CircRHOT1調(diào)節(jié)miR-187-3p/SOX4軸對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖、凋亡和免疫逃逸的影響

孫沛 姜振偉 劉倩

（1.武漢市普仁醫(yī)院檢驗(yàn)科，武漢 430080；2.武漢市普仁醫(yī)院腫瘤科，武漢 430080）

乳腺癌是世界各地最常見的婦科惡性腫瘤，具有生長(zhǎng)迅速、易轉(zhuǎn)移的特性，是導(dǎo)致女性癌癥死亡的主要原因之一，臨床以手術(shù)切除、化療、免疫治療等綜合治療為主，但乳腺癌細(xì)胞發(fā)生的免疫逃逸會(huì)限制其臨床療效，因此全面探索乳腺癌生長(zhǎng)及免疫逃逸的機(jī)制對(duì)其臨床療效的提升尤為重要［1-3］。環(huán)狀RNA ras同源物基因家族成員T1（circular RNA ras homolog family member T1，CircRHOT1）作為一種具有致癌作用的環(huán)狀RNA，在膀胱癌、肝癌、乳腺癌等惡性腫瘤中高度表達(dá)，敲除CircRHOT1可顯著抑制膀胱癌增殖和遷移，并增強(qiáng)其對(duì)NK細(xì)胞敏感性，降低肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和侵襲能力，還可通過增強(qiáng)鐵死亡來抑制乳腺癌細(xì)胞增殖和體內(nèi)乳腺癌腫瘤生長(zhǎng)，并誘導(dǎo)其大量凋亡［4-6］，從機(jī)制上講，CircRHOT1作為微小RNA（miRNA）的海綿來調(diào)控下游癌基因表達(dá)，進(jìn)而介導(dǎo)人類癌癥發(fā)生和進(jìn)展，通過查詢Starbase數(shù)據(jù)庫進(jìn)行生物信息學(xué)分析可知，CircRHOT1可能通過海綿化miR-187-3p來調(diào)節(jié)性別決定區(qū)Y框蛋白4（sex-determining region Y-box 4，SOX4）的表達(dá)。研究顯示，miR-187-3p是一種具備抗癌功效的微小RNA分子，可介導(dǎo)癌細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和腫瘤免疫微環(huán)境進(jìn)展，上調(diào)miR-187-3p可抑制人腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞體內(nèi)外增殖和侵襲，并改善其腫瘤免疫浸潤(rùn)微環(huán)境，還能顯著降低乳腺癌細(xì)胞增殖活性，增強(qiáng)其對(duì)吉西他濱的敏感性，并促進(jìn)其細(xì)胞凋亡［7-8］；SOX4是調(diào)控嵌合抗原受體T細(xì)胞功能和惡性腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵因子，在人類原發(fā)性惡性腫瘤中高表達(dá)，并可增強(qiáng)乳腺癌在體內(nèi)外的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移［9］，下調(diào)SOX4可通過延緩嵌合抗原受體T細(xì)胞功能衰竭以提高實(shí)體瘤的免疫治療效果，還可顯著降低乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移能力，并促使其凋亡［10-11］，因而推測(cè)CircRHOT1可能通過調(diào)節(jié)miR-187-3p/SOX4軸影響乳腺癌細(xì)胞增殖、凋亡和免疫逃逸，本文通過敲低體外培養(yǎng)的乳腺癌細(xì)胞MCF-7中CircRHOT1和上調(diào)miR-187-3p來對(duì)此推測(cè)進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞與試劑 人正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A（貨號(hào)：CL-0525）、DMEM/F12培養(yǎng)基（貨號(hào)：PM150312）、人乳腺癌細(xì)胞MCF-7（貨號(hào)：CL-0149）、MEM培養(yǎng)基（貨號(hào)：PM150410）、人乳腺癌細(xì)胞Hs-578T（貨號(hào)：CL-0114）、DMEM高糖培養(yǎng)基（PM150210）、人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231（貨號(hào)：CL-0150A）、Leibovitz's L-15培養(yǎng)基（貨號(hào)：PM151010）購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司；脂質(zhì)體2000（貨號(hào)：11668-027）、特級(jí)胎牛血清（貨號(hào)：16000-044）購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；總RNA提取試劑Trizol（R1100）、MTT細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：M1020）、人外周血淋巴細(xì)胞分離液（貨號(hào)：P8610）、Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：CA1020）、一步法實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒（T2210）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；兔抗人Anti-SOX4抗體（貨號(hào)：abs132989）購(gòu)自上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司；FITC標(biāo)記的抗人CD8抗體（貨號(hào)：ab95591）、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗（貨號(hào)：ab205718）、小鼠抗人Anti-Bcl-2抗體（貨號(hào)：ab692）購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：E608001）購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司；EdU-488細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：C0071L）、×10結(jié)晶紫染色液（貨號(hào)：C0121）、兔抗人Anti-GAPDH抗體（貨號(hào)：AF1186）、免疫熒光染色試劑盒-抗小鼠Alexa Fluor 488（貨號(hào)：P0188）、兔抗人Anti-Bax抗體（貨號(hào)：AF0057）、免疫熒光染色試劑盒-抗兔Alexa Fluor 555（貨號(hào)：P0179）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（型號(hào)：MA-6000）購(gòu)自濟(jì)南泰醫(yī)生物技術(shù)有限公司；定時(shí)雙穩(wěn)電泳儀電源、四板轉(zhuǎn)印電泳儀、一體式凝膠成像系統(tǒng)、四板垂直電泳儀（型號(hào)：DYY-3C、DYCZ-40S、WD-9413D、DYCZ-24KF）購(gòu)自北京六一生物科技有限公司；酶標(biāo)分析儀（型號(hào)：HBS-1096A）購(gòu)自無錫集佳智能科技有限公司；研究級(jí)生物熒光顯微鏡、光學(xué)顯微鏡（型號(hào)：RX50、EX30）購(gòu)自北京知微儀器有限公司；流式細(xì)胞儀（型號(hào)：CyFlow-Cube8）購(gòu)自廣州吉源生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)時(shí)熒光PCR和免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MCF-10A、MCF-7、Hs-578T、MDA-MB-231細(xì)胞CircRHOT1、miR-187-3p與SOX4表達(dá) 取出凍存的MCF-10A、MCF-7、Hs-578T、MDA-MB-231細(xì)胞，快速放入40 ℃溫水浴中解凍復(fù)蘇，37.5 ℃下1 000 r/min 離心5 min后，分別加入均混有10%特級(jí)胎牛血清的DMEM/F12、MEM、DMEM高糖、Leibovitz's L-15培養(yǎng)基，混勻后放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)80%細(xì)胞融合后進(jìn)行傳代培養(yǎng)，采用Trizol試劑分別提取傳代的各細(xì)胞總RNA，然后每種細(xì)胞取適量總RNA通過一步法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，具體反應(yīng)條件依照一步法實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒說明書設(shè)定，CircRHOT1、SOX4用GAPDH做內(nèi)參對(duì)照，miR-187-3p用U6做內(nèi)參對(duì)照，各基因所得循環(huán)閾值采用2-ΔΔCt算法計(jì)算其相對(duì)表達(dá)，其引物序列見表1。

