HMGB1-TLR4介導(dǎo)的NF-κB信號通路在腺苷預(yù)處理保護腦缺血再灌注損傷中的作用

張振祥 高守媛 栗延偉 季禾 譚軍

（1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三臨床學(xué)院，新鄉(xiāng) 453003；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院，新鄉(xiāng) 453003）

腦缺血再灌注損傷是缺血性腦卒中后，通過各種途徑疏通血管實現(xiàn)再灌注對腦組織再次的創(chuàng)傷，嚴重影響神經(jīng)功能的恢復(fù)，其發(fā)病機制錯綜復(fù)雜，主要涉及炎癥反應(yīng)、興奮性氨基酸毒性作用、細胞凋亡等，其中炎癥反應(yīng)在此過程中發(fā)揮的作用不容忽視［1-2］。因此，保護神經(jīng)功能的重要手段之一即是抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展；Toll樣受體廣泛存在于各種免疫細胞，作為模式識別受體是高遷移率族蛋白1（high mobility group box 1，HMGB1）的重要受體之一［3］；在炎癥反應(yīng)過程中，HMGB1主要通過與Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）、Toll樣受體2（Toll-like receptor 2，TLR2）相結(jié)合，從而激活下游信號通路，如胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶/蛋白激酶B、絲裂原活化蛋白激酶/細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶、髓樣分化因子（myeloid differentiation factor 88，MyD88）/核轉(zhuǎn)錄因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）等，進而誘發(fā)腫瘤壞死因子、IL-1、IL-6等炎癥因子的釋放［4-5］。HMGB1在腦組織中多種類型的神經(jīng)細胞中均有表達，當缺血性腦卒中發(fā)生后，缺血壞死的神經(jīng)細胞主動將HMGB1轉(zhuǎn)移至細胞間，通過特異性識別并結(jié)合TLR4，使NF-κB發(fā)生核轉(zhuǎn)移而被活化，引發(fā)一系列細胞炎癥因子的產(chǎn)生，刺激神經(jīng)發(fā)生炎癥反應(yīng)［6-7］。有動物實驗表明，HMBG1、TLR4、NF-κB信號通路參與了大鼠腦缺血再灌注損傷中的神經(jīng)炎癥反應(yīng)［8］。目前較多研究發(fā)現(xiàn)，腺苷作為一種內(nèi)源性核苷，在機體能量代謝過程中能夠減少氧自由基的產(chǎn)生，抑制細胞程序性死亡，保護血腦屏障，抑制炎癥因子釋放，對神經(jīng)功能起保護作用，但其具體機制尚不完善［9-11］。本實驗通過建立大鼠腦缺血再灌注損傷模型探討HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路在腦缺血再灌注損傷中的影響及腺苷預(yù)處理與該信號通路之間的聯(lián)系，為臨床研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 從新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院動物中心選取80只體質(zhì)量220～270 g的成年雄性SD大鼠，飼養(yǎng)環(huán)境通風良好，溫度、濕度適宜，食物水分充足，研究過程嚴格遵循實驗動物管理和保護相關(guān)規(guī)定，經(jīng)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究倫理委員會審核通過（新醫(yī)三附院倫審［K2021-038-01號］）。

1.1.2 實驗試劑及儀器 腺苷（北京索萊寶科技有限公司）；大腦中動脈閉塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）栓線（西濃科技有限公司）；2，3，5-氯化三苯基四氮唑粉劑（美國Sigma公司）；改進型檸檬酸鈉抗原修復(fù)液、DAB辣根過氧化物酶顯色試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司）；SP試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；NF-κB p65抗體、TLR4抗體、重組Anti-HMGB1抗體（南京川博生物技術(shù)有限公司）；Nikon顯微鏡（Nikon）；一體化智能蒸餾儀（山東濟南市盛泰有限公司）；HH600恒溫水浴箱（邦西儀器科技有限公司產(chǎn)品）；DHG-9055A鼓風干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 從80只SD大鼠中剔除實驗過程中造模失敗的11只，其余69只按照隨機原則，分為假手術(shù)組（F組）、缺血再灌注組（I/R組）、腺苷預(yù)處理組（AP組）共3組，每組23只。其中AP組大鼠在術(shù)前3 d腹腔注射腺苷注射液1.5 mg/kg，用2 ml生理鹽水稀釋后注射，1次/d；F組、I/R組大鼠術(shù)前3 d于相同條件下腹腔注射等量生理鹽水。

