基于疾病與活性化合物靶點網絡研究牛舌草治療大鼠腦缺血-再灌注損傷的作用*

譚文溚,胡博軍,黃貝,張雯,王淑美,臧林泉,杜冠華

(1.廣東藥科大學藥學院,廣州 510006;2.中國醫學科學院,北京協和醫學院藥物研究所,藥物靶點研究與新藥篩選北京市重點實驗室,北京 100050;3.河南大學藥學院,開封 475004)

缺血性腦卒中(ischemic stroke,IS),是指腦血管病變、血液成分異常或其他原因引發的腦血管狹窄或閉塞,進而導致腦組織局部供血、供氧不足,出現腦損傷和神經功能障礙。目前缺血性腦卒中已經成為全球人口死亡和長期嚴重殘疾的主要原因之一[1]。恢復缺血區域血氧供應是缺血性腦卒中的主要治療目標[2]。然而,當梗死區域腦組織長時間缺血缺氧后恢復血氧供應時,會釋放過量的活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)、激活炎癥反應等損傷機制,破壞細胞內蛋白質、脂質、核酸和組織結構,導致繼發性腦損傷和神經功能障礙,這種現象被稱為腦缺血-再灌注損傷(cerebral ischemia/reperfusion injury,CIRI)[3]。CIRI是一個復雜的病理生理過程,涉及多種損傷機制,包括氧化應激、炎癥反應、細胞內鈣超載、線粒體功能障礙和細胞凋亡等[4-5]。

紫草科多年生草本植物牛舌草(AnchusaitalicaRetz.或OrageofficinalesL.),分布于我國大西南以及河北、陜西、甘肅、臺灣等地,是維吾爾族治療心腦血管疾病的經典藥材之一,常用于異常黑膽質成熟劑、異常黑膽質清除劑和艾菲提蒙湯,具有生濕補腦、祛寒補心、爽心悅智、潤燥消炎、止咳平喘等功效[6]。研究表明,牛舌草可以調節絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號通路和核因子-κB(nuclear factor-κ-gene binding,NF-κB)信號通路,激活核因子E2相關因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)/血紅素加氧酶-1(recombinant heme oxygenase 1,HO-1)信號通路,減少白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor,TNF-α)等炎癥因子的表達[6]。并且牛舌草總黃酮可以調節心肌缺血-再灌注損傷中凋亡相關蛋白的表達,有效抑制心肌細胞凋亡[7]。目前尚缺乏牛舌草治療CIRI損傷相關研究。因此,筆者在本實驗首先采用線栓法制備CIRI大鼠模型,確證牛舌草的治療效果,并結合網絡藥理學、分子對接、分子生物學,探索其作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SD大鼠60只,雄性,7～8周齡,體質量240～260 g,SPF級,購自北京華阜康生物科技有限公司,實驗動物許可證編號:SCXK(京)2019-0023,實驗動物合格證號:110322231101042886。分籠飼養,保持相對濕度40%～50%,室溫20～25 ℃,自由進食、進水,動物實驗符合倫理學標準,并得到中國醫學科學院藥物研究所倫理委員會的批準,實驗倫理審查批準號:00005264。

1.2實驗材料 牛舌草(購自新疆藥都藥業有限公司,經新疆藥都藥業有限公司鑒定為正品,批號:20190110)、異氟烷(瑞沃德生命科技有限公司,批號:20221004)、2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-Triphenyl-2H-tetrazolium chloride,TTC,美國sigma公司,批號:BCBP3272V)、4%多聚甲醛(北京索萊寶科技有限公司,批號:2305001)。

1.3實驗方法

1.3.1牛舌草醇提取物制備 牛舌草粉碎至粉末后,稱取20 g,加60%乙醇20 mL浸泡6 h,再加75%乙醇120 mL,回流提取2 h,提取2次,合并提取液。提取液50℃減壓旋蒸回收乙醇,得濃縮液。過濾,用大孔吸附樹脂進行純化,收集洗脫液,50 ℃減壓去除乙醇后,真空冷凍干燥,得固體粉末,每克固體粉末含原藥材 20 g。