表1 各基因引物序列Tab.1 Primer sequence of each gene

取傳代的MCF-10A、MCF-7、Hs-578T、MDAMB-231細(xì)胞，采用RIPA裂解液分別提取其中總蛋白，通過BCA法測(cè)出其濃度后煮沸變性，每種細(xì)胞取出15 μg總蛋白通過電泳、濕轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)將其分離后轉(zhuǎn)膜，剪下SOX4、GAPDH蛋白后以5%脫脂奶粉溶液封閉、兔抗人Anti-SOX4、GAPDH一抗孵育、洗膜、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗孵育、洗膜、化學(xué)發(fā)光法顯色、攝片，運(yùn)用Image J軟件定量各蛋白灰度值并分析量化其相對(duì)表達(dá)。

1.2.2 分組處理MCF-7細(xì)胞并采集標(biāo)本 取傳代的MCF-7細(xì)胞以1×105個(gè)/孔接種于24孔板中培養(yǎng)24 h，隨機(jī)分為對(duì)照組、CircRHOT1敲低組、miR-187-3p mimics組、共轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照組、CircRHOT1敲低+miR-187-3p inhibitor組，除對(duì)照組外的其余各組采用脂質(zhì)體2000并依照其說明指導(dǎo)分組進(jìn)行轉(zhuǎn)染：CircRHOT1敲低組轉(zhuǎn)染CircRHOT1 siRNA質(zhì)粒，miR-187-3p mimics組轉(zhuǎn)染miR-187-3p mimics，共轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒和miR-187-3p inhibitor陰性對(duì)照，CircRHOT1敲低+miR-187-3p inhibitor組轉(zhuǎn)染CircRHOT1 siRNA質(zhì)粒和miR-187-3p inhibitor，各組細(xì)胞均轉(zhuǎn)染24 h后收集其細(xì)胞沉淀作為標(biāo)本備用。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光PCR和免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組MCF-7細(xì)胞CircRHOT1、miR-187-3p與SOX4表達(dá)取出1.2.2中收集的各組MCF-7細(xì)胞，分別提取出其總RNA和總蛋白后檢測(cè)各組CircRHOT1、miR-187-3p與SOX4表達(dá)，方法見1.2.1。

