幽門螺桿菌代謝物拮抗宿主先天免疫的機制研究

陳智 林煥雄 楊惠鈿

（1.潮州市中心醫院消化內科，潮州 521021；2.潮州市湘橋區中醫院檢驗科，潮州 521000）

幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，H.pylori）感染了世界上一半以上的人口［1］。H.pylori感染的流行率和H.pylori毒力因子的主要基因型在不同地理區域差異很大［2］。H.pylori可以在惡劣的胃環境中持續數十年，其可破壞胃黏膜并改變胃激素釋放模式，從而影響胃生理。通過利用各種毒力因子，H.pylori靶向不同的細胞蛋白調節宿主先天免疫反應（包括炎癥反應），并啟動對胃黏膜的多次打擊，導致慢性胃炎和消化性潰瘍［3］。H.pylori感染的長期后果之一是胃惡性腫瘤，特別是胃癌和胃黏膜相關淋巴組織（MALT）淋巴瘤［4］。因此，H.pylori已被國際癌癥研究機構認定為Ⅰ類致癌物［5］。盡管H.pylori感染與感染部位被抑制的先天免疫之間存在密切的因果關系，但該過程所涉及的確切機制尚不明確。可以通過改變其表面分子逃避先天免疫受體的識別［6］。H.pylori還可通過抑制下游信號通路阻斷其他先天識別受體。另一方面，H.pylori能夠通過調節T淋巴細胞功能逃避宿主適應性免疫［7］。微生物代謝物與宿主先天免疫系統之間動態相互作用，并在維持微環境穩態和抑制炎癥方面發揮關鍵作用［8］。然而，H.pylori的代謝物是否參與宿主的先天免疫仍未清楚。基于此，本研究旨在探討H.pylori代謝物拮抗宿主先天免疫的潛在機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人胃黏膜細胞GES-1購自北京欣盛百泰科技有限公司（貨號：SC135）；L-谷氨酰胺購自廣州小凡科技有限公司（貨號：76523-100MG）；DMEM培養基購自廣州碩譜生物科技有限公司（貨號：D917531-500ml）；脂多糖（LPS）購自上海源葉生物科技有限公司（貨號：S11060-100mg）；H.pyloriJP26菌株受贈于中國科學院微生物所；新生小牛血清購自廣州市欣福聯生物科技有限公司（貨號：16010-159）；TRIzol試劑購自杭州新景生物試劑開發有限公司（貨號：5301100）；NF-κB熒光素酶報告載體購自YEASEN公司（貨號：11501ES03）；RNeasy試劑盒購自廣州譽維生物科技儀器有限公司（貨號：74124）；TNF-α ELISA試劑盒、IL-6 ELISA試劑盒購自廣州俊吉生物科技有限公司（貨號：HM10001、BO60009）；IL-8 ELISA試劑盒購自北京冬歌博業生物科技有限公司（貨號：DG10305H-48T）；2-D-吡喃葡萄糖（2-D-Glucopyranose，2DG）購自北京奇松生物科技有限公司（貨號：BQS145219-1g）；本研究所用的TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10敲除GES-1細胞系由上海朝瑞生物科技有限公司進行敲除。TLR1、TLR2和GAPDH抗體購自Abcam公司（貨號：ab68158、ab209216、ab8245）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養與處理 胃黏膜細胞GES-1培養于含有10%FBS、2 mmol/L L-谷氨酰胺、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養基。使用終濃度為100 ng/ml的LPS處理GES-1細胞。

1.2.2H.pylori的培養 在37 ℃的微需氧條件下，H.pyloriJP26菌株在布魯氏菌肉湯液體培養基或瓊脂平板上生長，輔以10%新生小牛血清。

1.2.3 RNA測序 TRIzol試劑裂解僅LPS刺激的GES-1細胞、LPS與H.pylori培養上清共同處理的GES-1細胞及未處理的GES-1細胞。使用RNeasy試劑盒提取總RNA。RNA的質量用2100 Bioanalyzer檢測，定量用NanoDrop 2000檢測。選擇RNA完整性數（RIN）≥8的RNA樣品制備文庫。RNA-Seq文庫使用TruSeq?RNA Library Prep Kit v2進行。在HiSeq 2500（Illumina）中對文庫進行雙端測序（2×150 bp）。在數據分析之前，根據3個標準去除污染的原始reads：①去除帶有adapter的reads：包含超過5個adapter污染堿基的reads被認為是adapter污染的reads，將被過濾掉；②排除頻率＞5%的未識別堿基的reads；③排除低質量的reads：低質量堿基數（Phred Quality 值＜19）占總堿基數15%以上的reads被視為低質量reads。剩余的reads被認為是“干凈的reads”用于生物信息學分析。使用Fisher精確檢驗進行通路富集分析，然后使用基于KEGG通路的Benjamini & Hochberg檢驗，使用每個腫瘤的差異表達基因。FDR＜0.05的通路被認為是顯著富集的通路。

