香芹酚-β-D-葡萄糖苷的合成及在卷煙中的應用

張改紅，石棟棟，許 航，杜 帥，尚紫博，謝俊杰，白 冰，毛多斌

鄭州輕工業大學煙草科學與工程學院，鄭州高新技術產業開發區科學大道136 號 450001

糖苷又被稱為潛香化合物，是許多天然香味成分的前體物質［1-4］，本身無味或氣味很弱，在常溫下性質較穩定，不易揮發、不易氧化分解，但在加熱、水解、酶解等條件下，糖苷鍵斷裂會釋放出具有特征香味的成分，從而達到緩釋香氣的目的［5-8］。因此，糖苷在煙草、食品等領域有較好的應用前景。張改紅等［9］合成了醬油酮葡萄糖苷，將其應用于卷煙中可以釋放出醬油酮，改善卷煙香氣品質。段海波等［10］合成了玫瑰醇-β-D-葡萄糖苷，將其應用于卷煙中可以減輕卷煙煙氣刺激性，改善香氣，使釋香更均勻。曾世通等［11］合成了β-紫羅蘭醇葡萄糖苷，將其加入卷煙中裂解可以生成多種香味成分，釋香均勻穩定。梁德民等［12］將合成的丁香酚-β-D-葡萄糖苷加入卷煙中抽吸時能釋放出丁香酚，并且丁香酚-β-D-葡萄糖苷具有良好的釋香穩定性和均勻性。

香芹酚（2-甲基-5-異丙基苯酚，FEMA 2245，COE 2055）具有麝香草酚氣味及草藥香氣，天然存在于牛至、樟木等植物的揮發油中［13-14］，廣泛用作煙用香料、食品添加劑、抗氧劑等［15-16］。香芹酚作為一種重要的煙用香料，對卷煙香氣具有正向作用，但香芹酚在空氣中易揮發、易氧化［17］，嚴重影響了其在卷煙加香中的穩定性。香芹酚-β-D-葡萄糖苷作為香芹酚的香味前體物，有望解決香芹酚在卷煙加香中存在的易揮發、加香不穩定等問題。但關于香芹酚-β-D-葡萄糖苷的合成、熱裂解、在卷煙中的熱解釋放行為及加香應用鮮見報道。因此，本研究中先利用相轉移催化法合成香芹酚-β-D-葡萄糖苷，然后通過熱裂解-氣相色譜-質譜（Py-GC-MS）技術考察香芹酚-β-D-葡萄糖苷的熱裂解行為，并通過GC-MS 法考察其在主流煙氣粒相中的熱解釋放行為，旨在為香芹酚-β-D-葡萄糖苷類香料前體物的加香應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

烤煙型卷煙樣品（浙江中煙工業有限責任公司提供）。

香芹酚（99%，國藥集團化學試劑有限公司）；四丁基溴化銨（Tetra-n-butylammonium bromide，TBAB，99%，北京百靈威科技有限公司）；乙酰溴-α-D-葡萄糖（98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；二氯甲烷（AR，太倉滬試試劑有限公司）；2,6-二氯甲苯（99%，山東禹王和天下新材料有限公司）。

CIJECTOR 香精香料注射儀（德國Burghart 公司）；RM20H 吸煙機（德國Brogwaldt 公司）；AB Sciex Triple TOF 6600 超高效液相色譜-高分辨質譜聯用儀（美國SCIEX 公司）；Avance Ⅲ超導核磁共振波譜儀（600 MHz，瑞士Bruker 公司）；Vertex 70 傅里葉變換紅外光譜儀（美國Bruker公司）；7890B-5977A氣相色譜-質譜聯用儀（美國Agilent 科技有限公司）；MS205DU 電子天平［感量0.01 mg，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］；微孔濾膜（孔徑0.22μm，南京全隆生物技術有限公司）；劍橋濾片（直徑44 mm，德國Borgwaldt KC GmbH 公司）。

