基于不確定度評估研究ID-LC-MS/MS法檢測雞蛋中氟蟲腈砜殘留量的關鍵控制點

張巧艷,方維煥,鄭蔚然,王夏君,劉超綱, 王 強,

(1.浙江省農業科學院 農產品質量安全與營養研究所,浙江 杭州 310021; 2.浙江大學 動物科學學院,浙江 杭州 310058; 3.浙江省農業科學院 作物與核技術利用研究所,浙江 杭州 310021)

2017年,瑞士等15個歐盟國家和中國香港相繼在雞蛋中檢測出氟蟲腈,“毒雞蛋”事件發酵成為全世界范圍內的重大食品安全事件[1]。氟蟲腈曾是一種使用廣泛的苯基吡唑類殺蟲劑,因對蜜蜂、水生生物等造成嚴重毒害作用而被禁用于農業生產和畜禽養殖[2]。雞蛋中氟蟲腈的來源可能是養雞場非法使用氟蟲腈殺滅跳蚤、虱子而導致養殖環境污染;或者農田長期殘留氟蟲腈引起農作物污染,通過飼料進入蛋雞體內,然后轉移至雞蛋中。研究發現,氟蟲腈在雞蛋中的殘留標示物主要是其代謝物氟蟲腈砜,在殘留消除過程中氟蟲腈砜的含量常常遠高于氟蟲腈[3]。而且,氟蟲腈砜對肝細胞的毒性也強于原藥氟蟲腈。在降低細胞活力上,氟蟲腈砜比氟蟲腈強54倍;用乳酸脫氫酶(LDH)漏出率評估細胞損傷程度,氟蟲腈砜毒性是氟蟲腈的37倍[4]。雞蛋中氟蟲腈砜的精準檢測結果一定程度上可以反映氟蟲腈的污染水平和潛在風險。

方法驗證、不確定度評估和質量控制是確保可靠測量的關鍵,是檢測實驗室質控體系的重要組成部分[5]。檢測結果的不確定度來源于測量過程,體現測量值與標準值之間的統計學差異。一般認為,不確定度越小,所述結果與被測量的真值愈接近[6]。評估測量不確定度最常見的方法是“自上而下”法(Top-down)和“自下而上”法(Bottom-up)。前者主要使用實驗室現有的檢測數據和信息評定不確定度;后者需要對測量過程所有可能影響結果的因素進行系統的分析和不確定度評估[7]。國家有證標準物質具有準確、可靠的量值和計量溯源性,可用于測量不確定度評估、檢測質控和方法優化[8]。浙江省農業科學院通過藥代動力學實驗獲得天然的含氟蟲腈砜的雞蛋液,經冷凍干燥、磨粉過篩、輻照滅菌等步驟將其加工成雞蛋粉,經均勻性檢驗、穩定性檢驗、多家實驗室聯合定值,以及不確定度分析,研制了雞蛋粉中氟蟲腈砜殘留分析標準物質。該產品已獲批為國家二級標準物質,編號為GBW(E)100779。

鑒于高通量凈化設備設計需求,浙江省農業科學院開發了一種多功能凈化柱(PAC柱),可實現雞蛋提取液的一步直通式凈化,并基于同位素稀釋液相色譜串聯質譜法(ID-LC-MS/MS)建立了氟蟲腈、氟蟲腈砜、氟蟲腈亞砜和氟甲腈同步快速檢測方法,方法的準確度、靈敏度和精密度能夠滿足雞蛋樣品氟蟲腈及其代謝物殘留檢測需求[9]。同位素稀釋質譜法是國際計量組織公認的基準測量方法之一,可用于提供較高準確度和精密度,以及較小不確定度的檢測結果。它測量的不是單純的濃度,而是樣液中目標物與內標的摩爾數量的比值[10]。本研究以GBW(E)100779為測試樣,先加水復原成雞蛋液,再用乙腈提取,用PAC柱凈化,結合ID-LC-MS/MS法進行氟蟲腈砜的殘留檢測,基于“自下而上”法開展測量不確定度評估,詳細探討影響檢測結果準確性的主要因素,為雞蛋精準檢測的質量控制提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試劑、材料和儀器

雞蛋粉中氟蟲腈砜殘留分析標準物質[GBW(E)100779]來自浙江省農業科學院/浙江大學;乙腈中氟蟲腈砜溶液標準物質[GBW(E)084271]來自浙江省農業科學院;將氟蟲腈砜-13C6標準品(純度99.8%,上海安譜實驗科技股份有限公司)用乙腈稀釋成質量濃度為2 μg·mL-1的穩定同位素稀釋劑(內標溶液);甲醇、乙腈(色譜純,德國默克集團);氯化鈉、無水硫酸鈉(分析純,上海凌峰化學試劑有限公司);PAC多功能凈化柱(200 mg,3 mL,自制)[9];萬分之一天平(美國康州HZ電子有限公司);UltiMate 3000液相色譜-TSQ Quantum Discovery三重四極桿質譜聯用儀(賽默飛世爾科技)。

