miR-145通過Notch通路調(diào)節(jié)免疫功能及炎癥反應(yīng)介導(dǎo)創(chuàng)傷性腦損傷的神經(jīng)保護

胡德獻 孫衍昶 馮基高 莫業(yè)和 （海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，海口 570311）

創(chuàng)傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）是死亡和殘疾的最常見原因之一，給世界各地的患者帶來巨大的心理和經(jīng)濟負擔(dān)［1］。TBI包括原發(fā)性和繼發(fā)性腦損傷，繼發(fā)性損傷包括細胞凋亡、氧化應(yīng)激、免疫反應(yīng)和炎癥的復(fù)雜級聯(lián)反應(yīng)［2］。據(jù)報道，神經(jīng)炎癥是繼發(fā)性腦損傷的關(guān)鍵因素，大腦中的炎癥反應(yīng)通常涉及大量神經(jīng)元壞死或死亡以及小膠質(zhì)細胞激活［3］。既往研究表明，中度或重度創(chuàng)傷性腦損傷誘發(fā)慢性小膠質(zhì)細胞激活，其可能是延遲細胞死亡和組織損傷的結(jié)果［4］。最近的研究表明，調(diào)節(jié)性T細胞（regulatory T cells，Tregs）在一些疾病中調(diào)節(jié)免疫和炎癥，如腦缺血、病毒性心肌炎和重癥肌無力［5-7］。然而，其潛在的病理和生理機制仍不清楚。微小核糖核酸（microRNA，miRNA）是一類小的非編碼核糖核酸，通過與特定靶標mRNA的3'-非翻譯區(qū)（3'-UTR）結(jié)合來負調(diào)控基因表達，從而抑制mRNA翻譯或直接降解mRNA。據(jù)報道，多種微小核糖核酸的異常表達與TBI的發(fā)展有關(guān)。miR-145是最豐富和高度保守的miRNAs之一，與巨噬細胞極化有關(guān)［8］。研究表明，過表達miR-145可能通過抑制小膠質(zhì)細胞活化預(yù)防缺血性腦卒中［9］。免疫/炎癥反應(yīng)在繼發(fā)性腦損傷的病理過程中發(fā)揮重要作用，但miR-145在TBI后免疫/炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)中的作用尚不清楚。因此，本研究將探討miR-145對神經(jīng)預(yù)后的影響及其與神經(jīng)炎癥和免疫反應(yīng)的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑與儀器 BCA試劑盒、ELISA試劑盒（上海碧云天公司）；抗Notch1、p21、Hes1、NeuN抗體（Abcam公司）；Trizol試劑（Invitrogen公司）；流式細胞儀染色緩沖液（上海賓智生物科技有限公司）；miR-145 agomir、NC agomir（上海捷瑞生物工程有限公司）；TUNEL試劑［羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司］。動物立體定位儀（上海軟隆科技發(fā)展有限公司）；顯微鏡（Olympus公司）；酶標儀（Thermo Fisher公司）；熒光定量PCR儀（Bio-Rad公司）。

1.1.2 實驗動物 8～10周齡雄性C57BL/6小鼠購于海南藥物研究所有限責(zé)任公司，體質(zhì)量21～23 g，生產(chǎn)許可證號：SCXK（瓊）2020-0007，飼養(yǎng)于（20±2） ℃、（55±5）%濕度、12 h/12 h明暗循環(huán)的動物房中，使用許可證號：SYXK（瓊）2017-0013。所有動物均自由攝食飲水。本研究所有動物程序均經(jīng)海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院倫理委員會批準（202112-14）。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建TBI小鼠模型 麻醉小鼠，備皮消毒后，頭皮矢狀切開，露出顱骨，在右側(cè)頭蓋骨bregma和lambda之間矢狀縫合線外側(cè)2 mm處鉆一個直徑3.5 mm的開口，假手術(shù)組即可完成手術(shù)。對于實驗組小鼠，暴露硬腦膜后進行撞擊腦挫傷，撞擊速度為4.5 m/s，撞擊持續(xù)時間為150 ms，深度為1.5 mm。擊打結(jié)束后，立即縫合切口，使用加熱墊對動物進行保暖，等待麻醉恢復(fù)。模型小鼠在損傷后24 h側(cè)腦室注射0.5 nmol的miR-145 agomir或等濃度的陰性對照NC agomir。在損傷后第3天立即解剖海馬組織，并在液氮中快速冷凍，用于后續(xù)實驗。