1.2 方法

1.2.1 合成方法

采用相轉移催化法合成香芹酚-β-D-葡萄糖苷：將香芹酚（Ⅱ）與乙酰溴-α-D-葡萄糖（Ⅰ）進行糖苷化反應得到香芹酚-四乙酰基-β-D-葡萄糖苷（Ⅲ），再在CH3ONa/CH3OH 體系中脫去4 個乙酰基得到香芹酚-β-D-葡萄糖苷（Ⅳ）。具體合成路線如圖1所示。

圖1 香芹酚-β-D-葡萄糖苷的合成路線Fig.1 Synthesis route of carvacrol-β-D-glucopyranoside

1.2.1.1 香芹酚-四乙酰基-β-D-葡萄糖苷（Ⅲ）的合成

向500 mL 的圓底燒瓶中加入3.00 g（20 mmol）香芹酚、6.45 g（20 mmol）TBAB、8.22 g（20 mmol）乙酰溴-α-D-葡萄糖和100 mL 二氯甲烷，然后在混合物中添加40 mL 1 mol/L 的NaOH，室溫（25 ℃）下攪拌反應2 h。反應過程中采用薄層色譜法（Thin layer chromatography，TLC）進行監測，以V乙酸乙酯∶V石油醚=1∶2 的混合溶劑為展開劑。反應完畢后，向反應液中加入100 mL 乙酸乙酯進行稀釋，用100 mL 飽和NaCl水溶液洗滌3 次，合并有機相，向有機相中加入無水硫酸鎂，干燥12 h后過濾、減壓濃縮，得到4.08 g白色固體即為化合物Ⅲ。收率為42.5%。

1.2.1.2 香芹酚-β-D-葡萄糖苷（Ⅳ）的合成

向500 mL 的圓底燒瓶中加入2.40 g（5 mmol）香芹酚-四乙酰基-β-D-葡萄糖苷、150 mL 無水甲醇和15 mL 0.2 mol/L 的CH3ONa/CH3OH 溶液，室溫下攪拌4 h。反應過程中采用TLC 法進行監測，展開劑為V甲醇∶V二氯甲烷=1∶10的混合溶劑。反應完畢后，停止攪拌，加入適量硅膠粉，減壓濃縮，得到黃色粉末。采用硅膠柱層析法分離，先用V乙酸乙酯∶V石油醚=1∶3的混合溶劑進行洗脫，再用V甲醇∶V二氯甲烷=1∶16的混合溶劑進行洗脫。收集洗脫液，經減壓濃縮，得到1.21 g白色固體即為化合物Ⅳ。收率為77.5%。

1.2.2 香芹酚-β-D-葡萄糖苷（Ⅳ）的Py-GC-MS分析

采用Py-GC-MS 技術對化合物Ⅳ進行熱裂解分析。在He氣氛圍、無氧狀況下，分別對樣品進行3個不同溫度下（300、600、900 ℃）的熱裂解分析。

熱裂解條件：裂解探頭起始溫度為40 ℃，升溫速率為10 ℃/ms，最終將溫度升至300、600、900 ℃，分別保持15 s。

GC-MS條件：

色譜柱：RXI-5SiL-MS 毛細管柱（30 m×250 μm×0.25 μm）；進樣口溫度：280 ℃；載氣：He 氣，流速1 mL/min；分流比：100∶1；升溫程序：50 ℃（2 min）280 ℃（15 min）。離子源：EI；電離能量：70 eV；傳輸線溫度：280 ℃；四極桿溫度：150 ℃；離子源溫度：230 ℃；質量掃描范圍：50～500 amu。

采用NIST 20譜圖庫檢索定性分析裂解產物。

1.2.3 香芹酚-β-D-葡萄糖苷（Ⅳ）熱解轉移率的測定

1.2.3.1 卷煙加香

各稱取3 份質量均為0.2 g 的香芹酚-β-D-葡萄糖苷和香芹酚，分別溶解于體積為5、10和20 mL 70%乙醇中，配制成質量濃度分別為40、20 和10 mg/mL的香芹酚-β-D-葡萄糖苷溶液和香芹酚溶液，用超聲波輔助溶解。

（1）煙絲加香：用香精香料注射儀將體積為50 μL、質量濃度分別為40、20、10 mg/mL 的香芹酚-β-D-葡萄糖苷溶液和香芹酚溶液分別注射入空白卷煙中，得到煙絲加香量分別為2.0、1.0 和0.5 mg/支的香芹酚-β-D-葡萄糖苷或香芹酚的加香卷煙。