1.2.2 制備大鼠MCAO模型 I/R組、AP組于術(shù)前12 h禁食，術(shù)前4～6 h禁水，配制10%水合氯醛溶液，避光條件下用注射器抽取適量溶液（3 ml/kg），對大鼠進行腹腔注射麻醉，直至角膜反射消失，取仰臥位，用專用繃帶固定其四肢及頭部，用電動剃刀剔除大鼠頸部的背毛，然后進行局部皮膚消毒處理，沿頸正中線切開4 cm小口，逐層分離各層組織，使用玻璃分針鈍性分離血管、神經(jīng)，動作輕柔避免操作中大鼠神經(jīng)、血管斷裂導(dǎo)致大鼠死亡，充分暴露出大鼠的左頸總動脈（common carotid artery，CCA）、頸外動脈（external carotid artery，ECA）以及頸內(nèi)動脈（internal carotid artery，ICA），用小動脈夾臨時夾住ICA，用細線結(jié)扎CCA和ECA的近心端并在距CCA分叉處剪一斜行小口插入栓線，在CCA遠心端系牢栓線，松開小動脈夾，然后輕推栓線直至遇到輕微阻力，在CCA遠端用細線固定栓線避免脫出，消毒皮膚，縫合傷口，分籠飼養(yǎng)，2 h后將栓線輕輕拔出10 mm。操作全程用60 W白熾燈照射，使體溫保持在37 ℃。操作過程中密切觀察大鼠的生命體征，蘇醒后觀察大鼠右側(cè)肢體癱瘓程度，評估造模是否成功。F組大鼠僅暴露分離ICA、ECA、CCA而不結(jié)扎，其余操作步驟同AP組及I/R組。

1.2.3 神經(jīng)功能評分 參照LONGA等［12］的方法對各組大鼠進行神經(jīng)功能評分，0分：正常（無神經(jīng)功能損傷）；1分：提尾時大鼠對側(cè)（癱瘓側(cè)）前肢內(nèi)收屈曲（輕度神經(jīng)功能損傷）；2分：向癱瘓側(cè)旋轉(zhuǎn)爬行（中度神經(jīng)功能損傷）；3分：站立或爬行時，大鼠身體向癱瘓側(cè)傾倒（重度神經(jīng)功能損傷）；4分：意識障礙且無自主活動。將輕度、中度、重度神經(jīng)功能損傷的大鼠納入實驗，剔除評分0分、4分以及死亡的大鼠。

1.2.4 大鼠腦梗死體積計算 腦缺血再灌注24 h后隨機從每組大鼠中選取3只，同上述方法深部麻醉后，解剖腦組織，并將大腦組織放入-20 ℃的冰箱中冷凍30 min，然后植入腦切片模具中，沿冠狀軸將大腦切成2 mm厚的腦片，然后放入2%TTC染色劑中避光保存，37 ℃下孵育30 min，每5 min翻動1次，均勻染色后拍照記錄。使用Image J軟件準確測量出各組大鼠的腦梗死面積（S），參考公式：V=∑n（Sa+Sb）×d/2（其中V為腦梗死體積，n為腦組織切片的數(shù)量，Sa與Sb為同一腦片上下兩面的面積，d為腦片厚度），計算每組大鼠腦梗死體積。