1.2.4 EdU染色和平板集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組MCF-7細(xì)胞增殖 EdU染色實(shí)驗(yàn)：取傳代的MCF-7細(xì)胞以1×105個(gè)/孔密度接種于24孔板中培養(yǎng)24 h，依照1.2.2中方法分組并進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，24 h后加入終濃度為10 μmol/L的EdU工作液孵育2 h，并進(jìn)行DAPI染色，依照EdU-488細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒說明指導(dǎo)在熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞并拍照，計(jì)算EdU陽性率，EdU陽性率（%）=EdU陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

平板集落形成實(shí)驗(yàn)：取傳代的MCF-7細(xì)胞以50個(gè)/孔密度接種于24孔板中培養(yǎng)24 h，依照1.2.2中方法分組并進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，24 h后棄去含轉(zhuǎn)染試劑的舊培養(yǎng)基，加入新的混有10%特級(jí)胎牛血清的MDM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)3周，期間每2 d半換1次培養(yǎng)基，然后棄去培養(yǎng)基，對(duì)細(xì)胞做漂洗、固定、結(jié)晶紫染色、漂洗處理，在光學(xué)顯微鏡下觀察各組細(xì)胞集落并拍照，計(jì)算集落生成率，集落生成率（%）=轉(zhuǎn)染組細(xì)胞集落數(shù)/對(duì)照組細(xì)胞集落數(shù)×100%。

1.2.5 流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組MCF-7細(xì)胞凋亡取傳代的MCF-7細(xì)胞以1×105個(gè)/孔細(xì)胞的密度接種在24孔板中培養(yǎng)24 h，依照1.2.2中方法分組并進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，24 h后胰酶消化并收集各組細(xì)胞沉淀，以PBS清洗后重懸，測(cè)出其細(xì)胞密度后每組取出約1×105個(gè)細(xì)胞，采用凋亡檢測(cè)試劑盒做Annexin VFITC/PI雙染，PBS清洗后重懸，采用流式細(xì)胞儀對(duì)各組細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.6 免疫熒光染色檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2表達(dá)比值（Bax/Bcl-2） 取傳代的MCF-7細(xì)胞以1×105個(gè)/孔的密度接種于24孔板中培養(yǎng)24 h，依照1.2.2中方法分組并進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，24 h后棄去培養(yǎng)基，對(duì)細(xì)胞做漂洗、固定、封閉處理，然后加入兔抗人Anti-Bax一抗和小鼠抗人Anti-Bcl-2一抗孵育、漂洗、加入免疫熒光染色試劑盒中Alexa Fluor 555偶聯(lián)抗兔二抗和Alexa Fluor 488偶聯(lián)抗小鼠二抗孵育、DAPI染色、漂洗，在熒光學(xué)顯微鏡下觀察各組細(xì)胞Bax（綠色熒光）和Bcl-2表達(dá)（紅色熒光），運(yùn)用Image J軟件分別定量其平均熒光強(qiáng)度后計(jì)算Bax/Bcl-2，Bax/Bcl-2=綠色平均熒光強(qiáng)度/紅色平均熒光強(qiáng)度。