1.2 標準工作溶液制備

用1 mL移液槍準確吸取1.00 mL氟蟲腈砜溶液標準物質置于100 mL容量瓶中,用乙腈定容,搖勻,從中準確吸取0.50 mL置于另一100 mL容量瓶中,用乙腈定容,搖勻,獲得氟蟲腈砜質量濃度為5.00 μg·L-1的標準工作溶液。接著,用10 mL移液管分2次準確吸取20 mL標準工作溶液置于棕色樣品瓶中,用100 μL移液槍準確吸取50 μL內標溶液加入標準工作溶液中,搖勻,配制成同位素稀釋的氟蟲腈砜單點校準標準工作溶液。

1.3 樣品前處理

將雞蛋粉從冰箱中取出,恢復至室溫。用萬分之一天平稱取1.25 g雞蛋粉(精確到0.000 1 g)置于50 mL塑料離心管中,加入3.75 g純凈水,渦旋振蕩1 min,超聲10 min,30 ℃避光水浴1 h,復原成5 g雞蛋液。

用10 mL移液管分2次準確吸取20 mL乙腈加入雞蛋液中,渦旋振蕩1 min,超聲30 min。用100 μL移液槍準確吸取50 μL內標溶液加入提取液中,渦旋振蕩30 s。加入2 g 氯化鈉和6 g無水硫酸鈉,渦旋振蕩1 min,6 200×g離心5 min,獲得上清液。用移液槍吸取2 mL上清液,利用重力作用通過PAC柱,加壓擠干填料,完全收集流出液,過0.22 μm微孔濾膜,待上機測定[9]。

1.4 色譜質譜條件

色譜柱:ACE Excel 2 C18柱(2.1 mm×100 mm,2 μm);柱溫:35 ℃;流動相:A相為水,B相為甲醇,梯度洗脫,0～4.0 min(40% A～ 10% A),4～5.5 min(10% A),5.5～7.0 min(10% A～40% A),7.0～10.0 min(40% A);流速0.25 mL·min-1,進樣量5 μL。

質譜系統使用電噴霧離子源,負離子模式掃描(ESI-),氬氣為碰撞氣,氮氣為鞘氣和輔助氣。毛細管電壓3 800 V,鞘氣25 arb,輔助氣4 arb,碰撞氣2 mTorr,離子源溫度320 ℃。采用選擇反應監測(SRM),氟蟲腈砜:m/z450.9>281.8(10 eV)、m/z450.9>243.8(66 eV);氟蟲腈砜-13C6:m/z456.9>287.8(10 eV)、m/z456.9>249.8(66 eV)。

2 結果與分析

2.1 測量不確定度評估

雞蛋液加工成雞蛋粉,實測脫水率為75%,即1.25 g雞蛋粉[GBW(E)100779]加入3.75 g水可復原成5 g雞蛋液。在前處理過程中,雞蛋液中的水分經氯化鈉鹽析后與乙腈相分離,被無水硫酸鈉吸附,將氟蟲腈砜及其內標物轉移至乙腈相中。在優化條件下,雞蛋粉中的氟蟲腈砜被乙腈充分提取,通過單點比較法可以獲得提取液中氟蟲腈砜的濃度,從而計算出雞蛋粉中氟蟲腈砜的殘留量。計算公式推導如下:

(1)

(2)

檢測結果以雞蛋粉計,雞蛋液中的水分對量值無影響。由公式(2)可知,在定值過程中,同位素內標濃度c和樣品提取溶劑體積V沒有參與結果的計算。峰面積的測量重復性是由儀器的隨機誤差造成的。針對某次測量,當檢測儀器固定時,檢測質量主要依賴于前處理過程。在儀器條件滿足檢測要求且氟蟲腈砜完全提取的前提下,測量不確定度主要由以下4部分引入,按JJF 1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》[11]進行各部分的不確定度評定。

2.1.1 標準工作溶液濃度引入的不確定度

氟蟲腈砜溶液標準物質GBW(E)084271具有相對較小的不確定度,其量值可溯源至澳大利亞國家計量研究院的氟蟲腈砜純度標準物質NMIA P1731。檢測過程以GBW(E)084271[相對擴展不確定度為2%(k=2)]為參考物質,由此引入的相對不確定度為:

稀釋過程帶來的不確定度主要來自各種移液器具的承載體積。本研究所用的容量瓶和移液管均為A級器具,其他移液器具均檢定合格。按JJG 646—2006《移液器檢定規程》[12]和JJG 196—2006《常用玻璃量器檢定規程》[13]確定容量允差,重復測定10次獲得重復性標準偏差,由各種體積引入的不確定度分量匯總于表1中。容量瓶體積帶來的不確定度主要來源于溫度變化對溶劑乙腈的影響。制備標準工作溶液或者溶液標準物質時,選擇室溫變化較小的實驗環境,有利于縮小不確定度。通過兩步稀釋將參考物質(100 μg·mL-1)制備成標準工作溶液(5 μg·L-1),稀釋過程引入的相對不確定度計算如下:

表1 各種體積引入的不確定度及其來源匯總Table 1 Uncertainties caused by volumes and their sources

氟蟲腈砜標準工作溶液濃度引入的相對不確定度來自參考物質及其稀釋過程,合成如下:

2.1.2 標準工作溶液移取體積引入的不確定度

單點校準標準工作溶液由20 mL標準工作溶液和50 μL內標溶液混合制備而成,兩者的體積比是400∶1。標準工作溶液移取體積的少量偏差(±0.5 mL)對單點校準標準工作溶液中氟蟲腈砜的濃度幾乎無影響,但會通過影響內標的濃度影響最終檢測結果。制備時,選擇實驗室常用的10 mL分度移液管,分2次吸取標準工作溶液,合成的相對不確定度為:

2.1.3 內標溶液添加體積引入的不確定度

同位素稀釋質譜法是在試樣中加入已知量的、與被測元素相同但同位素豐度不同的物質(簡稱“稀釋劑”),混合均勻達到平衡后,用質譜測量混合試樣中被測元素的同位素豐度比值,由此計算出被測元素的含量。雞蛋粉中氟蟲腈砜殘留分析標準物質用ID-LC-MS/MS法檢測時,在20 mL的標準工作溶液和樣品乙腈提取液中分別加入50 μL穩定同位素稀釋劑,由此引入的相對不確定度為:

2.1.4 雞蛋粉樣品稱樣量引入的不確定度

2.1.5 關鍵控制點分析

在測量不確定度評估中,通常使用石川圖(Ishikawa diagram),又名魚骨圖(Fish-bone diagram),詳盡展示測量不確定度分量的來源,反映可能影響整個檢測過程的潛在參數[14]。由圖1可見,雞蛋粉中氟蟲腈砜殘留檢測的不確定度主要有4個分量,定值結果的測量不確定度計算模型及其結果如下:

圖1 ID-LC-MS/MS法檢測雞蛋粉中氟蟲腈砜的不確定度評估魚骨圖Fig.1 Fish-bone diagram of uncertainty evaluation on determination of fipronil-sulfone in egg powder by ID-LC-MS/MS

k為包含因子,對應置信概率95%,一般取k=2。則檢測結果的相對擴展不確定度為:

U定值,rel=k×u定值,rel=2×3.6%=7.2%。

以每個分量的平方占所有分量平方和的百分比計算各不確定度分量的貢獻率。由圖2可見,檢測結果的主要不確定度來源于內標溶液添加體積,貢獻率為68.59%。因此,添加內標過程是雞蛋粉中氟蟲腈砜ID-LC-MS/MS法測定的關鍵控制點。從表1可知,刻度誤差、測量重復性、溫度波動都可能引起體積偏差,最終影響檢測結果。內標溶液的添加體積相對較小,且溶劑乙腈容易揮發,常規檢測時一般使用移液槍快速移取、直接添加。100 μL移液槍檢定合格的容量允差范圍相對較大,是導致50 μL體積引入的不確定度偏大的主要原因。移液槍使用前進行移取體積的準確性校正,可以確保檢測結果更接近真值。20 ℃時,水的體積膨脹系數為2.1×10-4℃-1,約為乙腈的六分之一。當內標的溶劑更換為水后,移取體積因受溫度波動而對不確定度的貢獻會明顯減小。若用不易揮發的溶劑(例如水)稀釋內標,降低不確定度的方法還可以考慮用質量代替體積[15]。

Cs,標準工作溶液濃度對合成不確定度的貢獻率;Vs,標準工作溶液移取體積對合成不確定度的貢獻率;vi+vsi,內標溶液添加體積對合成不確定度的貢獻率;m,樣品稱樣量對合成不確定度的貢獻率。Cs, Vs, vi+vsi and m were the contribution ratio of the concentration of standard working solution, the transferred volume of standard working solution, the added volumes of internal standard solution and the weighting of sample, respectively.圖2 ID-LC-MS/MS法檢測雞蛋粉中氟蟲腈砜的不確定度分量貢獻圖Fig.2 Contribution of each component in the combined uncertainty for determination of fipronil-sulfone in egg powder by ID-LC-MS/MS