1.2.5 標本的采集和處理 缺血再灌注2 h、6 h、24 h、48 h各取5只大鼠經(jīng)10%水合氯醛溶液深度麻醉后，仰臥于手術(shù)架上，開胸充分暴露心臟，剪開心包，血管鉗固定心臟，從心尖處插入穿刺針到主動脈并固定穿刺針，剪開右心耳后往心臟中反復(fù)注射4 ℃的生理鹽水，直至右心耳流出液變澄清，肺、眼珠及足部變白，隨即用冰凍4%多聚甲醛溶液灌注心臟至前肢、頸部僵硬，斷頭取腦，將腦組織于固定液中固定24 h，切取視交叉前后2 mm行脫水、透明、浸蠟、包埋、切片（厚約4 μm），于 4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 HE染色 將石蠟切片置于60 ℃恒溫箱中，2 h后取出，分別放入兩道二甲苯中，各需10 min，由高到低經(jīng)梯度濃度乙醇各浸泡5 min，然后用蒸餾水沖洗，再將切片放入蘇木素溶液中，7 min后用自來水沖洗，再經(jīng)1%鹽酸乙醇分化30 min，自來水沖洗返藍后再用蒸餾水沖洗，然后通過伊紅染液染色2 min，再經(jīng)過低濃度到高濃度乙醇各5 min，隨后經(jīng)兩道二甲苯透明，然后放置風干后用封片膠封片。將切片依次放在顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.2.7 免疫組化檢測各組大鼠腦組織HMGB1、TLR4、NF-κB的表達 石蠟切片脫蠟方法同HE染色，脫蠟后，經(jīng)磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L PBS）沖洗3次×5 min；然后將切片浸入改進型檸檬酸鹽修復(fù)液（1×）中，經(jīng)微波爐加熱至沸騰，持續(xù)亞沸騰10 min（95～98 ℃）后冷卻30 min；取出切片并滴加適量內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑覆蓋組織，然后放置于室溫環(huán)境下，10 min后用0.01 mol/L PBS緩沖液反復(fù)沖洗3遍×3 min；取出切片并滴加100 μl正常山羊血清工作液封閉覆蓋組織，室溫環(huán)境下放置，10 min后倒去血清，滴加稀釋后的一抗（兔抗HMGB1、兔抗TLR4、兔抗NF-κB），37 ℃環(huán)境下放置60 min后用0.01 mol/L PBS緩沖液反復(fù)沖洗3遍×3 min；取出切片，滴注適量的生物素標記山羊抗兔IgG聚合物覆蓋組織，室溫環(huán)境下放置，10 min后用0.01 mol/L PBS緩沖溶液反復(fù)沖洗3遍×3 min；取出切片并滴加適量辣根酶標記的鏈霉親和素工作溶液，室溫下放置10 min。0.01 mol/L PBS緩沖液反復(fù)沖洗3遍×3 min；加入新制備的DAB彩色溶液并在室溫下孵育8 min。流動水沖洗后放入蘇木素染液中染色20 s，同HE染色依次分化、返藍、脫水、透明、封片。所用切片均通過低倍鏡（×100）隨機定位于額頂葉梗死周邊區(qū)，即缺血半暗帶，然后置于高倍鏡（×400）下選取不連續(xù)的5個視野采集圖像，用ImageJ 1.53e圖像處理軟件計算每張圖片HMGB1、TLR4、NF-κB的平均光密度值，求其平均值并記錄。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS26.0統(tǒng)計軟件對實驗所得各組數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，統(tǒng)計結(jié)果用±s來表示，運用單因素方差分析法對各組數(shù)值的變量資料進行統(tǒng)計，采用最小顯著差LSD檢驗對各組之間進行比較分析；檢驗水準α=0.05，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能評分 由表1可見，F(xiàn)組大鼠的神經(jīng)功能無異常，而另外兩組大鼠的神經(jīng)功能均出現(xiàn)了不同程度的受損，且AP組神經(jīng)功能評分相比I/R組明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評分比較（±s，n=5）Tab.1 Comparison of neurological function scores in each group （±s，n=5）

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評分比較（±s，n=5）Tab.1 Comparison of neurological function scores in each group （±s，n=5）

Note：1）P＜0.05，vs F group； 2）P＜0.05，vs I/R group.

48 h 0.000±0.000 2.20±0.4471）1.20±0.4472）Groups F I/R AP 2 h6 h24 00±0.0000.000±0.0000.000±0.0 2.60±0.5481）1.80±0.4472）2.60±0.5481）1.40±0.5482） h0.000 2.40±0.5481）1.20±0.4472）

2.2 各組大鼠腦梗死體積 F組、AP組、I/R組腦梗死體積分別為（0.000±0.000）mm3、（93.670±4.509）mm3、（123.670±7.234）mm3，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=515.372，P＜0.05）。見圖1。

圖1 各組大鼠腦切片TTC染色Fig.1 TTC staining of brain section of rats in each group

2.3 HE染色觀察各組大鼠腦細胞形態(tài)學(xué)改變將HE染色后的各組大鼠腦組織切片置于（×400倍）顯微鏡下觀察，其中F組大鼠腦組織可見細胞結(jié)構(gòu)和形態(tài)規(guī)則無破壞，胞核清晰可見呈類圓形，細胞間質(zhì)無水腫；I/R組大鼠腦組織可見細胞結(jié)構(gòu)破壞，氣球樣改變，細胞間質(zhì)疏松，胞核固縮，部分細胞未見細胞核。而AP組大鼠腦梗死區(qū)細胞損傷程度較I/R組輕。見圖2。

圖2 各組大鼠腦皮質(zhì)細胞病理形態(tài)學(xué)變化（HE，×400）Fig.2 Pathological changes of cerebral cortex cells in each group（HE，×400）

2.4 各組大鼠腦缺血再灌注損傷后HMGB1表達情況 各組大鼠腦缺血再灌注后不同時間段的HMGB1表達差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖3、表2。

圖3 各組大鼠腦組織中HMGB1的表達情況（IHC，×400）Fig.3 Expression of HMGB1 in brain tissues of rats in each group （IHC，×400）

表2 各組大鼠腦組織HMGB1蛋白表達量（±s，AOD）Tab.2 Expression level of HMGB1 protein in rat brain tissues in each group （±s，AOD）

表2 各組大鼠腦組織HMGB1蛋白表達量（±s，AOD）Tab.2 Expression level of HMGB1 protein in rat brain tissues in each group （±s，AOD）

Note：1）P＜0.05，vs F group； 2）P＜0.05，vs AP group.