1.2.7 流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測(cè)與MCF-7細(xì)胞共培養(yǎng)的人外周血淋巴細(xì)胞中活化CD8+T細(xì)胞比例 采用人外周血淋巴細(xì)胞分離液提取本院健康志愿者（獲得其知情同意書）外周血中淋巴細(xì)胞，本研究通過武漢市普仁醫(yī)院倫理委員會(huì)審批［（k2022）年審第（002）號(hào)］。以混有10%特級(jí)胎牛血清的MEM培養(yǎng)基重懸，測(cè)出其細(xì)胞密度后以2∶1（人外周血淋巴細(xì)胞∶MCF-7細(xì)胞）的比例與MCF-7細(xì)胞共培養(yǎng)24 h，依照1.2.2中方法分組并進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，24 h后吸出各組培養(yǎng)基，收集其中懸浮生長(zhǎng)的淋巴細(xì)胞，1 000 r/min、37.5 ℃ 離心5 min后，以PBS清洗后重懸，分別加入FITC標(biāo)記的抗人CD8抗體避光孵育（每組取一部分細(xì)胞加入IgG抗體設(shè)空白對(duì)照），20 min后再次1 000 r/min、37.5 ℃ 離心 5 min，以PBS清洗、重懸后，采用流式細(xì)胞儀對(duì)各組淋巴細(xì)胞中活化CD8+T細(xì)胞比例進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.8 MTT法檢測(cè)人外周血淋巴細(xì)胞對(duì)MCF-7細(xì)胞殺傷率 取一個(gè)無菌96孔板接種人外周血淋巴細(xì)胞和MCF-7細(xì)胞建立共培養(yǎng)體系，方法見1.2.7，培養(yǎng)24 h后依照1.2.2中方法分組并進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，24 h后吸出各組培養(yǎng)基，棄去其中懸浮生長(zhǎng)的淋巴細(xì)胞，剩余貼壁生長(zhǎng)的MCF-7細(xì)胞加入含適量MTT工作液和10%特級(jí)胎牛血清的MEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2 h，然后取出96孔板依照MTT細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒說明指導(dǎo)檢測(cè)各組細(xì)胞吸光度，計(jì)算各組人外周血淋巴細(xì)胞對(duì)MCF-7細(xì)胞的殺傷率，殺傷率（%）=（1-轉(zhuǎn)染組吸光度/對(duì)照組吸光度）×100%。

1.2.9 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MCF-7細(xì)胞CircRHOT1 對(duì)miR-187-3p、miR-187-3p對(duì)SOX4的靶向調(diào)控 取傳代的MCF-7細(xì)胞以1×105個(gè)/孔的密度接種于24孔板中培養(yǎng)24 h，隨機(jī)分為野生miR-187-3p+空載組、野生miR-187-3p+CircRHOT1 過表達(dá)組、突變miR-187-3p+空載組、突變miR-187-3p+CircRHOT1 過表達(dá)組、野生SOX4+miR-187-3p mimics陰性對(duì)照組、野生SOX4+CircRHOT1 過表達(dá)組、突變SOX4+miR-187-3p mimics陰性對(duì)照組、突變SOX4+CircRHOT1 過表達(dá)組，采用脂質(zhì)體2000并依照其說明指導(dǎo)做細(xì)胞轉(zhuǎn)染：野生miR-187-3p+空載組轉(zhuǎn)染野生型miR-187-3p和空載質(zhì)粒，野生miR-187-3p+CircRHOT1 過表達(dá)組轉(zhuǎn)染野生型miR-187-3p和CircRHOT1 過表達(dá)質(zhì)粒，突變miR-187-3p+空載組轉(zhuǎn)染突變型miR-187-3p和空載質(zhì)粒，突變miR-187-3p+CircRHOT1 過表達(dá)組轉(zhuǎn)染突變型miR-187-3p和CircRHOT1 過表達(dá)質(zhì)粒，野生SOX4+miR-187-3p mimics陰性對(duì)照組轉(zhuǎn)染野生型SOX4 3'-UTR報(bào)告質(zhì)粒和miR-187-3p mimics陰性對(duì)照，野生SOX4+CircRHOT1 過表達(dá)組轉(zhuǎn)染野生型SOX4 3'-UTR報(bào)告質(zhì)粒和miR-187-3p mimics，突變SOX4+miR-187-3p mimics陰性對(duì)照組轉(zhuǎn)染突變型SOX4 3'-UTR報(bào)告質(zhì)粒和miR-187-3p mimics陰性對(duì)照，突變SOX4+CircRHOT1 過表達(dá)組轉(zhuǎn)染突變型SOX4 3'-UTR報(bào)告質(zhì)粒和miR-187-3p mimics，各組均于轉(zhuǎn)染24 h后收集細(xì)胞沉淀，采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒并依照其說明指導(dǎo)測(cè)定各組雙熒光素酶相對(duì)活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用軟件SPSS26.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料均采用±s表達(dá)。以單因素方差分析對(duì)多組間差異進(jìn)行比較，采用SNK-q檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩差異比較，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌細(xì)胞中CircRHOT1、miR-187-3p與SOX4表達(dá)檢測(cè)結(jié)果 與人正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A相比，人乳腺癌MCF-7、Hs-578T、MDA-MB-231細(xì)胞CircRHOT1、SOX4蛋白與mRNA表達(dá)明顯升高（P＜0.05），miR-187-3p表達(dá)明顯降低（P＜0.05）。見圖1、表2。

圖1 Western blot檢測(cè)人正常乳腺上皮細(xì)胞與乳腺癌細(xì)胞系SOX4表達(dá)Fig.1 Expression of SOX4 in human normal breast epithelial cells and breast cancer cell lines detected by Western blot

表2 各細(xì)胞circRHOT1、miR-187-3p與SOX4的相對(duì)表達(dá)水平（±s，n=6）Tab.2 Relative expression level of circRHOT1， miR-187-3p and SOX4 in each cell （±s， n=6）

表2 各細(xì)胞circRHOT1、miR-187-3p與SOX4的相對(duì)表達(dá)水平（±s，n=6）Tab.2 Relative expression level of circRHOT1， miR-187-3p and SOX4 in each cell （±s， n=6）

Note：Compared with MCF-10A cells， 1）P＜0.05.

