不同醇化卷煙原料表面微生物的群落結構及對大分子物質的降解功能

陳善義，陳千思，劉金燕，陳義強，范堅強，鄧小華，李菁菁，陶界錳*

1. 福建中煙工業有限責任公司技術中心，廈門市集美區濱水路298 號 361021

2. 中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術產業開發區楓楊街2 號 450001

煙葉中蛋白質、淀粉、纖維素、果膠和木質素等大分子物質的含量與煙葉品質緊密相關［1］，含量過高會降低煙葉品質［2-6］。醇化是提高煙葉品質的重要手段。醇化過程中片煙表面微生物種類豐富，且主要為細菌［7-8］，這些細菌可通過分泌不同種類的降解酶，將醇化片煙中的蛋白質、淀粉、纖維素、果膠和木質素等大分子物質轉化為對吸食品質有利的小分子物質，提高醇化片煙的品質［9-11］。目前，有關醇化烤煙片煙表面微生物的群落結構及對含碳、含氮有機化合物的降解功能已有報道。Zhou等［7］研究了不同醇化階段的片煙表面微生物的群落結構，并鑒定出參與含碳、含氮有機化合物降解的微生物；吳鑫穎［12］研究了不同香型、不同質量等級片煙在醇化過程中表面微生物群落結構的變化，并分析了優勢菌屬在碳水化合物降解方面的功能。然而，關于醇化烤煙煙梗和香料煙等醇化卷煙原料表面微生物的群落結構和對大分子物質的降解功能的研究還鮮見報道。因此，采用宏基因組測序技術，分析醇化2 年的烤煙煙梗、香料煙和烤煙片煙表面微生物的群落結構及對大分子物質的降解功能，挖掘與大分子物質降解相關的微生物種類，以期為醇化卷煙原料表面微生物資源的利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料、試劑和儀器

材料：供試的3種卷煙原料分別為廈門煙草工業有限責任公司倉庫中醇化2年的烤煙煙梗、香料煙以及龍巖煙草工業有限責任公司倉庫中醇化2 年的烤煙片煙，產地均為云南。每種醇化卷煙原料選取6箱，并于每箱的中心位置取500 g 作為醇化樣品，共計18份。

試劑：E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit試劑盒（美國Omega Bio-tek 公司）；DL 5000 DNA marker（北京擎科生物科技有限公司）；10×PBS 緩沖液（北京索萊寶科技有限公司）；NEB Next?UltraTMDNA Library Prep Kit for Illumina?試劑盒（美國New England Biolabs公司）。

儀器：FrescoTM17 型微量離心機、NanoDropTMOne/OneC 型超微量紫外分光光度計（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；770R 型回轉式振蕩恒溫培養箱（美國APLUS 公司）；FluorChem R 型全自動熒光與可見光凝膠成像分析儀（美國Protein Simple 公司）；AMD06-2-1.5+型磁力架（深圳市奧美頓科技有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 微生物的分離和富集

醇化樣品表面微生物的分離和富集參照文獻［13］中的方法進行。具體步驟：取15.0 g 醇化樣品置于1 000 mL 無菌塑料瓶中，加入350 mL 1×PBS緩沖液（10×PBS 用ddH2O 稀釋10 倍）、2.0 g 無菌石英砂和15 個無菌玻璃珠（直徑6 mm）后在低溫搖床中振蕩，洗脫醇化樣品表面的微生物。用無菌紗布過濾洗脫后的液體，再用無菌微孔濾膜［孔徑0.22 μm，直徑50 mm，生工生物工程（上海）股份有限公司］富集微生物。將收集的濾膜置于50 mL 無菌離心管中，加入15 個無菌鋼珠（直徑6 mm）和5 mL 1×PBS緩沖液，振蕩洗脫濾膜表面的微生物。將洗脫液轉移至1.5 mL無菌離心管中，2 000 r/min 離心2 min后轉移上清液至新的1.5 mL無菌離心管中，12 000 r/min離心3 min后收集微生物沉淀。

1.2.2 微生物總DNA 抽提、質量檢測及宏基因組測序

將1.2.1 節中收集的微生物沉淀置于1.5 mL 無菌離心管中，使用E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit試劑盒并按照其說明書進行微生物總DNA 提取。使用1%（質量分數）瓊脂糖凝膠對獲得的微生物總DNA 進行電泳檢測，使用NanoDrop 2000 超微量紫外分光光度計檢測DNA 濃度和純度。使用NEB Next?UltraTMDNA Library Prep Kit for Illumina?試劑盒并按照其說明書對DNA進行文庫構建，然后將DNA 文庫樣品送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行宏基因組測序。