48 h 0.189 6±0.004 5 0.235 8±0.006 01）0.288 0±0.002 52）Groups F AP I/R 2 h6 h 0.170 4±0.013 10.202 6±0.014 90.21 0.211 0±0.008 51）0.476 8±0.012 61）0.49 0.269 6±0.027 82）0.605 8±0.029 02）24 h0 6±0.015 9 9 0±0.006 31）0.617 6±0.013 12）

2.5 各組大鼠腦缺血再灌注損傷后TLR4表達情況 各組大鼠腦缺血再灌注后不同時間段的TLR4表達差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖4、表3。

圖4 各組大鼠腦組織中TLR4的表達情況（IHC，×400）Fig.4 Expression of TLR4 in brain tissues of rats in each group （IHC，×400）

表3 各組大鼠腦組織TLR4蛋白表達量（±s，AOD）Tab.3 Expression level of TLR4 protein in rat brain tissues in each group （±s，AOD）

表3 各組大鼠腦組織TLR4蛋白表達量（±s，AOD）Tab.3 Expression level of TLR4 protein in rat brain tissues in each group （±s，AOD）

Note：1）P＜0.05，vs F group； 2）P＜0.05，vs AP group.

48 h 0.196 0±0.022 2 0.294 0±0.021 61）0.342 0±0.013 12）Groups F AP I/R 2 h 6 h 2 0.192 1±0.009 6 0.359 6±0.039 71）0.569 0±0.018 32）0.188 3±0.022 2 0.523 6±0.032 11）0.665 6±0.047 22）4 h 0.191 3±0.017 1 0.315 6±0.013 01）0.451 8±0.038 62）

2.6 各組大鼠腦缺血再灌注損傷后NF-κB表達情況 各組大鼠腦缺血再灌注后不同時間段的NF-κB表達差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖5、表4。

圖5 各組大鼠腦組織中NF-κB的表達情況（IHC，×400）Fig.5 Expression of NF-κB in brain tissues of rats in each group （IHC，×400）

表4 各組大鼠腦組織NF-κB蛋白表達量（±s，AOD）Tab.4 Expression level of NF-κB protein in rat brain tissues in each group （±s，AOD）

表4 各組大鼠腦組織NF-κB蛋白表達量（±s，AOD）Tab.4 Expression level of NF-κB protein in rat brain tissues in each group （±s，AOD）

Note：1）P＜0.05，vs F group； 2）P＜0.05，vs AP group.

Groups F AP I/R 2 h6 h.198 8±0.013 30.202 0±0.012 50.200 1）1）0 0.339 2±0.014 9 0.431 0±0.031 92）48 h 0.203 2±0.011 8 0.269 0±0.007 31）0.366 8±0.028 42）0.362 8±0.016 8 0.454 2±0.031 52）24 h6±0.014 9 0.328 2±0.041 71）0.482 0±0.034 62）

3 討論

腦缺血再灌注損傷是缺血性卒中后通過靜脈溶栓或機械取栓等措施實現(xiàn)血管再通、組織再灌注后引起二次損傷，從而加重神經(jīng)功能損傷的過程，其病理過程主要包括氧化抗氧化作用失衡、炎癥反應(yīng)、線粒體功能異常、凋亡基因過度表達等［13-14］。目前研究發(fā)現(xiàn)，采用藥物預(yù)處理的方式提前激活神經(jīng)保護過程，從而減輕腦缺血再灌注后對腦組織的再次傷害，為臨床診治提供新的治療方案，改善患者的運動功能，減輕其痛苦。

本實驗發(fā)現(xiàn)腺苷預(yù)處理不僅可以減輕腦缺血再灌注的神經(jīng)損傷同時可以減輕腦細胞的破壞，這與既往研究者的研究結(jié)果相吻合，由此可見腺苷預(yù)處理對神經(jīng)有保護作用［15］。腺苷是機體能量代謝過程中產(chǎn)生的一種核苷酸，當機體受到各種病理刺激后，導(dǎo)致機體缺血、缺氧，能量供應(yīng)減少，腺苷被釋放到細胞外，以此來減少ATP的消耗，恢復(fù)缺血部位的能量供應(yīng)，從而避免組織損傷［16］。腺苷分布廣泛，存在于心、腦、胃腸等多個組織中，在腦組織中，其主要通過激活相應(yīng)的受體（腺苷A1受體）對缺血腦組織起神經(jīng)保護功能［17-18］。目前研究證實，腺苷預(yù)處理可以通過多種途徑減輕MCAO大鼠再灌注引起的腦組織損傷［9-11］；但具體機制尚未闡明。

