高效液相色譜法同時測定維藥香青蘭有效部位中10個化學(xué)成分的含量*

譚梅娥,何承輝,帕依曼·亥米提,鄭瑞芳,于寧,邢建國

(新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所新疆維吾爾藥實驗室,烏魯木齊 830011)

香青蘭(DracocephalummoldivacaL.)為新疆維吾爾族常用藥,其維吾爾名為巴迪然吉布亞[1-3],由于其特殊的香氣和有益于健康,當(dāng)?shù)厝顺⑵涞厣喜糠峙莶栾嫛＞S吾爾古典醫(yī)籍《阿里卡農(nóng)》中香青蘭主要用于安神補腦、鎮(zhèn)靜止咳、活血化瘀、通絡(luò)開竅、強心利尿[4-5]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,香青蘭用于治療冠心病、心絞痛、動脈粥樣硬化,具有抗氧自由基損傷,提高缺氧耐力,降血壓等作用[6-9],香青蘭中揮發(fā)油具有平喘、鎮(zhèn)咳、殺菌等功效[10-12]。《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·維吾爾藥分冊》收載的成方制劑中,含香青蘭的制劑有6種,主要用于心痛、心悸等治療,其單方制劑“益心巴迪然吉布亞顆粒”對冠心病具有良好的療效[13-15]。

香青蘭有效部位(effecive part ofDracocephalumMoldavicaL.)為香青蘭地上全草提取物的純化物。研究表明,香青蘭有效部位具有治療高血壓、高血脂、抗動脈粥樣硬化和保護心肌缺血-再灌注損傷等多種藥理作用,在防治心腦血管疾病方面具有廣闊的應(yīng)用前景[16-20]。目前,關(guān)于香青蘭中化學(xué)成分的研究較多[21-24],但對于香青蘭有效部位中化學(xué)成分的定量分析內(nèi)容較少。本研究在對香青蘭有效部位制備工藝及其主要成分分離鑒定的基礎(chǔ)上,建立了同時測定香青蘭有效部位中10個化學(xué)成分含量的測定方法,為后續(xù)香青蘭有效部位質(zhì)量控制及研究提供參考。

1 儀器與材料

1.1儀器 Agilent 1260型高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司);AB135-S型電子分析天平(梅特勒-托利多科技有限公司,感量:0.1 mg);KQ5200B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);WP-UP-WF-20型沃特浦微量分析型超純水機(四川沃特爾水處理設(shè)備有限公司)。

1.2材料 對照品:咖啡酸(批號:110885-200102,含量≥99.7%,中國食品藥品檢定研究院),4-香豆酸(批號:112037-201801,含量≥99.3%,中國食品藥品檢定研究院),木犀草苷(批號:111720-201408,含量≥94.9%,中國食品藥品檢定研究院),木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷(批號:111968-201602,含量≥97.7%,中國食品藥品檢定研究院),芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷(批號:P20N6F6297,含量≥98%,上海源葉生物科技有限公司),迷迭香酸(批號:111871-201706,含量≥90.5%,中國食品藥品檢定研究院),香葉木素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷(批號:PRF22051241,含量≥98%,成都普瑞法科技開發(fā)有限公司),丹酚酸A(批號:CFS201702,含量≥98%,Chem Faces),田薊苷(含量≥98%,上海同田生物技術(shù)股份有限公司),香葉木素(批號:CFS201702,含量≥98%,Chem Faces)。香青蘭藥材產(chǎn)自新疆維吾爾自治區(qū)瑪納斯縣,經(jīng)新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所何江研究員鑒定為唇形科青蘭屬一年生草本植物香青蘭,其有效部位為實驗室自制(香青蘭地上全草部分經(jīng)乙醇提取及大孔樹脂富集即得),批號分別為201801、201802、201803。乙腈均為色譜級(賽默飛世爾科技有限公司),無水乙醇為分析級(天津永晟精細化工有限公司),純凈水為實驗室自制。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 島津Shim-pack ODS (4.6 mm×250 mm,5 μm)色譜柱,流動相為乙腈 (A)-0.5%甲酸溶液 (B),梯度洗脫:0—30 min,17% A;30—60 min,17%→28% A;60—75 min,28%A,流速為1.0 mL·min-1;檢測波長為330 nm,柱溫為35 ℃,進樣量為10 μL。HPLC測定混合對照及樣品色譜圖見圖1。

1.咖啡酸;2.4-香豆酸;3.木犀草苷;4.木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷;5.芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷;6.迷迭香酸;7.香葉木素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷;8.丹酚酸A;9.田薊苷;10.香葉木素。

2.2溶液的制備

2.2.1對照品溶液制備 精密稱取各對照品適量,于25 mL量瓶中,加入70%乙醇溶液,超聲溶解,冷卻后定容,制備成咖啡酸、4-香豆酸、木犀草苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷、迷迭香酸、香葉木素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、丹酚酸A、田薊苷、香葉木素濃度分別為158.8、81.0、74.25、103.6、95.8、107.5、23.84、68.63、197.5、83.63 μg·mL-1的混合對照品儲備液。

2.2.2供試品溶液制備 取3個批次香青蘭有效部位樣品各約5 mg,精密稱定,置于10 mL量瓶中,加入70%乙醇溶液,超聲溶解,冷卻后定容,過孔徑0.22 μm濾膜,即得。