1.2.4 NF-κB活性的檢測 通過由NF-κB熒光素酶報告載體驅動的熒光素酶產生來測量H.pylori代謝物或16 h的H.pylori培養上清對NF-κB通路活性的影響。將15 μl GeneJuice在250 μl DMEM中在25 ℃下平衡 5 min，加入2 μg報告質粒并再孵育15 min，然后將混合物添加到約5×106個GES-1細胞中。立即將細胞接種于96孔板中，并使其黏附長達24 h。將H.pylori代謝物或不同濃度的2DG或LPS添加到新鮮培養基的細胞中。4～16 h后，根據制造商的說明使用商業試劑測量熒光素酶活性，并使用Wallac Victor2光度計從重復的孔中評估發光。

1.2.5 TNF-α、IL-6和IL-8分泌水平的檢測 ELISA檢測不同條件處理后GES-1細胞培養上清中TNF-α、IL-6和IL-8的分泌水平。

1.2.6 免疫共沉淀和免疫印跡 將2DG處理或不處理的GES-1細胞在Hanks緩沖液中充分洗滌，并用1 ml預冷的裂解緩沖液［20 mmol/L Tris（ pH=8）、137 mmol/L NaCl、1%Triton X-100、2 mmol/L EDTA、10%甘油］裂解蛋白酶抑制劑PMSF（1 nmol/L）、亮肽素和抑肽酶（10 μg/ml）。裂解物以10 000 g離心5 min，收集上清液并與20 μl TLR1或TLR2抗體在4 ℃下孵育1 h。將沉淀在缺乏蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液中徹底洗滌，并通過SDS-PAGE在10%聚丙烯酰胺凝膠和蛋白質印跡上進行分析。使用抗TLR1、TLR2或GAPDH抗體孵育過夜后，以HRP偶聯的羊抗兔多克隆抗體孵育1 h，進行化學發光分析。

1.2.7 非靶向代謝質譜 收集培養4 h（對照組）和16 h（實驗組）的H.pylori培養上清。將含有2 μg/ml L-2-氯苯丙氨酸作為內標的1 ml提取溶液（乙腈∶甲醇∶水=2∶2∶1）加入H.pylori上清中。渦旋振蕩30 s后，將樣品在40 Hz頻率下均質化4 min，然后在冰水浴中超聲處理10 min。均質化和超聲處理循環重復3次。將樣品于-40 ℃下孵育1 h，并在4 ℃下以10 000 r/min離心15 min。將總共800 μl上清液轉移到新的試管中，并于37 ℃的真空濃縮器中干燥，然后冰上超聲處理10 min，將干燥的樣品在200 μl 50%乙腈中復溶，4 ℃下13 000 r/min離心15 min，并將75 μl上清液轉移到新的玻璃小瓶中進行LC/MS分析。MS原始數據文件隨后由ProteoWizard轉換為mzXML格式，并由R包“xcms”處理。該過程包括峰解卷積、對齊和積分。Minfrac和截止分別設置為0.5和0.3。內部MS2數據庫用于代謝物鑒定。缺失值被最小值的一半填充。將數據進行log2轉換，然后進行總離子電流歸一化。

1.2.8 分子對接 所有分子對接研究均使用AutoDock 4.2.6軟件包進行。從RCSB蛋白質數據庫（https：//www.rcsb.org/）中檢索到TLR2的晶體結構（ID：6NIG）。該結構是通過添加氫原子、去除水和添加Gasteiger電荷制備的。2DG的三維結構取自chemspider（https：//www.chemspider.com/），ID為71358，通過添加氫原子和Gasteiger電荷制備。使用Propka 3.1在pH=7下測定受體蛋白和VP的質子化狀態。然后將配體以默認參數對接到TLR2的結合位點，并導出20個對接結構以進行進一步的視覺分析。使用AutoDock 4.2計算每個結構的對接分數。結合自由能使用分子力學/泊松-玻爾茲曼表面積（MM-PBSA）方法計算。使用PyMOL 2.4.0（https：//pymol.org/2/）構建2DG與TLR2對接結果的最佳結合結構。