1.3.2動物造模與分組 CIRI模型制備:異氟烷吸入麻醉,仰臥位固定大鼠,沿頸正中線開口2～3 cm,鈍性分離右側組織和肌肉,直至右側頸總動脈(common carotid artery,CCA)暴露,在CCA近心端、頸外動脈(external carotid artery,ECA)遠心端、近心端和頸內動脈(internal carotid artery,ICA)近心端備線,插入線栓前,阻斷CCA、ECA和ICA,在ECA中部略開小口,將線栓由ECA插入后導入ICA,同時松開ICA近心端的止血夾,繼續將線栓插入至其顱內段,自CCA分叉處插入的線栓長約20 mm,阻斷大腦中動脈,1.5 h后取出線栓,結扎ECA近心端,松開CCA,實現再灌注。假手術組的大鼠手術是僅在暴露右側頸總動脈,頸外動脈,頸內動脈,阻斷血液,剪斷頸外動脈,并結扎血管,即可完成。造模成功的SD大鼠按隨機數字表法分為模型對照組及牛舌草給藥10、30、100 mg·kg-1組,給藥劑量按牛舌草醇提取物固體粉末計算。牛舌草給藥組在再灌注后立刻尾緣靜脈給藥,假手術組和模型對照組給予相應體積的0.9% 氯化鈉溶液。

1.3.3神經功能評分 再灌注后24 h進行神經功能評分,采用mNSS評分、Longa測試和抓取力測試,從運動功能、感覺功能和平衡功能3個方面評價大鼠損傷程度,其中mNSS評分和Longa測試的評分越高,抓取力測試評分越低,則表示大鼠損傷越嚴重。mNSS評分在10～15分則認為CIRI模型制備成功,并納入后續實驗。

1.3.4TTC染色 再灌注后24 h快速分離大腦并速凍,將冷凍的大腦切割成厚度約2 mm的冠狀切片,放置于TTC染色液中,37 ℃避光孵育,4%多聚甲醛固定,然后拍照記錄。使用ImageJ(national institutes of health,bethesda,MD,USA)計算梗死體積。梗死體積百分比=[總梗死體積-(同側半球體積-對側半球體積)]/對側半球體積×100%。

1.3.5牛舌草化學成分、靶點和疾病靶點獲得 在中國知網(https://www.cnki.net/)、中國生物醫學數據庫(http://www.sinomed.ac.cn/)和PubMed數據庫(https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/)檢索,查詢牛舌草已知且結構明確的化合物成分,通過PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲得相應2D SDF結構數據[8-18]。將化合物2D SDF數據分別導入PharmMapper數據庫(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)(Fit值>2)、Swiss Target Prediction數據庫[http://www.swisstargetprediction.ch/,靶點選擇概率(probability)>0]、Similarity Ensemble Approach(SEA)數據庫(https://sea.bkslab.org/)(P-Value<0.5),且通過Uniprot數據庫(https://www.uniprot.org/)去除重復靶點,校正靶點名稱,得到牛舌草化合物作用靶點。在GeneCards數據庫(https://www.genecards.org/)(sore>7)檢索CIRI相關靶點,將上述疾病靶點與牛舌草化合物作用靶點通過Venny 2.0取交集,獲得牛舌草治療CIRI潛在靶點[19-24]。

1.3.6蛋白相互作用網絡圖構建 將牛舌草治療CIRI潛在靶點導入String數據庫(https://cn.string-db.org/)[25],獲得蛋白質相互作用(protein-protein interaction,PPI)網絡數據,之后應用Cytoscape 3.9.1軟件,建立PPI網絡圖。采用CytoHubba分析牛舌草治療CIRI關鍵靶點,并進行拓撲分析。同時應用MODE構建功能模塊,進行Glue Go功能分析。

1.3.7京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)信號通路和基因本體(gene ontology,GO)生物過程分析 將牛舌草治療CIRI潛在靶點導入DAVID數據庫(https://david.ncifcrf.gov/)[26],進行KEGG信號通路分析和GO生物過程富集分析,分析牛舌草治療CIRI作用通路和生物過程。

1.3.8分子對接實驗 使用RCSB數據庫(https://www.rcsb.org/)在線平臺檢索CytoHubba牛舌草治療CIRI關鍵靶點,獲得其3D蛋白結構[27]。在PubChem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下載牛舌草活性化合物3D結構。將靶點與化合物3D結構導入Discovery Studio 2019 Client進行分子對接,利用結合分數(LibDock Score)來評估牛舌草中活性化合物與其治療CIRI關鍵靶點的蛋白結合能力。