用萬分之一天平(特種準確度級)稱量雞蛋粉(1.25 g左右)帶來的不確定度幾乎可以忽略不計(圖2)。當樣品為均質的雞蛋液(5 g左右)時,用萬分之一天平稱量,檢測結果以雞蛋液計,稱量帶來的不確定度小于雞蛋粉,其他測量不確定度分量的貢獻率與雞蛋粉一致。

2.2 參考基準材料評估

氟蟲腈砜單點校準標準工作溶液由參考物質、稀釋劑和內標溶液混合制備而成。制備前用LC-MS/MS對上述材料進行分析。由圖3可知,稀釋劑乙腈(也是樣品提取溶劑)中不存在氟蟲腈砜和氟蟲腈砜-13C6;參考物質[GBW(E)084271]中存在氟蟲腈砜,無氟蟲腈砜-13C6;內標溶液中存在氟蟲腈砜-13C6,無氟蟲腈砜。這些材料在使用時互不干擾,不會給氟蟲腈砜及其內標的濃度準確性帶來風險,也不會給樣品提取及其內標添加過程增加額外的不確定性因素。雞蛋粉[GBW(E)100779]經乙腈提取、PAC柱凈化后,用LC-MS/MS分析,獲得的色譜與質譜特征與圖3-B一致;用ID-LC-MS/MS法檢測,提取液經同位素稀釋、PAC柱凈化后進行分析,能夠獲得與圖3-B、圖3-C特征一致的色譜圖和質譜圖。

A,稀釋劑(乙腈);B,參考物質[GBW(E)084271];C,內標溶液(氟蟲腈砜-13C6)。1和2分別為針對氟蟲腈砜的提取離子色譜圖和質譜棒狀圖,3和4分別為針對氟蟲腈砜-13C6的提取離子色譜圖和質譜棒狀圖。A, Diluent solvent (acetonitrile); B, Reference material [GBW(E)084271]; C, Internal standard solution (fipronil-sulfone-13C6). 1 and 2, The extracted ion chromatogram and mass spectra centroid for fipronil-sulfone; 3 and 4, The extracted ion chromatogram and mass spectra centroid for fipronil-sulfone-13C6.圖3 用于氟蟲腈砜檢測的參考物質、稀釋劑和內標溶液LC-MS/MS圖Fig.3 LC-MS/MS profiles of reference material, diluent solvent and internal standard solution for the fipronil-sulfone detection

2.3 前處理方法評估

氟蟲腈砜的完全提取是準確反映雞蛋粉中氟蟲腈砜殘留量的首要條件,也是有效地測量不確定度評估的前提。乙腈對氟蟲腈及其代謝物具有極好的溶解能力,還可以沉淀大部分蛋白質,有利于釋放目標物,減少提取過程中的乳化現象[9]。本研究以GBW(E)100779為測試樣,以乙腈為提取溶劑,輔助超聲提取。由表2可見,超聲提取5 min,雞蛋粉中氟蟲腈砜的含量平均值略偏小,相對標準偏差(RSD)較大。延長超聲時間至10 min,提取得率明顯增加。超聲30 min時檢測結果最高,6次測量的平均值與GBW(E)100779的標準值(77 μg·kg-1)最接近,而且RSD相對較小,可視為雞蛋粉中的氟蟲腈砜已被提取完全。當用空白雞蛋粉加標制備質控樣用于提取效果比較時,不同超聲時間對檢測結果無顯著性差異。

表2 不同超聲時間下提取的雞蛋粉(GBW(E)100779)的ID-LC-MS/MS檢測結果Table 2 Test results of egg powder (GBW(E)100779) by ID-LC-MS/MS after extraction for different ultrasonic times

雞蛋粉乙腈提取液中含有除目標物之外的蛋白質、脂肪、色素等雜質,需經凈化處理,以減少它們對儀器的污染和對檢測靈敏度的影響。PAC柱是一種多功能凈化柱,可用于雞蛋提取液的快速直通式凈化,以去除主要的雜質,使進樣液中氟蟲腈砜和內標的基質效應均能同步滿足檢測要求[9]。同位素稀釋質譜法可以恰當地消除凈化過程的損失,以及伴隨復雜基質的基質效應對準確測量的影響[15]。基于PAC柱的凈化程序不會影響檢測結果的準確性。

3 結論

本研究基于國家有證標準物質[GBW(E)100779]建立了ID-LC-MS/MS法檢測雞蛋粉中氟蟲腈砜殘留量的測量不確定度評估模型,系統分析了影響檢測結果準確性的主要因素,得出以下結論:參考基準的合理選擇和目標物的完全提取是準確測量的前提,同位素內標的精準添加是獲得可靠結果的關鍵。針對動物源性食品中的污染物,通過代謝試驗和加工處理,研制與天然陽性樣品基本一致的標準物質,可逐步替代傳統外加標的質控樣,有效用于檢測方法的優化和檢測質量的評估。