1.2.2 改良神經(jīng)損傷嚴重程度（mNSS）評分 mNSS評分用于評估創(chuàng)傷后神經(jīng)功能。該測試包括運動（肌肉狀態(tài)、異常運動）、感覺（視覺、觸覺和本體感覺）、平衡木和反射測試。mNSS評分為0～18分，分數(shù)越大表示損傷越嚴重。本研究中，mNSS在TBI后的第1、3、5、9、14天進行評估。mNSS評分由兩名不負責(zé)此研究的觀察員進行評估。

1.2.3 莫里斯水迷宮（MWM） 迷宮是一個直徑120 cm、深度50 cm的圓形水槽。水槽中裝有深度為30 cm、溫度為25 ℃的水。將水箱分成4個相等的象限，然后在一個象限的中心水面下1 cm處隱藏一個黑色圓形平臺。所有小鼠在TBI后14 d連續(xù)訓(xùn)練5 d。在空間學(xué)習(xí)訓(xùn)練中，小鼠被隨機放入迷宮中自由游泳直至找到平臺。如果1只小鼠在60 s內(nèi)找不到平臺，則在平臺上休息30 s。第6天，從任意方向測試，記錄每只小鼠的運動情況，利用追蹤分析軟件評估小鼠認知功能。

1.2.4 Western blot 使用RIPA裂解緩沖液裂解同側(cè)海馬組織。每組中等量的蛋白質(zhì)用SDS-PAGE凝膠電泳分離，然后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜。室溫下采用5%脫脂牛奶封閉膜1 h，隨后將膜與一抗4 ℃過夜孵育，結(jié)束后與二抗在室溫下孵育1 h。使用增強化學(xué)發(fā)光試劑顯現(xiàn)條帶。最后，使用Image J軟件分析量化蛋白質(zhì)表達。

1.2.5 實時熒光定量PCR（RT-qPCR） 使用Trizol試劑按照說明書從海馬組織中提取總RNA。檢測miRNA表達時，使用TaqMan microRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，根據(jù)說明書將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。檢測mRNA表達時，使用PrimeScript RT試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)制造商的說明，使用SYBR Green PCR Master Mix試劑盒進行RT-qPCR分析。目的基因的相對表達量使用2-ΔΔCt方法計算。mRNAs或miRNAs分別使用GAPDH或U6作為內(nèi)部對照。

1.2.6 ELISA 從損傷的大腦半球取海馬組織勻漿。根據(jù)制造商說明，使用ELISA試劑盒檢測海馬組織中促炎細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α和抗炎細胞因子IL-4、IL-10和TGF-β濃度。

1.2.7 TUNEL染色 將組織切片脫蠟并與0.1%Triton X-100在室溫下孵育10 min。檸檬酸鹽緩沖液高溫修復(fù)10 min后，將組織用TUNEL溶液在37 ℃下孵育60 min，然后用NeuN抗體4 ℃下孵育過夜。PBS洗滌3次，并與Cy3標記的山羊抗小鼠IgG在室溫下孵育60 min。用抗熒光淬滅劑封片，并使用熒光顯微鏡觀察外傷性病灶周圍凋亡神經(jīng)元細胞的數(shù)量。

1.2.8 流式細胞術(shù) 流式細胞術(shù)檢測腦組織Treg淋巴細胞。取小鼠腦組織并制備腦組織單細胞懸液，使用小鼠Tregs染色試劑盒對分離的細胞進行染色。簡而言之，用抗小鼠CD4-FITC和抗小鼠CD25-PE對細胞于4 ℃下染色30 min固定，然后用固定/透化溶液在4 ℃下透化過夜，隨后用抗小鼠Foxp3-APC抗體染色，最后上機進行流式細胞分析。

1.2.9 免疫組化 將小鼠麻醉后，灌注4%多聚甲醛。隨后立即取腦組織，4%多聚甲醛室溫固定24 h。制作腦組織石蠟切片，用梯度乙醇和二甲苯脫蠟，在檸檬酸鹽緩沖液（pH=6.0）中煮沸以修復(fù)組織抗原。PBS洗3次，將切片與3%過氧化氫（H2O2）孵育20 min，然后用3%牛血清白蛋白孵育60 min阻斷非特異性結(jié)合。預(yù)處理后，將切片與兔抗小鼠Iba-1抗體孵育過夜。然后與生物素化的抗兔IgG在室溫下孵育2 h。最后用抗生物素蛋白-生物素辣根過氧化物酶（HRP）復(fù)合物識別結(jié)合的抗體，并使用二氨基聯(lián)苯胺溶液進行可視化檢測HRP活性。每個切片中Iba-1陽性細胞的數(shù)量由兩名對研究條件不了解的獨立觀察者在挫傷腦組織的5個區(qū)域中計數(shù)，計算陽性細胞數(shù)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 使用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。實驗結(jié)果以±s表示。兩組之間使用t檢驗進行分析，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-145對TBI術(shù)后小鼠神經(jīng)功能的影響 與Sham組比較，TBI組小鼠海馬組織中miR-145表達顯著降低，逃避潛伏期延長，穿越平臺次數(shù)減少，嚴重程度評分顯著升高（P＜0.05）；與TBI+NC agomir組比較，TBI+miR-145 agomir組小鼠海馬中miR-145表達顯著升高，逃避潛伏期縮短，穿越平臺次數(shù)增加，小鼠第3、5、9、14天神經(jīng)損傷嚴重程度評分顯著降低（P＜0.05），見圖1。

