,減輕炎癥反應,緩解類風濕關節疼痛。此外,基于DPPH法的體外抗氧化活性實驗結果顯示,珍寶丸揮發油成分呈現出顯著的抗氧化活性,能有效地去除自由基,對炎癥和自由基誘導的RA產生療效。