2 結果

2.1牛舌草對CIRI腦梗死體積和神經功能的影響 TTC染色結果顯示,與假手術組比較,模型對照組出現嚴重的腦損傷,腦梗死體積顯著增加(P<0.01)。牛舌草給藥30、100 mg·kg-1能夠有效抑制缺血-再灌注引起的腦損傷,顯著減少腦梗死體積(P<0.05),如圖1A所示。

A.牛舌草對CIRI腦梗死體積的影響;B.牛舌草對CIRI神經功能障礙的影響。①與假手術組比較,t=13.17～29.48,P<0.05;②與模型對照組比較,t=1.889～12.33,P<0.05(神經功能評分實驗n=6,TTC染色實驗n=3)。

神經行為學評分顯示,與假手術組比較,模型對照組大鼠的神經行為和運動功能損傷嚴重,mNSS評分和Longa評分顯著升高(P<0.05),抓取力測試評分顯著降低(P<0.05)。與模型組對照比較,牛舌草各劑量組大鼠mNSS評分均顯著下降(P<0.05),抓取力測試評分顯著上升(P<0.05),100 mg·kg-1牛舌草給藥組Longa評分顯著下降(P<0.05),如圖1B所示。

2.2牛舌草潛在靶點PPI網絡圖分析 通過數據庫查詢,共獲得牛舌草化學成分69個,見表1。在化合物靶點數據庫檢索藥物作用靶點,且與CIRI疾病靶點取交集,獲得共有靶點143個,作為牛舌草治療CIRI潛在靶點。將上述靶點導入String數據庫,并用Cytoscape 3.9.1版軟件建立PPI網絡圖,結果如圖2所示。MCC算法分析網絡圖,獲得關鍵靶點分別為蛋白激酶B(protein kinase b,PKB/AKT1)、促分裂原活化蛋白激酶3(mitogen-activated protein kinase kinase 3,MAPK3)、白細胞介素家族、TNF、信號轉導和轉錄激活因子3、轉錄因子Jun(transcription factor jun,JUN)、血管內皮生長因子-A(vascular endothelial growth factor a,VEGFA)、天冬氨酸半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3,CASP3)、基質金屬蛋白酶-9(matrix Metalloproteinase-9,MMP9)等,見表2。

表1 牛舌草中活性成分

續表1 牛舌草中活性成分

表2 拓撲學篩選的關鍵靶點

圖2 牛舌草潛在靶點PPI網絡圖

2.3牛舌草治療CIRI靶蛋白模塊分析 應用MCODE算法分析牛舌草潛在治療CIRI靶點,識別疾病靶蛋白相互作用的功能模塊,如圖3所示。關鍵功能模塊A主要涉及TNF信號通路、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)信號通路、缺氧誘導因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)信號通路、白細胞介素17(interleukin 17,IL-17)信號通路等,如圖4所示。關鍵功能模塊B主要涉及磷脂酰肌醇-3-羥激酶-蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase-Akt,PI3K-AKT)信號通路、Toll樣受體(toll-like receptor,TLR)信號通路、趨化因子信號通路等,見表3。關鍵功能模塊C主要涉及T細胞受體信號通路、細胞凋亡、C型凝集素受體信號通路等,見表3。

表3 功能模塊KEGG和GO富集分析

A.關鍵功能模塊A;B.關鍵功能模塊B;C.關鍵功能模塊C。

圖4 功能模塊A KEGG和GO富集分析

2.4KEGG信號通路和富集分析 將牛舌草治療CIRI的潛在靶點導入DAVID數據庫,進行作用通路和生物過程分析。GO生物過程富集分析顯示,生物學過程主要包括肽基絲氨酸磷酸化調節、趨化因子產生調節、星形膠質細胞激活、一氧化氮生物合成調控、PI3K-AKT通路調節等,細胞組分主要包括過氧物酶體、內質網腔、溶酶體、神經元胞體等,以及分子功能主要包括NADP結合、一氧化氮合酶活性、趨化活性、蛋白酶結合等,如圖5A所示。KEGG信號通路分析顯示,牛舌草治療腦缺血-再灌注損傷作用通路主要涉及HIF-1信號通路、TNF信號通路、IL-17信號通路、Toll樣受體信號通路等,如圖5B所示。