2.3方法學(xué)考察

2.3.1線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.1節(jié)”下制備的混合對照品儲備液0.25,0.5,1,2,4,8 mL置于10 mL量瓶中,定容,制備成不同濃度的對照品溶液。按照“2.1節(jié)”下色譜條件進樣,測定其峰面積并計算其回歸方程及r值,結(jié)果見表1。

表1 10個成分的線性關(guān)系與線性范圍

2.3.2精密度實驗 精密吸取混合對照品10 μL,按照“2.1節(jié)”下色譜條件進樣測定,在同一天內(nèi)連續(xù)重復(fù)進樣6次,測定10個成分峰面積并計算其RSD值。結(jié)果顯示:咖啡酸、4-香豆酸、木犀草苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷、迷迭香酸、香葉木素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、丹酚酸A、田薊苷、香葉木素峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)值均符合要求(表2),表明該儀器精密度良好。

表2 10個成分精密度、穩(wěn)定性的RSD值加樣回收率及其RSD值

2.3.3穩(wěn)定性考察 精密吸取同一份“2.2.2節(jié)”下制備的香青蘭有效部位供試品溶液(批號:201801),分別于0,2,4,6,8,12 h,按照“2.1節(jié)”下色譜條件進樣測定,記錄每次進樣后10個成分峰面積并計算其RSD值。結(jié)果顯示:咖啡酸、4-香豆酸、木犀草苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷、迷迭香酸、香葉木素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、丹酚酸A、田薊苷、香葉木素峰面積RSD值均符合要求(表2),表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4加樣回收率考察 精密稱取香青蘭有效部位(201801)浸膏粉(過三號篩)6份(各約2.5 mg),置10 mL量瓶中,分別添加27.64 μg·mL-1的咖啡酸對照品溶液55 μL,432 μg·mL-1的4-香豆酸對照品溶液26 μL,396 μg·mL-1的木犀草苷對照品溶液60 μL,207.2 μg·mL-1的木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷對照品溶液478 μL,38.32 μg·mL-1的芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷對照品溶液1 750 μL,205.2 μg·mL-1的迷迭香酸對照品溶液1 130 μL,119.07 μg·mL-1的香葉木素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷對照品溶液1 810 μL,366 μg·mL-1的丹酚酸A對照品溶液78 μL,209.6 μg·mL-1的田薊苷對照品溶液550 μL,452 μg·mL-1的香葉木素對照品溶液132 μL,分別加70%乙醇超聲溶解,冷卻后定容。按照“2.1節(jié)”下色譜條件進樣測定,記錄10個成分峰面積并計算其回收率。結(jié)果顯示:咖啡酸、4-香豆酸、木犀草苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷、迷迭香酸、香葉木素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、丹酚酸A、田薊苷、香葉木素回收率均在91.83%～106.43%,RSD值均符合要求(表2),結(jié)果表明樣品加樣回收率結(jié)果良好。

2.4樣品測定 分別精密吸取3個批次的樣品10 μL,按照“2.1節(jié)”下色譜條件進樣測定,記錄各成分峰面積,并計算各成分在3批樣品中的質(zhì)量分數(shù),色譜圖見圖2,質(zhì)量分數(shù)結(jié)果見表3。

表3 3個批次香青蘭有效部位中10個成分的含量測定

A.201801;B.201802;C.201803;1.咖啡酸;2.4-香豆酸;3.木犀草苷;4.木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷;5.芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷;6.迷迭香酸;7.香葉木素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷;8.丹酚酸A;9.田薊苷;10.香葉木素。

3個批次的香青蘭有效部位中10個成分的含量存在較小差別,表明香青蘭有效部位制備方法成熟穩(wěn)定,重復(fù)性好。10個成分中木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、迷迭香酸、香葉木素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷及田薊苷的含量相對較高,在后續(xù)基礎(chǔ)研究中可選用一個或多個成分進行質(zhì)量控制,由于田薊苷藥效明確而顯著,故建議選用田薊苷作為香青蘭有效部位質(zhì)量控制的標(biāo)志物。

3 討論

近年來,關(guān)于香青蘭對心腦血管作用機制研究較多,且發(fā)現(xiàn)其在治療心腦血管疾病方面具有較好的活性[25-29]。通過對香青蘭有效部位進行分離鑒定,發(fā)現(xiàn)其主要成分為黃酮類和酚酸類,但關(guān)于其化學(xué)成分同時分析測定的研究較少。本文建立了采用HPLC法同時測定香青蘭有效部位中咖啡酸、4-香豆酸、木犀草苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷、迷迭香酸、香葉木素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、丹酚酸A、田薊苷和香葉木素10個成分的含量。結(jié)果表明,該檢測方法快捷、簡便,具有較高的靈敏度、重復(fù)性和準(zhǔn)確性,香青蘭有效部位樣品在該色譜條件下分離度及穩(wěn)定性較好,10個化學(xué)成分的對照品溶液在設(shè)定濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。本文建立的方法可用于香青蘭有效部位中化學(xué)成分的含量測定,為提高香青蘭有效部位中已知化學(xué)成分含量提供理論基礎(chǔ),同時為后續(xù)香青蘭有效部位的深入研發(fā)和質(zhì)量分析及評價提供了參考。