SOX4 protein/GAPDH 0.33±0.04 0.82±0.091）0.69±0.141）0.74±0.081）Groups circRHOT1/GAPDH 1.03±0.16 2.26±0.221）1.90±0.111）2.04±0.201）miR-187-3p/U6 1.05±0.17 0.37±0.041）0.53±0.051）0.46±0.061）SOX4 mRNA/GAPDH 0.99±0.12 2.07±0.151）1.93±0.181）1.80±0.141）MCF-10A MCF-7 Hs-578T MDA-MB-231

2.2 各組MCF-7細(xì)胞CircRHOT1、miR-187-3p與SOX4表達(dá)檢測(cè)結(jié)果 與對(duì)照組相比，CircRHOT1敲低組細(xì)胞CircRHOT1、SOX4蛋白與mRNA表達(dá)降低（P＜0.05），miR-187-3p表達(dá)升高（P＜0.05）；miR-187-3p mimics組CircRHOT1表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），SOX4蛋白與mRNA表達(dá)降低（P＜0.05），miR-187-3p表達(dá)升高（P＜0.05）。與Circ-RHOT1敲低組相比，CircRHOT1敲低+miR-187-3p inhibitor組細(xì)胞CircRHOT1表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），SOX4蛋白與mRNA表達(dá)升高（P＜0.05），miR-187-3p表達(dá)降低（P＜0.05），共轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照組細(xì)胞CircRHOT1、miR-187-3p、SOX4蛋白與mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2、表3。

圖2 Western blot 檢測(cè)各組MCF-7細(xì)胞SOX4蛋白表達(dá)Fig.2 Detection of SOX4 protein expression in MCF-7 cells of each group by Western blot

表3 各組細(xì)胞CircRHOT1、miR-187-3p與SOX4的相對(duì)表達(dá)水平（±s，n=6）Tab.3 Relative expression levels of CircRHOT1， miR-187-3p and SOX4 in cells of each group （±s， n=6）

表3 各組細(xì)胞CircRHOT1、miR-187-3p與SOX4的相對(duì)表達(dá)水平（±s，n=6）Tab.3 Relative expression levels of CircRHOT1， miR-187-3p and SOX4 in cells of each group （±s， n=6）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.05； compared with CircRHOT1 knockdown group， 2）P＜0.05.

Groups CircRHOT1/GAPDH miR-187-3p/U6 SOX4 mRNA/GAPDH SOX4 protein/GAPDH Control CircRHOT1 knockdown miR-187-3p mimics Co-transfection negative control CircRHOT1 knockdown+miR-187-3p inhibitor 1.04±0.18 0.41±0.041）1.03±0.23 1.02±0.22 0.43±0.051）1.01±0.20 2.25±0.221）2.28±0.261）1.00±0.17 1.07±0.132）0.97±0.15 0.39±0.051）0.36±0.061）0.98±0.11 0.92±0.142）0.57±0.04 0.13±0.031）0.12±0.011）0.58±0.08 0.53±0.062）

2.3 各組MCF-7細(xì)胞增殖與凋亡檢測(cè)結(jié)果 與對(duì)照組相比，CircRHOT1敲低組、miR-187-3p mimics組細(xì)胞EdU陽性率與集落生成率降低（P＜0.05），凋亡率升高（P＜0.05）。與CircRHOT1敲低組相比，Circ-RHOT1敲低+miR-187-3p inhibitor組細(xì)胞EdU陽性率與集落生成率升高（P＜0.05），凋亡率降低（P＜0.05），共轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照組細(xì)胞EdU陽性率、集落生成率、凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖3～5、表4。

圖3 結(jié)晶紫染色檢測(cè)各組MCF-7細(xì)胞集落生成（×100）Fig.3 Detection of colony formation of MCF-7 cells in each group by crystal violet staining （×100）