（2）卷煙紙加香：將50 μL 質量濃度為20 mg/mL的香芹酚-β-D-葡萄糖苷溶液或香芹酚溶液均勻涂布在卷煙紙上，得到卷煙紙加香量為1 mg/支的香芹酚-β-D-葡萄糖苷或香芹酚的加香卷煙。

采用煙絲加香和卷煙紙加香兩種方式制備空白對照卷煙（只添加等量的70%乙醇）。將空白對照卷煙和加香處理過的卷煙以及劍橋濾片置于相對濕度為60%±3%、溫度為（22±1）℃的恒溫恒濕箱中平衡48 h。

1.2.3.2 主流煙氣粒相中香芹酚轉移率的測定

（1）不同加香方式分析：取空白卷煙、1 mg/支加香量的煙絲加香卷煙和卷煙紙加香卷煙，用吸煙機在標準條件（抽吸容量35 mL，每口抽吸持續時間2 s，每60 s 抽吸一口）下抽吸，每種卷煙做2 組平行，每組抽吸20 支，每張劍橋濾片捕集20 支卷煙的主流煙氣粒相物。抽吸完畢后，將劍橋濾片與擦拭捕集器的脫脂棉一并放入50 mL 的錐形瓶中，加入20 mL的二氯甲烷和200 μL質量濃度為1.026 mg/mL的2,6-二氯甲苯內標溶液，超聲萃取20 min 后，用微孔濾膜過濾，進行GC-MS檢測。

（2）不同加香量分析：取空白卷煙及2.0、1.0 和0.5 mg/支加香量的煙絲加香卷煙，操作及測定方法同（1），進行GC-MS 檢測。

（3）逐口轉移率分析：取空白卷煙、1.0 mg/支加香量的煙絲加香卷煙，每張劍橋濾片分別捕集20 支卷煙的第2 至第5 口主流煙氣粒相物，操作及測定方法類同（1），進行GC-MS 檢測。與（1）中測定方法不同的是加入10 mL 的二氯甲烷和100 μL 質量濃度為1.026 mg/mL 的2,6-二氯甲苯內標溶液。

（4）轉移率計算方法：根據下式計算香芹酚在卷煙主流煙氣粒相的轉移率（Y，%）［9］。

式中：M為加香后卷煙主流煙氣粒相中香芹酚的質量，mg/支；M0為空白卷煙主流煙氣粒相中香芹酚的質量，mg/支；Me為卷煙中添加的香芹酚的量（添加香芹酚-β-D-葡萄糖苷時，則折算成香芹酚的量），mg/支。

1.2.3.3 GC-MS標準曲線繪制

稱取香芹酚標準品100.63 mg，用二氯甲烷定容至100 mL。使用移液管分別移取該溶液0.05、0.10、0.30、0.50、0.70、1.00、2.00、3.00、5.00 mL 于不同的10 mL 容量瓶中，各加入200 μL 質量濃度為1.026 mg/mL 的2,6-二氯甲苯內標溶液，用二氯甲烷定容至10 mL，配制成9 個系列標準品溶液，用微孔濾膜過濾，進行GC-MS檢測，繪制標準曲線。

1.2.3.4 GC-MS分析條件

色譜條件：

色譜柱：Agilent 19091S-436 HP-5ms 毛細管柱（60 m×250 μm×0.25 μm）；進樣量：1.0μL；進樣口溫度280 ℃；分流比：2∶1；載氣：He，流速1 mL/min；升溫程序：。

質譜條件：參考文獻［12］中的方法，掃描方式改為全掃描，采用NIST17 譜庫檢索方法進行定性分析，用內標-標準曲線法進行定量分析。

2 結果與討論

2.1 化合物Ⅳ的譜圖數據及結構解析

化合物Ⅲ和化合物Ⅳ的結構經1H NMR、13C NMR、FTIR 和HRMS 確證，譜圖解析結果如表1所示。

表1 1H NMR、13C NMR、FTIR和HRMS解析結果Tab.1 Analysis results of 1H NMR，13C NMR，FTIR，and HRMS spectra