1.2.3 宏基因組數據處理及分析

使用FastQC 軟件對原始測序數據進行質量評估；使用Trimmomatic軟件對原始測序數據進行質控后得到質控數據（Clean reads），將質量得分大于Q30（錯誤率≤0.1%）的序列通過IDBA_UD 組裝工具進行拼接組裝；使用Prodigal軟件對拼接結果進行開放閱讀框（ORF）預測。使用Bowtie2和SAMtools 軟件將預測的ORF 與非冗余基因集進行比對，并計算基因在各醇化樣品表面微生物群落中的相對豐度。對預測出的基因使用NR（Non-Redundant Protein Sequence）數據庫進行物種注釋，使用eggNOG（evolutionary genealogy of genes：Non-supervised Orthologous Groups）數據庫進行COG（Clusters of Orthologous Groups）功能注釋，使用KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）數據庫進行KEGG 功能注釋，使用CAZy（Carbohydrate-Active enZYmes）數據庫進行碳水化合物活性酶注釋［14］。

1.2.4 大分子物質含量檢測

參照YC/T 346—2010［15］中的方法測定醇化樣品的果膠含量（質量分數）；參照YC/T 347—2010［16］中的方法測定醇化樣品的纖維素和木質素含量（質量分數）；參照YC/T 216—2013［17］中的方法測定醇化樣品的淀粉含量（質量分數）；采用考馬斯亮藍法［18］測定醇化樣品的蛋白質含量（質量分數）。

1.2.5 數據統計和分析

使用SPSS 26.0軟件進行數據處理與統計分析，采用單因素方差分析（One-way ANOVA）中的最小顯著差數法（LSD）比較數據間的顯著性差異。使用RStudio 4.0.4 軟件中的vegan 程序包計算微生物群落的Shannon 和Simpson 多樣性指數。使用RStudio 4.0.4軟件計算大分子物質含量與微生物相對豐度（相對豐度大于1%）間的皮爾遜（Pearson）相關系數［19］。

2 結果與分析

2.1 不同醇化卷煙原料大分子物質含量

3種醇化卷煙原料中，果膠含量醇化烤煙煙梗最高，醇化烤煙片煙最低；纖維素含量醇化香料煙最高，醇化烤煙片煙最低；淀粉和蛋白質含量醇化香料煙均最高，醇化烤煙煙梗最低；木質素含量醇化烤煙煙梗最高，醇化烤煙片煙最低（圖1）。

圖1 不同醇化卷煙原料5種大分子物質含量Fig.1 Contents of five macromolecular substances in different aged cigarette raw materials

2.2 不同醇化卷煙原料表面微生物群落多樣性及群落結構

2.2.1 α多樣性

在屬水平上對3 種醇化卷煙原料表面微生物群落的多樣性進行分析，結果如圖2所示。醇化香料煙表面微生物群落的Shannon 指數和Simpson 指數最大，多樣性最高，與醇化烤煙片煙存在顯著差異，而醇化烤煙煙梗與醇化香料煙和醇化烤煙片煙間的差異均不顯著。

圖2 不同醇化卷煙原料表面微生物多樣性指數Fig.2 Diversity indexes of microorganisms communities on different aged cigarette raw materials

2.2.2 群落結構

18份醇化樣品共鑒定出2 344個菌屬，不同醇化樣品屬水平的物種相對豐度如圖3所示。所有醇化樣品的微生物群落均以細菌為主，細菌相對豐度之和為93.88%～99.25%。醇化烤煙煙梗的優勢菌屬為泛菌屬（Pantoea，1.42%～73.96%）、不動桿菌屬（Acinetobacter，1.38%～29.61%）、克雷伯氏菌屬（Klebsiella，1.58%～26.92%）和假單胞菌屬（Pseudomonas，0.55%～6.00%）；醇化香料煙的優勢菌屬為泛菌屬（Pantoea，24.46%～38.98%）、假單胞菌屬（Pseudomonas，10.12%～21.29%）和不動桿菌屬（Acinetobacter，2.01%～6.60%）；醇化烤煙片煙的優勢菌屬為泛菌屬（Pantoea，1.55%～63.72%）、芽孢桿菌屬（Bacillus，9.51%～52.75%）和土地芽孢桿菌屬（Terribacillus，1.26%～10.70%）。

圖3 不同醇化卷煙原料表面微生物（屬水平）相對豐度Fig.3 Relative abundances of surface microorganism（at genus level）on different aged cigarette raw materials