1.3 統計學分析 所有統計分析均使用R軟件包進行。兩組間比較采用雙尾t檢驗。多組間比較采用方差分析，差異有統計學意義后，其兩組間比較采用雙尾t檢驗，P值經Bonferroni法校正。P＜0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1H.pylori代謝物抑制GES-1細胞的NF-κB通路 相較于僅LPS刺激的GES-1細胞，LPS與H.pylori培養上清共同處理后，多種基因的表達水平受到調控，并趨于未處理的GES-1細胞水平，見圖1A。通路富集分析發現，上述基因主要存在于NF-κB通路，主要包括CCL2、CCL20、CCL4、CCL5、CCND1、CCNL1、CCRL2、CD44、CD69、CD80、CD83、CEBPD、CFLAR、CLCF1、CSF1、CSF2、CXCL1、CXCL10、CXCL11、CXCL2、CXCL3、CXCL6、CXCR7、CYR61、DDX58、DENND5A、FJX1、IFIH1、IFIT2、IFNGR2、IL8、IL15RA、IL18、IL1A、IL1B、IL23A、IL6、IRF1、IRS2、JAG1、JUN、KLF4、KLF6、KLF9、KYNU、LAMB3、MAP3K8、MARCKS、MCL1、NFAT5、OLR1、REL、RELA、RELB、RHOB、RIPK2、SMAD3、SNN、SOCS3、SOD2、TANK、TAP1、TNC、TNF、TNFAIP2、TNFAIP3、TNFAIP6、TNFAIP8、TNFRSF9、TNFSF9、TNIP1、TNIP2、TRAF1，存在于NF-κB通路的下游，見圖1B。LPS與H.pylori培養上清共同處理后，NF-κB通路的活性受到抑制（P＜0.05，圖1C）。使用3KD超濾管過濾H.pylori培養上清，并采用過濾的濾液（代謝物部分）和截留的溶液（蛋白部分）處理LPS刺激的GES-1細胞，發現3KD超濾管過濾的濾液（代謝物部分）能夠抑制NF-κB通路活性（P＜0.05，圖1D）。此外，H.pylori代謝物能夠抑制NF-κB的磷酸化，見圖1E。同時，H.pylori代謝物能夠抑制NF-κB通路效應因子TNF-α、IL-6和IL-8的分泌（P＜0.05，圖1F～H）。

圖1 幽門螺桿菌代謝物抑制GES-1細胞的NF-κB通路Fig.1 Helicobacter pylori metabolites inhibits NF-κB pathway of GES-1 cells

2.2 2 DG抑制GES-1細胞的NF-κB通路 將H.pylori代謝物進行非靶向代謝質譜，相比于對照組（培養4 h的H.pylori代謝物），培養16 h的H.pylori代謝物中有32種滿足以下條件：①表達上調；②具有統計學意義，見圖2A。在LPS處理的同時，將上述代謝物以5 μmol/L處理GES-1細胞，發現2DG處理后，GES-1細胞中NF-κB通路活性受到抑制（圖2B）。在LPS處理的同時，使用1、5、25 μmol/L 2DG處理后，GES-1細胞中NF-κB通路活性均受到抑制（圖2C）。在LPS處理的同時，1、5、25 μmol/L 2DG處理后，GES-1細胞中NF-κB通路效應因子TNF-α、IL-6和IL-8的分泌受到抑制（P＜0.05，圖2D～F）。在LPS處理的同時，1、5、25 μmol/L 2DG均可抑制NF-κB的磷酸化，見圖2G。