圖4 EdU染色檢測(cè)各組MCF-7細(xì)胞增殖（×200）Fig.4 EdU staining to detect proliferation of MCF-7 cells in each group （×200）

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組MCF-7細(xì)胞凋亡Fig.5 Detection of apoptosis of MCF-7 cells in each group by flow cytometry

表4 各組細(xì)胞EdU陽性率、集落生成率、凋亡率（±s，n=6，%）Tab.4 EdU positive rate， colony generation rate and apoptosis rate of cells in each group （±s， n=6，%）

表4 各組細(xì)胞EdU陽性率、集落生成率、凋亡率（±s，n=6，%）Tab.4 EdU positive rate， colony generation rate and apoptosis rate of cells in each group （±s， n=6，%）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.05；compared with Circ-RHOT1 knockdown group， 2）P＜0.05.

Groups Control CircRHOT1 knockdown miR-187-3p mimics Co-transfection negative control CircRHOT1 knockdown+miR-187-3p inhibitor EdU positive rate 54.70±8.35 26.20±5.261）23.83±4.641）51.69±9.13 Colony generation rate 100.0±0.00 48.50±10.231）42.14±9.601）96.30±20.15 Apoptosis rate 3.20±0.91 54.91±10.201）49.65±11.141）2.97±0.93 48.78±8.382）90.10±18.302）6.01±1.952）

2.4 各組MCF-7細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2表達(dá)比值（Bax/Bcl-2）檢測(cè) 與對(duì)照組相比，CircRHOT1敲低組、miR-187-3p mimics組細(xì)胞Bax/Bcl-2升高（P＜0.05）。與CircRHOT1敲低組相比，CircRHOT1敲低+miR-187-3p inhibitor組細(xì)胞Bax/Bcl-2降低（P＜0.05），共轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照組細(xì)胞Bax/Bcl-2差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖6、表5。

圖6 免疫熒光檢測(cè)各組MCF-7細(xì)胞Bax與Bcl-2表達(dá)（×1 000）Fig.6 Expressions of Bax and Bcl-2 in MCF-7 cells of each group detected by immunofluorescence （×1 000）

表5 各組細(xì)胞Bax/Bcl-2（±s，n=6）Tab.5 Bax/Bcl-2 of cells in each group （±s，n=6）

表5 各組細(xì)胞Bax/Bcl-2（±s，n=6）Tab.5 Bax/Bcl-2 of cells in each group （±s，n=6）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.05；compared with Circ-RHOT1 knockdown group， 2）P＜0.05.

Bax/Bcl-2 0.31±0.06 0.59±0.101）0.62±0.121）0.29±0.07 0.36±0.092）Groups Control CircRHOT1 knockdown miR-187-3p mimics Co-transfection negative control CircRHOT1 knockdown+miR-187-3p inhibitor

2.5 各組人外周血淋巴細(xì)胞中活化CD8+T細(xì)胞比例及其對(duì)MCF-7細(xì)胞的殺傷率檢測(cè)結(jié)果 與對(duì)照組相比，CircRHOT1敲低組、miR-187-3p mimics組人外周血淋巴細(xì)胞中活化CD8+T細(xì)胞比例及其對(duì)MCF-7細(xì)胞殺傷率升高（P＜0.05）。與CircRHOT1敲低組相比，CircRHOT1敲低+miR-187-3p inhibitor組人外周血淋巴細(xì)胞中活化CD8+T細(xì)胞比例及其對(duì)MCF-7細(xì)胞殺傷率降低（P＜0.05），共轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照組人外周血淋巴細(xì)胞中活化CD8+T細(xì)胞比例及其對(duì)MCF-7細(xì)胞殺傷率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表6、圖7。

圖7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)人外周血淋巴細(xì)胞中活化CD8+T細(xì)胞比例Fig.7 Detection of proportion of activated CD8+T cells in human peripheral blood lymphocytes by flow cytometry

表6 各組人外周血淋巴細(xì)胞中活化CD8+T細(xì)胞比例及其對(duì)MCF-7細(xì)胞的殺傷率（±s，n=6，%）Tab.6 Proportion of activated CD8+T cells in human peripheral blood lymphocytes and their killing rate to MCF-7 cells in each group （±s， n=6，%）

表6 各組人外周血淋巴細(xì)胞中活化CD8+T細(xì)胞比例及其對(duì)MCF-7細(xì)胞的殺傷率（±s，n=6，%）Tab.6 Proportion of activated CD8+T cells in human peripheral blood lymphocytes and their killing rate to MCF-7 cells in each group （±s， n=6，%）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.05； compared with Circ-RHOT1 knockdown group， 2）P＜0.05.