分析1H NMR 和13C NMR 數據可知，化合物Ⅲ和化合物Ⅳ的區別在于，化合物Ⅲ的氫譜上有4 個乙酰基的氫信號峰［δ=2.05（s，6H），2.03（s，3H），2.01（s，3H）］，碳譜上有4 個乙酰基的碳信號峰（CH3：δ=20.81，20.73，20.67，20.62；C=O：δ=170.82，169.75，169.56，169.20），而化合物Ⅳ的譜圖上沒有相應的氫信號峰和碳信號峰，證明化合物Ⅳ中不含乙酰基。

分析FTIR 數據可知，化合物Ⅲ和化合物Ⅳ的區別在于，化合物Ⅲ含有1 758 cm-1和1 739 cm-1的C=O 雙鍵伸縮振動吸收峰；化合物Ⅳ中沒有相應的吸收峰，而是出現了3 429 cm-1羥基締合狀態的伸縮振動吸收峰。進一步證明，化合物Ⅳ中不含乙酰基，而是出現了羥基。

分析HRMS 數據可知，對于化合物Ⅲ，C24H32O10，計算值為498.233 4［M+NH4］+，實測值為498.233 3［M+NH4］+；對于化合物Ⅳ，C16H24O6，計算值為330.191 1［M+NH4］+，實測值為330.191 0［M+NH4］+。數據均在合理誤差范圍內，結合核磁共振數據，進一步證實了化合物Ⅲ和化合物Ⅳ的結構。

對于化合物Ⅲ和化合物Ⅳ中的糖苷鍵構型，可從吡喃環上端基質子的耦合常數進行判斷。化合物Ⅲ中端基質子的化學位移δ=5.13，J1，2=7.2 Hz；化合物Ⅳ中端基質子的化學位移δ=3.91，J1，2=6.0 Hz，符合規律（偶合常數J1，2=6～8 Hz，D-葡萄糖苷為β構型）。因此，化合物Ⅲ和化合物Ⅳ均為β構型。

2.2 化合物Ⅳ的熱裂解分析

化合物Ⅳ在不同溫度下的熱裂解產物如表2 所示。可知，在300、600、900 ℃下化合物Ⅳ的主要裂解產物均為香芹酚，香芹酚峰面積分別占總裂解產物峰面積的93.68%、90.75%和66.93%。300 ℃時裂解產物的種類較少，香芹酚所占的比例較高，隨著溫度的升高，裂解產物的種類逐漸增多，香芹酚所占的比例逐漸減小。900 ℃時裂解產物的種類最多，裂解產物中除了香芹酚外，還有4-甲基-4-戊烯-2-醇、甲苯、苯乙烯、4-異丙基苯酚、4-甲基-2-烯丙基苯酚等化合物。

表2 不同溫度條件下化合物Ⅳ的熱裂解產物Tab.2 Pyrolysis products of compound Ⅳat different temperatures

2.3 GC-MS標準曲線繪制及分析結果

2.3.1 標準曲線

經GC-MS 檢測后，將各標準品與內標的峰面積之比（y）與各標準品、內標的質量濃度之比（x）進行回歸分析，得到標準曲線y=1.279 9x-0.195 7，標準曲線的相關系數為0.999 7，在5.031 5～503.15 μg/mL質量濃度范圍內線性方程的相關性良好，可以用于定量分析。