2.3 醇化卷煙原料大分子物質含量和表面微生物相對豐度相關性

根據各醇化樣品在屬分類水平的物種注釋及相對豐度信息，選取平均相對豐度排名前25 的菌屬與醇化樣品蛋白質、淀粉、纖維素、木質素和果膠含量進行相關分析，結果如表1 所示。相對豐度與蛋白質、淀粉、纖維素和果膠含量顯著相關的菌屬共計12個，未發現與木質素含量顯著相關的菌屬。微球黑粉菌屬（Microbotryum）的相對豐度與蛋白質含量顯著正相關，根霉菌屬（Rhizopus）、大腸桿菌屬（Escherichia）、鮑特菌屬（Bordetella）、寡養單胞菌屬（Stenotrophomonas）、腸球菌屬（Enterococcus）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、檸檬酸桿菌屬（Citrobacter）和克雷伯氏菌屬（Klebsiella）的相對豐度均與蛋白質含量顯著負相關。微球黑粉菌屬（Microbotryum）的相對豐度與淀粉含量顯著正相關，大腸桿菌屬（Escherichia）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）和檸檬酸桿菌屬（Citrobacter）的相對豐度均與淀粉含量顯著負相關。微球黑粉菌屬（Microbotryum）的相對豐度與纖維素含量顯著正相關。根霉菌屬（Rhizopus）、大腸桿菌屬（Escherichia）、鮑 特 菌 屬（Bordetella）、寡 養 單 胞 菌 屬（Stenotrophomonas）、腸球菌屬（Enterococcus）、克雷伯氏菌屬（Klebsiella）和不動桿菌屬（Acinetobacter）的相對豐度均與果膠含量顯著正相關，土壤芽孢桿菌屬（Terribacillus）和芽孢桿菌屬（Bacillus）的相對豐度均與果膠含量顯著負相關。

表1 微生物（屬水平）相對豐度與醇化樣品蛋白質、淀粉、纖維素和果膠含量的相關性①Tab.1 Correlations between relative abundances of microorganisms（at genus level）and the contents of protein，starch，cellulose，and pectin in the aged samples

2.4 不同醇化卷煙原料表面微生物基因功能

2.4.1 COG和KEGG功能注釋

對宏基因組測序數據進行ORF 預測，醇化烤煙煙梗、醇化香料煙和醇化烤煙片煙樣品分別預測出約16 萬個、25 萬個和8 萬個微生物基因，平均長度為613 479 bp。由圖4 可見，3 種醇化卷煙原料宏基因組測序數據的COG 注釋結果和KEGG 注釋結果整體類似，醇化卷煙原料表面微生物基因功能多與物質轉運和代謝相關。COG 注釋結果表明醇化卷煙原料表面微生物基因功能主要包括氨基酸轉運和代謝、碳水化合物轉運和代謝以及無機離子轉運和代謝；KEGG 注釋結果表明醇化卷煙原料表面微生物基因功能主要包括氨基酸代謝、碳水化合物代謝、能量代謝、輔酶因子和維生素代謝及核酸代謝。

圖4 不同醇化卷煙原料表面微生物功能基因的相對豐度Fig.4 Relative abundances of functional genes of surface microorganisms on different aged cigarette raw materials

2.4.2 碳水化合物活性酶基因數量

將宏基因組測序數據進行碳水化合物活性酶注釋后，統計不同醇化卷煙原料樣品表面微生物的各類碳水化合物活性酶基因數量，結果如圖5 所示。3種醇化卷煙原料表面微生物群落的碳水化合物活性酶基因中，糖苷水解酶基因數量最多，其次是糖基轉移酶基因、糖類酯解酶基因和氧化還原酶基因，多糖裂解酶基因數量最少。對3 種醇化卷煙原料表面微生物群落的碳水化合物活性酶基因數量進行比較，發現醇化香料煙氧化還原酶基因數量顯著高于醇化烤煙煙梗和醇化烤煙片煙；任2種醇化卷煙原料間糖類酯解酶和糖苷水解酶基因數量均無顯著差異；醇化香料煙糖基轉移酶和多糖裂解酶基因數量顯著高于醇化烤煙片煙，而醇化烤煙煙梗與醇化香料煙、醇化烤煙片煙間均無顯著差異。

圖5 不同醇化卷煙原料表面微生物的碳水化合物酶基因數量Fig.5 Numbers of CAZyme genes of surface microorganisms on different aged cigarette raw materials

2.4.3 大分子物質降解關鍵酶基因數量

內肽酶（Endopeptidase）和外肽酶（Exopeptidase）是蛋白質降解的關鍵酶［20］。由表2 可見，相對豐度與醇化樣品蛋白質含量顯著負相關的菌屬中含有的外肽酶基因多于內肽酶基因，鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、寡養單胞菌屬（Stenotrophomonas）和克雷伯氏菌屬（Klebsiella）的外肽酶和內肽酶基因較多，表明這些菌屬具有較強的蛋白質降解能力。