圖1 miR-145對TBI術(shù)后小鼠神經(jīng)功能的影響Fig.1 Effect of miR-145 on neurological function of mice after TBI

2.2 miR-145對TBI術(shù)后小鼠腦組織中Tregs的影響 與Sham組比較，TBI組小鼠腦組織中Tregs在CD4+T細胞群中的百分比降低（P＜0.05）；與TBI+NC agomir組比較，TBI+miR-145 agomir組小鼠腦組織中Tregs細胞在CD4+T細胞群中的百分比顯著升高（P＜0.05），見圖2。

圖2 miR-145對TBI術(shù)后小鼠腦組織中Tregs的影響Fig.2 Effect of miR-145 on Tregs in mice brain after TBI operation

2.3 miR-145對TBI術(shù)后小鼠炎癥細胞因子的影響 與Sham組比較，TBI組小鼠海馬組織中IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-4、IL-10和TGF-β表達水平顯著升高（P＜0.05）；與TBI+NC agomir組比較，TBI+miR-145 agomir組小鼠海馬中促炎因子IL-1β、IL-6、TNFα表達水平顯著降低，抗炎因子IL-4、IL-10和TGF-β表達水平顯著升高（P＜0.05），見圖3。

圖3 miR-145對TBI術(shù)后小鼠炎癥細胞因子的影響Fig.3 Effect of miR-145 on inflammatory cytokines in mice after TBI operation

2.4 miR-145對TBI術(shù)后小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞極化的影響 與Sham組比較，TBI組活化的小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞Iba-1數(shù)量增多（P＜0.05）；與TBI+NC agomir組比較，TBI+miR-145 agomir組活化的小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞Iba-1數(shù)顯著減少（P＜0.05），見圖4。

圖4 miR-145對TBI術(shù)后小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞極化的影響Fig.4 Effect of miR-145 on microglia/macrophage polarization after TBI

2.5 miR-145對TBI術(shù)后M1/M2小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞極化的影響 與Sham組比較，TBI組小鼠M1小膠質(zhì)細胞標志物基因iNOS和CD11b以及M2小膠質(zhì)細胞標志物基因CD206和Arg1表達水平顯著升高（P＜0.05）；與TBI+NC agomir組比較，TBI+miR-145 agomir組小鼠M1小膠質(zhì)細胞標志物基因iNOS和CD11b表達水平顯著降低，而M2小膠質(zhì)細胞標志物基因CD206和Arg1表達水平顯著升高（P＜0.05），見圖5。

圖5 miR-145對TBI術(shù)后M1/M2小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞極化的影響Fig.5 Effect of miR-145 on M1/M2 microglia/macrophage polarization after TBI

2.6 miR-145對TBI術(shù)后海馬細胞神經(jīng)元凋亡的影響 與Sham組比較，TBI組小鼠海馬神經(jīng)元凋亡數(shù)量顯著增加，凋亡神經(jīng)元占總NeuN陽性神經(jīng)元中的百分比升高（P＜0.05）；與TBI+NC agomir組比較，TBI+miR-145 agomir組小鼠凋亡的神經(jīng)元數(shù)量顯著減少，凋亡神經(jīng)元占總NeuN陽性神經(jīng)元中的百分比顯著降低（P＜0.05），見圖6。

圖6 miR-145對TBI術(shù)后神經(jīng)細胞凋亡的影響Fig.6 Effect of miR-145 on nerve cell apoptosis after TBI

2.7 miR-145對TBI后小鼠海馬Notch信號通路的影響 與Sham組比較，TBI組小鼠海馬中Notch1、p21和Hes1 mRNA和蛋白水平均顯著升高（P＜0.05）；與TBI+NC agomir組比較，TBI+miR-145 agomir組小鼠海馬中Notch1、p21和Hes1 mRNA和蛋白水平均顯著降低（P＜0.05），見圖7。

圖7 miR-145對TBI術(shù)后Notch信號通路的影響Fig.7 Effect of miR-145 on Notch signaling pathway after TBI