2.3.2 GC-MS 分析結果

將香芹酚標準溶液、平衡48 h 的空白對照卷煙及添加香芹酚或香芹酚-β-D-葡萄糖苷加香卷煙的主流煙氣粒相物的萃取液，按照GC-MS 實驗條件進行分析，通過全掃描方式獲得的總離子流色譜圖見圖2。通過定性分析圖2 中的保留時間以及香芹酚標準品的質譜圖可確定香芹酚-β-D-葡萄糖苷的糖苷鍵斷裂生成了香芹酚。由圖2a 可知，香芹酚與內標2,6-二氯甲苯的分離效果良好。由圖2b 可知，未添加香芹酚或香芹酚-β-D-葡萄糖苷的空白對照卷煙主流煙氣中幾乎不含香芹酚。而添加香芹酚或香芹酚-β-D-葡萄糖苷的卷煙主流煙氣中均生成了具有特征香味的香芹酚（圖2c 和圖2d），表明添加香芹酚-β-D-葡萄糖苷的卷煙在燃吸過程中糖苷鍵發生斷裂生成了香芹酚。這與前面的熱裂解結論一致，糖苷類化合物受熱裂解生成相應的香料單體化合物。與圖2c 相比，圖2d 中香芹酚的離子強度較小，這可能是由于香芹酚-β-D-葡萄糖苷裂解產生的香芹酚轉移至主流煙氣中的量較少。

圖2 卷煙主流煙氣的總離子流色譜圖Fig.2 Total ion flow chromatogram of mainstream cigarette smoke

2.4 主流煙氣粒相中香芹酚的轉移率

2.4.1 兩種加香方式下香芹酚的轉移率分析

將空白卷煙、1.0 mg/支加香量的煙絲加香卷煙和卷煙紙加香卷煙在標準條件下抽吸，利用GC-MS分析兩種加香方式下香芹酚在主流煙氣粒相中的轉移率。結果表明，煙絲加香方式和卷煙紙加香方式下，添加香芹酚卷煙的主流煙氣粒相中香芹酚的轉移率分別為10.93%和10.04%，添加香芹酚-β-D-葡萄糖苷卷煙的主流煙氣粒相中香芹酚的轉移率分別為5.12%和3.89%。即不論是在煙絲加香方式還是在卷煙紙加香方式下，添加香芹酚卷煙的主流煙氣粒相中香芹酚轉移率均高于添加香芹酚-β-D-葡萄糖苷的卷煙，原因可能是在卷煙燃吸過程中香芹酚-β-D-葡萄糖苷裂解產生香芹酚的程度較小，轉移到主流煙氣中的量較少。

對于添加香芹酚的卷煙，煙絲加香方式下香芹酚的轉移率略高于卷煙紙加香方式；對于添加香芹酚-β-D-葡萄糖苷的卷煙，煙絲加香方式下香芹酚的轉移率明顯高于卷煙紙加香方式。原因可能是添加到煙絲中的香芹酚-β-D-葡萄糖苷受熱裂解產生的香芹酚主要被包裹在煙絲和卷煙紙中，因此抽吸時更容易進入主流煙氣；添加到卷煙紙上的香芹酚-β-D-葡萄糖苷，由于卷煙紙處在煙支的最外層，香芹酚-β-D-葡萄糖苷裂解產生的香芹酚更容易擴散到空氣中，即進入側流煙氣，從而導致進入主流煙氣中的量相對較少，而對于本身就易揮發的香芹酚來說，不同的加香方式對其轉移率的影響相對較小。因此，以不同加香方式在卷煙中添加香芹酚-β-D-葡萄糖苷，可達到不同的加香效果。

2.4.2 不同加香量對轉移率和釋放量的影響

在煙絲加香方式中不同加香量下，卷煙燃吸后產生的香芹酚在主流煙氣粒相中的轉移率和釋放量如圖3 所示。可知，隨著香芹酚加香量的增加，主流煙氣中香芹酚的釋放量呈先增加后減少的趨勢，可能是在加香量為0.5～1.0 mg/支時，加香量較小，隨著加香量的增加，香芹酚釋放量逐漸增加；在加香量為1.0～2.0 mg/支時，加香量超出氣溶膠的運載能力，加上香芹酚本身的損耗和濾嘴截留，使香芹酚的釋放量略有減少。而添加香芹酚-β-D-葡萄糖苷卷煙的主流煙氣中香芹酚的釋放量隨加香量的增加呈增大趨勢，原因可能是即使添加2.0 mg/支的香芹酚-β-D-葡萄糖苷，理論上裂解成香芹酚的量為0.96 mg/支，加香量仍相對較小，因此隨著加香量的增加，香芹酚的釋放量逐漸增加。

圖3 不同加香量下卷煙主流煙氣粒相中香芹酚的轉移率和釋放量Fig.3 Transfer rate and release amount of carvacrol to particulate phase of mainstream cigarette smoke at different flavoring amounts