Groups Control CircRHOT1 knockdown miR-187-3p mimics Co-transfection negative control CircRHOT1 knockdown+miR-187-3p inhibitor Proportion of activated CD8+T cells 9.20±0.84 18.35±2.161）20.11±3.051）8.91±1.02 11.64±1.312）Killing rate 13.01±1.67 44.24±9.841）49.67±10.051）12.90±1.73 16.12±3.462）

2.6 MCF-7細(xì)胞內(nèi)CircRHOT1對(duì)miR-187-3p、miR-187-3p對(duì)SOX4的靶向調(diào)節(jié) 查詢Starbase數(shù)據(jù)庫可知CircRHOT1 與miR-187-3p之間存在結(jié)合位點(diǎn)，見圖8A。與野生miR-187-3p+空載組比較，野生miR-187-3p+CircRHOT1過表達(dá)組相對(duì)熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05）；突變miR-187-3p+空載組與突變miR-187-3p+CircRHOT1過表達(dá)組之間相對(duì)熒光素酶活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表7。

圖8 通過Starbase數(shù)據(jù)庫查詢得到的CircRHOT1 與miR-187-3p、miR-181-3p與SOX4之間結(jié)合位點(diǎn)Fig.8 Binding sites between CircRHOT1 and miR-187-3p，miR-181-3p and SOX4 obtained by querying Starbase database

表7 各組細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性（±s，n=6）Tab.7 Relative luciferase activity of cells in each group（±s， n=6）

表7 各組細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性（±s，n=6）Tab.7 Relative luciferase activity of cells in each group（±s， n=6）

Note：Compared with wild miR-187-3p+empty group， 1）P＜0.05.

Relative luciferase activity Groups 1.05±0.27 0.35±0.041）1.03±0.12 1.01±0.19 Wild miR-187-3p+empty Wild miR-187-3p+CircRHOT1 overexpression Mutant miR-187-3p+no-load Mutant miR-187-3p+CircRHOT1 overexpression

查詢Starbase數(shù)據(jù)庫可知miR-187-3p與SOX4之間有結(jié)合位點(diǎn)存在，見圖8B。與野生SOX4+miR-187-3p mimics陰性對(duì)照組比較，野生SOX4+miR-187-3p mimics組相對(duì)熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05）；突變SOX4+miR-187-3p mimics陰性對(duì)照組與突變SOX4+miR-187-3p mimics組之間相對(duì)熒光素酶活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表8。

表8 各組細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性值（±s，n=6）Tab.8 Relative luciferase activity of cells in each group（±s，n=6）

表8 各組細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性值（±s，n=6）Tab.8 Relative luciferase activity of cells in each group（±s，n=6）

Note：Compared with wild SOX4+miR-187-3p mimics negative control group， 1）P＜0.05.

Relative luciferase activity 1.04±0.28 0.32±0.031）1.02±0.27 0.98±0.25 Groups Wild SOX4+miR-187-3p mimics negative control Wild SOX4+miR-187-3p mimics Mutant SOX4+miR-187-3p mimics negative control Mutant SOX4+miR-187-3p mimics

3 討論

如今乳腺癌臨床治療理念已從“最大可耐受治療”向“最小的有效治療”轉(zhuǎn)變，保乳手術(shù)逐漸取代了全乳房切除術(shù)，很多研究證實(shí)保乳術(shù)后留下的乳房組織微環(huán)境在后續(xù)治療中發(fā)揮積極作用，通過增強(qiáng)乳房組織中乳腺癌所處微環(huán)境中免疫細(xì)胞活性，可誘發(fā)抗腫瘤免疫反應(yīng)，促使全身乳腺癌細(xì)胞死亡，因此探尋有效抑制癌細(xì)胞增殖和免疫逃逸的手法對(duì)于改善乳腺癌患者預(yù)后具有積極意義［12-13］。CircRHOT1作為一種致癌基因，在乳腺癌中表達(dá)明顯升高，可促進(jìn)乳腺癌體內(nèi)生長(zhǎng)和惡性進(jìn)展，對(duì)其進(jìn)行敲除能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，并誘導(dǎo)其凋亡，還可誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，顯著促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌和胰腺癌細(xì)胞凋亡，降低其增殖活性［6，14-15］。本研究結(jié)果顯示，人乳腺癌MCF-7、Hs-578T、MDA-MB-231細(xì)胞CircRHOT1表達(dá)相比人正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A明顯升高，以CircRHOT1 siRNA質(zhì)粒敲低MCF-7細(xì)胞CircRHOT1表達(dá)，可降低CircRHOT1表達(dá)、EdU陽性率、集落生成率，提高細(xì)胞凋亡率、Bax/Bcl-2、人外周血淋巴細(xì)胞中活化CD8+T細(xì)胞比例及其對(duì)MCF-7細(xì)胞的殺傷率，表明敲低CircRHOT1可促進(jìn)促凋亡蛋白表達(dá)，降低乳腺癌細(xì)胞增殖活力，抑制其免疫逃逸，促進(jìn)人外周血淋巴細(xì)胞中CD8+T活化并增強(qiáng)其對(duì)MCF-7細(xì)胞殺傷力，對(duì)乳腺癌發(fā)揮明顯抗癌功效。