本課題通過探討HMGB1-TLR4介導(dǎo)的NF-κB信號通路在腺苷預(yù)處理對腦缺血再灌注中的影響，來作為對上述作用機制的補充，為后續(xù)的科學(xué)研究提供依據(jù)。

研究發(fā)現(xiàn)，在缺血性卒中發(fā)生后，由于藥物或機械作用導(dǎo)致生物體血流再灌注進而對組織引起的再次損傷，在此過程中炎癥反應(yīng)起著關(guān)鍵性作用，而抑制炎癥反應(yīng)則能很大程度上來減輕缺血性腦組織的損傷［19-21］。

高遷移率族蛋白1是其家族中蛋白含量最豐富的非組核蛋白，在心、肝、腎、腦等全身多個器官中均有明顯表達，其主要通過與DNA結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，可維持DNA的正常空間結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)類固醇激素受體的活性以及基因的轉(zhuǎn)錄［22］。病理情況下，當組織受到病原微生物攻擊或受到機械、理化因素刺激后，組織缺血缺氧，進而導(dǎo)致細胞變性、壞死，HMGB1被轉(zhuǎn)移到細胞間隙，作為配體通過與其受體結(jié)合，激活相應(yīng)的信使，繼而促進NF-κB核轉(zhuǎn)移發(fā)揮其顯著的促炎作用。

HMGB1不僅參與感染性疾病的發(fā)生發(fā)展，而且參與腫瘤、創(chuàng)傷、風濕免疫等非感染性疾病過程［23］。TLRs受體包括TLR1-13等受體，作為一種模式識別受體能夠感知各種危險信號，存在于非特異免疫中，可以在巨噬細胞、樹突狀細胞以及上皮細胞等多種細胞表面表達［24］；HMGB1主要通過與受體TLR4結(jié)合發(fā)揮促炎效應(yīng)，兩者結(jié)合后可使TLR4的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而激活NF-κB，促使IL-1、IL-6及TNF等炎癥因子大量釋放，觸發(fā)炎癥反應(yīng)［25］。NF-κB是重要的核轉(zhuǎn)錄因子，正常情況下，其與抑制蛋白IκBα結(jié)合以非活性狀態(tài)存在于細胞質(zhì)中，當機體受到病理刺激后被激活，從而由細胞質(zhì)轉(zhuǎn)到細胞核，促進炎癥細胞因子的釋放，如TNF-α、IL-1、IL-6，啟動炎癥反應(yīng)和細胞凋亡的過程［26］。體外實驗證實，TLR4可以通過調(diào)控抑癌基因、胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶、蛋白激酶B、NF-κB等蛋白的表達，誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元發(fā)生炎癥反應(yīng)［27］。

本研究通過免疫組化檢測各組大鼠腦缺血再灌注后不同時間點的HMGB1、TLR4、NF-κB等蛋白水平的表達，發(fā)現(xiàn)I/R組及AP組大鼠各時間點的HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白表達水平明顯高于F組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；各組大鼠HMGB1、NF-κB蛋白表達水平從腦缺血再灌注后2 h開始升高，24 h后逐步下降，而TLR4的表達水平從腦缺血再灌注后6 h即開始下降，提示HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白均在腦缺血再灌注損傷的早期階段發(fā)揮重要作用。AP組大鼠缺血再灌注各個時間點的HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白表達水平較I/R組明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，由此推測HMGB1、TLR4、NF-κB三組蛋白作為炎癥反應(yīng)中的重要媒介，參與缺血性腦卒中后，由于血管再通引起的腦組織損傷的病理生理過程，而腺苷預(yù)處理則可通過抑制此類蛋白的表達，減輕炎癥反應(yīng)，減輕腦組織損傷，對機體發(fā)揮保護作用。

綜上所述，腺苷預(yù)處理不僅能夠減輕腦缺血再灌注的細胞損傷，縮小缺血壞死的腦組織，同時能夠挽救更多的神經(jīng)細胞，改善其功能；而HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白共同參與了腦缺血再灌注損傷的病理過程中，腺苷預(yù)處理可以減輕上述蛋白的表達，抑制其信號通路進而發(fā)揮神經(jīng)保護作用，這為后續(xù)的科學(xué)研究提供依據(jù)，為未來的臨床研究指明新的方向。