A.GO生物過程分析;B.KEGG富集分析。

2.5牛舌草成分對疾病靶點的結合能力 牛舌草潛在治療CIRI靶點與相關化合物通過Discovery Studio 2019 Client進行分子對接,其中Rutin與MMP9、Narcissin與RAC-α絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(RAC-alpha serine/threonine-protein kinase,AKT1)、VEGF、IL-6、IL-1β等蛋白的結合能力高于內在配體,如表4、圖6所示。

表4 分子對接結果

A.Rutin與MMP9;B.Narcissin與AKT1;C.Ternatumoside II與MAPK3;D.Narcissin與VEGF。

3 討論

近年來,研究者對治療CIRI做出了許多探索,發現各種不同治療機制的藥物,以期滿足臨床治療的需求,但是CIRI涉及多種病理機制,包括氧化應激、炎癥反應、細胞凋亡、血腦屏障破壞和線粒體功能障礙等,現有藥物難以達到臨床治療目標[28-30]。民族醫藥作為中醫藥重要組成部分,經過各民族不斷發展和應用,自身的價值在不斷被挖掘。牛舌草作為維吾爾族民族醫藥之一,長期應用于心腦血管疾病治療,但其藥效成分和具體治療機制尚不清楚。本研究通過動物實驗確證牛舌草對CIRI的治療作用,并采用網絡藥理學和分子對接技術探討牛舌草藥效成分與作用機制。

采用線栓法制備CIRI大鼠模型,缺血1.5 h再灌注24 h。CIRI模型對照組大鼠表現出明顯的運動失調且腦組織出現顯著梗死。牛舌草給藥治療能夠顯著改善腦缺血-再灌注引起的神經行為和運動功能障礙,減小腦梗死體積。

依據本研究的成分檢索策略和靶點篩選方法,利用網絡藥理學分析牛舌草活性成分靶點與CIRI靶點之間的關系,共獲得共有靶點143個,作為牛舌草治療CIRI的潛在靶點,如AKT1、MAPK3、IL-6、MMP9等,主要涉及炎癥因子、絲裂原活化蛋白激酶家族、基質金屬蛋白酶家族、血管內皮生長因子家族、氧化還原酶家族等。KEGG分析顯示,牛舌草治療腦缺血-再灌注損傷作用通路主要包括TNF信號通路、Toll樣受體信號通路、IL-17信號通路、AGE-RAGE信號通路等。

MMP9是一類Zn+依賴性蛋白水解酶,屬于基質金屬蛋白酶家族,由IV型膠原酶、層粘連蛋白和纖維連接蛋白組成[31]。在CIRI發生和發展中,腦組織損傷會釋放促炎癥因子,誘導MMP9表達增加,通過降解細胞外基質、破壞腦微血管和血腦屏障的結構完整性,導致繼發性腦水腫和腦損傷[31-32]。AKT屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白酶家族,是PI3K/AKT信號通路調節炎癥反應的樞紐[33]。CIRI會抑制PI3K激活,減少Akt磷酸化,誘導細胞凋亡因子、細胞色素C、NF-κB等釋放和激活,導致炎癥級聯反應和細胞凋亡[34-36]。MAPK屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白酶家族,可以將細胞外信號傳遞到細胞核,廣泛參與細胞內的各種信號傳遞過程[37]。在CIRI發展過程中MAPK3被激活,促進MAPK3磷酸化并激活MAPK2,誘導MAPK蘇氨酸/酪氨酸殘基磷酸化,與c-jun和c-Fos等轉錄因子相互作用,參與腦缺血-再灌注損傷的炎癥反應和細胞凋亡[38-39]。分子對接結果顯示,牛舌草中活性成分與其治療CIRI的潛在靶點MMP9、AKT1、MAPK3、VEGF等結合能力高于內在配體。由此可見,牛舌草可能通過調節上述靶點,發揮治療CIRI的作用。

綜上所述,本研究通過動物實驗模擬CIRI,確證了牛舌草對大鼠CIRI的治療作用,且采用網絡藥理學、分子對接、KEGG信號通路和富集分析等探索牛舌草分子網絡機制。研究表明,牛舌草可能通過調節MMP9、AKT1、MAPK3等多個疾病靶點,影響HIF-1信號通路、TNF信號通路、Toll樣受體信號通路等,調控炎癥級聯反應、氧化應激和細胞凋亡,減輕CIRI。該研究結果為后續牛舌草研究及臨床推廣提供了參考依據,但是對牛舌草化學成分研究有限,網絡預測結果多,具有一定的局限性和不足。