研究顯示，CircRHOT1介導(dǎo)癌癥發(fā)生發(fā)展的機(jī)制是通過海綿化miRNA來促進(jìn)致癌基因表達(dá)，查詢Starbase數(shù)據(jù)庫可知，CircRHOT1可能通過結(jié)合miR-187-3p來調(diào)控SOX4表達(dá)，且miR-187-3p可在多種癌癥中發(fā)揮抗腫瘤作用，其過度表達(dá)能損害結(jié)直腸癌細(xì)胞集落形成、細(xì)胞遷移和侵襲功能，并誘導(dǎo)增強(qiáng)其化療敏感性，且與轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者無進(jìn)展生存期和總生存期的增加有關(guān)，可顯著抑制乳腺癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡［8，16-17］；SOX4作為一種致癌基因在乳腺癌中高表達(dá)，并顯著促進(jìn)其腫瘤生長(zhǎng)和惡性進(jìn)展，敲除SOX4可抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并改善嵌合抗原受體T細(xì)胞功能，提升其對(duì)實(shí)體腫瘤的殺傷效果，因此推測(cè)敲除Circ-RHOT1抑制乳腺癌細(xì)胞增殖和免疫逃逸的分子機(jī)制可能是通過上調(diào)miR-187-3p來降低SOX4表達(dá)［10，18-19］。本研究結(jié)果顯示，人乳腺癌MCF-7、Hs-578T、MDA-MB-231細(xì)胞miR-187-3p表達(dá)相比人正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A明顯降低，SOX4蛋白與mRNA表達(dá)明顯升高，以CircRHOT1 siRNA質(zhì)粒敲低MCF-7細(xì)胞CircRHOT1表達(dá)，可升高miR-187-3p表達(dá)，降低SOX4蛋白與mRNA表達(dá)，且雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CircRHOT1可靶向下調(diào)miR-187-3p表達(dá)，miR-187-3p可靶向下調(diào)SOX4表達(dá)，說明CircRHOT1可通過調(diào)節(jié)miR-187-3p/SOX4軸介導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞增殖、凋亡和免疫逃逸，且miR-187-3p/SOX4軸參與敲低CircRHOT1對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖和免疫逃逸的抑制過程。另外聯(lián)合轉(zhuǎn)染CircRHOT1 siRNA質(zhì)粒和miR-187-3p inhibitor，相比單獨(dú)轉(zhuǎn)染CircRHOT1 siRNA質(zhì)粒，可升高SOX4蛋白與mRNA表達(dá)、EdU陽性率、集落生成率，降低miR-187-3p表達(dá)、凋亡率、Bax/Bcl-2、人外周血淋巴細(xì)胞中活化CD8+T細(xì)胞比例及其對(duì)MCF-7細(xì)胞殺傷率，說明下調(diào)miR-187-3p可減弱敲低CircRHOT1對(duì)乳腺癌細(xì)胞的抗增殖和促凋亡作用，拮抗其對(duì)免疫逃逸的抑制，最終消除其對(duì)乳腺癌的抗腫瘤功效，提示敲低CircRHOT1抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、免疫逃逸，并促使其凋亡是通過上調(diào)miR-187-3p實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，本研究證實(shí)了CircRHOT1可通過調(diào)節(jié)miR-187-3p/SOX4軸介導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞增殖、凋亡和免疫逃逸過程，敲低CircRHOT1可通過上調(diào)miR-187-3p而降低SOX4表達(dá)，從而明顯抑制乳腺癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡，促使CD8+T細(xì)胞活化并增強(qiáng)其殺傷力，減輕乳腺癌免疫逃逸，最終起到顯著抗癌作用，本研究揭示了調(diào)控乳腺癌生長(zhǎng)和免疫逃逸的新分子機(jī)制，有助于開發(fā)改進(jìn)其臨床免疫和分子靶向治療方法。