添加香芹酚卷煙的主流煙氣粒相中香芹酚的轉移率隨加香量的增加呈下降趨勢，而添加香芹酚-β-D-葡萄糖苷卷煙的主流煙氣粒相中香芹酚的轉移率隨加香量的增加無明顯變化。對于添加香芹酚的卷煙，加香量為0.5～1.0 mg/支時，由于香芹酚本身易揮發，再加上濾嘴煙絲的截留，使香芹酚的釋放量并非隨著加香量的增加而呈線性增加，從而導致香芹酚的轉移率下降；加香量為1.0～2.0 mg/支時，香芹酚的釋放量有所下降，導致香芹酚的轉移率進一步下降。對于添加香芹酚-β-D-葡萄糖苷的卷煙，香芹酚的釋放量隨著加香量的增加呈線性增加的趨勢，因而香芹酚的轉移率基本不變。

由以上分析可知，添加香芹酚的卷煙主流煙氣粒相中香芹酚的轉移率隨加香量的增加呈下降趨勢，而對于添加香芹酚-β-D-葡萄糖苷卷煙主流煙氣粒相中香芹酚的轉移率，加香量的增加對其無明顯影響。

2.4.3 主流煙氣逐口轉移率分析

在煙絲加香方式下，1.0 mg/支加香量的卷煙主流煙氣中香芹酚的逐口轉移率結果如圖4 所示。可知，添加香芹酚-β-D-葡萄糖苷的卷煙主流煙氣中香芹酚的逐口轉移率基本一致，逐口穩定性較好，而添加香芹酚的卷煙主流煙氣中香芹酚的逐口轉移率隨抽吸口數序號的增大呈下降趨勢。表明添加香芹酚-β-D-葡萄糖苷的卷煙主流煙氣中香芹酚的釋放更加均勻、穩定。

圖4 卷煙主流煙氣中香芹酚的逐口轉移率Fig.4 Puff-by-puff transfer rates of carvacrol to mainstream cigarette smoke

2.5 在卷煙加香中的應用分析

將空白卷煙和加香（香芹酚、香芹酚-β-D-葡萄糖苷）卷煙進行對比分析可知，與空白卷煙相比，加香卷煙的主流煙氣中均生成了香芹酚，可以提供香芹酚的特征香氣；添加香芹酚-β-D-葡萄糖苷的卷煙主流煙氣中香芹酚的逐口轉移率更穩定、釋香更加均勻，加香效果優于香芹酚。由于香芹酚-β-D-葡萄糖苷在常溫下較穩定且耐高溫，因此可有效解決香芹酚常溫下易揮發、加香不穩定等問題。

3 結論

（1）采用相轉移催化法將乙酰溴-α-D-葡萄糖與香芹酚反應合成香芹酚-四乙酰基-β-D-葡萄糖苷，收率為42.5%；再在CH3ONa/CH3OH 體系中脫去乙酰基生成香芹酚-β-D-葡萄糖苷，收率為77.5%。經1H NMR、13C NMR、FTIR 和HRMS 分析確證了香芹酚-四乙酰基-β-D-葡萄糖苷和香芹酚-β-D-葡萄糖苷的結構。

（2）香芹酚-β-D-葡萄糖苷在300、600、900 ℃下的主要裂解產物均為香芹酚。添加香芹酚-β-D-葡萄糖苷的卷煙在燃吸過程中糖苷鍵發生斷裂生成香芹酚。

（3）以不同加香方式在卷煙中添加香芹酚-β-D-葡萄糖苷時，主流煙氣粒相中香芹酚的轉移率不同。添加香芹酚-β-D-葡萄糖苷的卷煙在抽吸時可在主流煙氣粒相中釋放香芹酚，且隨著加香量的增加香芹酚釋放量呈增大趨勢，而在主流煙氣粒相中香芹酚的轉移率則較穩定。

（4）逐口轉移率結果表明，在煙絲加香方式下添加香芹酚-β-D-葡萄糖苷的卷煙釋香更均勻、穩定，釋香效果優于香芹酚。