3 討論

研究表明，TBI后持續(xù)的小膠質(zhì)細胞活化有助于神經(jīng)變性和相關(guān)神經(jīng)損傷的進展［10］。此外，多項研究計算了患者和創(chuàng)傷性腦損傷動物的miRNA譜，并確定了創(chuàng)傷性腦損傷中潛在的miRNA生物標志物［11-12］。然而，miR-145在TBI中的作用報道較少。為了研究miR-145在TBI中的作用，本研究構(gòu)建TBI小鼠模型，通過側(cè)腦室注射miR-145激動劑上調(diào)TBI后miR-145水平。首先研究miR-145對TBI術(shù)后神經(jīng)功能結(jié)果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達miR-145顯著改善了TBI模型誘發(fā)的神經(jīng)功能障礙。

此外，本研究證明了TBI后小鼠miR-145的抗炎和免疫調(diào)節(jié)特性。Treg是T淋巴細胞的一個子集，具有調(diào)節(jié)免疫/炎癥功能的能力。Tregs可減少腦損傷，減少免疫/炎癥細胞浸潤和小膠質(zhì)細胞激活，降低促炎細胞因子分泌，提高抗炎細胞因子水平［13］。本研究發(fā)現(xiàn)在TBI后3 d，腦組織中Tregs水平降低。過表達miR-145可顯著增加中樞神經(jīng)系統(tǒng)中Tregs數(shù)量。既往研究報道，TBI患者中Tregs水平顯著降低，表明Tregs增加可能改善TBI的預(yù)后［14］。這與本研究結(jié)果一致。因此，增加Tregs可能在TBI中由miR-145治療誘導(dǎo)的神經(jīng)保護和免疫/炎癥調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用。

炎癥是多種神經(jīng)退行性疾病及其相關(guān)神經(jīng)病理學(xué)的潛在組成部分。急性神經(jīng)炎癥通過引發(fā)促進細胞因子和/或趨化因子的分泌，以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)小膠質(zhì)細胞的活化損害腦細胞［15］。本研究發(fā)現(xiàn)在小鼠TBI模型中，過表達miR-145顯著抑制神經(jīng)炎癥，促炎細胞因子減少，抗炎細胞因子增加，并顯著減輕了小膠質(zhì)細胞活化。腦損傷后，活化的小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥過程中的主要執(zhí)行者，在細胞形態(tài)和行為上發(fā)生了顯著變化［16］。小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞可根據(jù)其宿主組織微環(huán)境分化為有害表型（M1）或有益表型。據(jù)報道，小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞的過度M1樣激活也可誘發(fā)慢性炎癥，阻止組織修復(fù)并誘發(fā)繼發(fā)性損傷［17］。M2小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞被認為是M1的抗衡物，有助于損傷后的恢復(fù)，并分泌IL-10、IL-4、IL-13等抗炎介質(zhì)及各種神經(jīng)營養(yǎng)因子，以保持組織的完整性［18-19］。本研究通過分析與M1或M2相關(guān)的特征基因在海馬的表達評估大腦小膠質(zhì)細胞的極化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達miR-145后，M1小膠質(zhì)細胞標志物基因iNOS和CD11b表達降低，M2小膠質(zhì)細胞標志物基因CD206和Arg1表達水平顯著升高，提示miR-145通過促進小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞從M1向M2表型的轉(zhuǎn)變而發(fā)揮抗炎作用。

近期研究報道，腦損傷后Notch信號通路可被激活，并參與激活的小膠質(zhì)細胞中神經(jīng)炎癥介質(zhì)的釋放。抑制Notch通路可減輕腦細胞損傷，改善功能［20］。此外，Notch信號通路在其他組織的損傷中也發(fā)揮重要作用。例如，抑制Notch通路可減輕急性腎損［21］。Notch信號是由許多miRNAs調(diào)控的，已有研究報道m(xù)iR-145在Notch信號通路中發(fā)揮關(guān)鍵作用［22］。本研究結(jié)果表明，過表達miR-145可降低Notch1、Hes1和p21蛋白表達，提示miR-145可能通過抑制Notch信號通路促進海馬小膠質(zhì)細胞的M2極化及海馬神經(jīng)元凋亡。

綜上所述，本研究表明過表達miR-145可通過減少創(chuàng)傷后神經(jīng)炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)改善行為功能障礙，提高Treg水平，促進小膠質(zhì)細胞M2極化，這可能是通過抑制Notch信號通路介導(dǎo)的。因此，miR-145有望成為改善創(chuàng)傷性腦損傷的有效治療手段和潛在靶標。