圖2 2DG抑制GES-1細胞的NF-κB通路Fig.2 2DG inhibits NF-κB pathway of GES-1 cells

2.3 2 DG拮抗宿主TLR2分子抑制NF-κB通路識別細菌刺激的先天免疫系統主要是TLR受體家族，且TLR受體家族是NF-κB通路的上游。因此，本研究構建了TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10敲除的胃黏膜細胞GES-1細胞系。使用LPS處理后，相對于對照組（Parent組），TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6、TLR9、TLR10敲除的GES-1細胞中NF-κB活性顯著降低（P＜0.05）；而TLR3、TLR7、TLR8敲除的GES-1細胞中NF-κB活性無顯著變化。在LPS處理的同時使用2DG或H.pylori培養上清處理后，TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10敲除的GES-1細胞中NF-κB活性顯著降低（P＜0.05）；而TLR1和TLR2敲除的GES-1細胞中NF-κB活性無顯著變化（圖3A）。使用2DG處理后，GES-1細胞中TLR1和TLR2的相互作用均減弱（圖3B、C）。通過分子對接發現，2DG能夠與TLR2氨基酸殘疾R321、K347、F349結合，結合能為-12 kcal/mol（圖3D）。構建TLR2野生型和突變型質粒（R321K、K347R、F349A），并分別轉染TLR2敲除的GES-1細胞，在LPS處理的同時使用2DG或H.pylori培養上清處理后并不能減少轉染TLR2突變型GES-1細胞的NF-κB活性（圖3F）。

3 討論

在本研究中，H.pylori代謝物2DG能夠抑制NF-κB通路活性，抑制NF-κB磷酸化，抑制NF-κB通路效應因子TNF-α、IL-6和IL-8的分泌。有研究發現，H.pylori利用Ⅳ型分泌系統（T4SS）將CagA注入宿主胃上皮細胞，并通過激活NF-κB通路誘導炎癥反應［9］。CagA是一種蛋白，應在3KD超濾管過濾的截留的溶液中（蛋白部分）。但本研究的蛋白部分不能影響NF-κB通路的活性，而代謝物2DG抑制了NF-κB通路。不同H.pylori菌株之間存在異質性。在許多非洲國家發現H.pylori感染率高，但H.pylori相關疾病發病率低［10］。因此，本研究所使用的H.pyloriJP26可能并不表達CagA蛋白。研究發現，在接種H.pylori后第1天，小鼠NF-κB活性和炎癥反應顯著上升［11］。然而，在接種H.pylori后第30天或第135天，胃中NF-κB活性水平下降。因此，H.pylori急性感染和長期感染時，NF-κB活性水平有所差異。本研究所用的是體外培養的H.pylori，其抑制NF-κB活性的代謝物2DG是否在H.pylori長期感染中抑制NF-κB活性值得進一步探討。

在本研究中，使用LPS處理后，相對于對照組（Parent組），TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6、TLR9、TLR10敲除的GES-1細胞中NF-κB活性顯著降低；而TLR3、TLR7、TLR8敲除的胃黏膜細胞GES-1細胞中NF-κB活性無顯著變化。Toll樣受體（TLR）家族蛋白通過識別多種微生物分子（包括脂蛋白、脂肽、脂多糖、鞭毛蛋白和核酸）中的保守模式在先天免疫中發揮關鍵作用［12］。研究表明，TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6、TLR9、TLR10能夠識別細菌的模式識別受體，而TLR3、TLR7、TLR是識別病毒的基因組［13］。因此，TLR3、TLR7、TLR8敲除后，細菌獨有物質LPS刺激下NF-κB的活性水平無顯著差異。

TLR2與TLR1結合對于識別細菌脂蛋白和脂肽至關重要［14］。這些脂蛋白通過由脂質鏈修飾的保守N末端錨定在細胞膜上，并在巨噬細胞中誘導強烈的促炎信號［15］。TLR2缺陷小鼠對脂蛋白無反應，更容易患金黃色葡萄球菌引起的敗血癥、肺炎鏈球菌和單核細胞增生李斯特菌引起的腦膜炎，以及結核分枝桿菌感染［16］。因此，TLR2在細菌誘導的炎癥反應中具有不可或缺的作用。本研究發現2DG能夠與TLR2氨基酸殘疾R321、K347、F349結合。研究發現，TLR1和TLR2胞外域的異二聚化是介導NF-κB通路活化所必需的［17］。TLR1和TLR2氨基酸形成疏水、氫鍵和離子相互作用，穩定蛋白質異二聚體。其中，TLR2的R321會與TLR1的E321和E366形成離子鍵，TLR2的K347會與TLR1的T361和T363形成氫鍵，TLR2的F349會與TLR1的Y320和V339形成疏水鍵。因此，2DG打斷了這些鍵的形成，減少了TLR1和TLR2的相互作用，使TLR1-TLR2的異源二聚體不穩定，抑制了NF-κB通路活化。

綜上所述，H.pylori代謝物2DG能夠與TLR2相互作用，減少TLR2與TLR1異源二聚體的形成，抑制先天免疫NF-κB通路活性。