表2 相對豐度與醇化樣品蛋白質含量負相關菌屬中蛋白質降解關鍵酶基因數量Tab.2 Numbers of key enzyme genes involved in protein degradation in bacterial genera whose relative abundance was negatively correlated with protein content in the aged samples（個）

α-淀粉酶（Alpha-amylase）和α-葡萄糖苷酶（Alpha-glucosidase）是水解淀粉主鏈的關鍵酶，支鏈淀粉酶（Pullulanase）是水解淀粉支鏈的關鍵酶［21］。由表3可見，相對豐度與醇化樣品淀粉含量顯著負相關的菌屬中，鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）含有較多α-淀粉酶基因，表明鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）具有較強的淀粉降解能力。

表3 相對豐度與醇化樣品淀粉含量負相關菌屬中淀粉降解關鍵酶基因數量Tab.3 Numbers of key enzyme genes involved in starch degradation in bacterial genera whose relative abundance was negatively correlated with starch content in the aged samples（個）

果膠酯酶（Pectinesterase）、多聚半乳糖醛酸（內切）酶（Polygalacturonase）和半乳糖醛酸1，4-α-半乳糖醛酸酶（Galacturan 1，4-alpha-galacturonidase）是果膠降解的關鍵酶［22］。由表4 可見，相對豐度與醇化樣品果膠含量顯著負相關的菌屬中，僅有芽孢桿菌屬（Bacillus）含有11 個果膠酯酶基因，表明芽孢桿菌屬（Bacillus）具有較強的果膠降解能力。

表4 相對豐度與醇化樣品果膠含量負相關菌屬中果膠降解關鍵酶基因數量Tab.4 Numbers of key enzyme genes involved in pectin degradation in bacterial genera whose relative abundance was negatively correlated with pectin content in the aged samples（個）

3 討論

醇化2年后，香料煙中纖維素、淀粉、蛋白質和木質素含量均高于烤煙煙梗和烤煙片煙，且香料煙的微生物群落多樣性最高，推測原因是醇化香料煙含有的纖維素、淀粉、蛋白質和木質素等大分子物質較多，為微生物的生長提供了更多營養。醇化烤煙煙梗的優勢菌屬為泛菌屬（Pantoea）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、克雷伯氏菌屬（Klebsiella）和假單胞菌屬（Pseudomonas），僅假單胞菌屬（Pseudomonas）與李易非等［23］報道的醇化烤煙煙梗優勢菌屬一致，部分不一致的優勢菌屬如鏈霉菌屬（Streptomyces）、甲基桿菌屬（Methylobacterium）和鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）在本研究中不是優勢菌屬，可能是醇化時間不同所致。本研究中醇化烤煙片煙的優勢菌屬為泛菌屬（Pantoea）、芽孢桿菌屬（Bacillus）和土地芽孢桿菌屬（Terribacillus），這與Liu等［24］報道的醇化烤煙片煙表面的優勢菌屬相似，但與龔?。?5］報道的醇化烤煙片煙表面的優勢菌屬不一致，可能是產區不同所致。

在醇化烤煙煙梗、香料煙和烤煙片煙表面發現多個相對豐度與醇化樣品淀粉、蛋白質及果膠含量顯著負相關的菌屬，推測這些菌屬在淀粉、蛋白質或果膠降解中具有重要作用，這與Tao 等［26］報道的研究結果相似。在相對豐度與醇化樣品淀粉含量顯著負相關的鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）中鑒定出大量淀粉降解關鍵酶基因，證明鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）具有淀粉降解功能，這與Akter 等［27］報道的鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）分泌的酶能夠降解淀粉的結果一致。在相對豐度與醇化樣品蛋白質含量顯著負相關的菌屬中，鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、寡養單胞菌屬（Stenotrophomonas）和克雷伯氏菌屬（Klebsiella）含有較多蛋白質降解關鍵酶基因，表明這些菌屬具有蛋白質降解功能，這與Geueke 等［28］和Peng 等［29］的研究結果一致。在相對豐度與醇化樣品果膠含量顯著負相關的菌屬中，芽孢桿菌屬（Bacillus）含有較多果膠降解關鍵酶基因，該菌屬在醇化烤煙片煙中的相對豐度最高，且醇化烤煙片煙中果膠含量最低，說明芽孢桿菌屬（Bacillus）參與醇化烤煙片煙中果膠的降解，這與黃晨奕等［30］報道的芽孢桿菌屬（Bacillus）能顯著降低煙葉中果膠含量的結果相符。

4 結論

醇化2年的烤煙煙梗、香料煙和烤煙片煙表面共鑒定出2 344 個菌屬。醇化烤煙煙梗的優勢菌屬為泛菌屬（Pantoea）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、克雷伯氏菌屬（Klebsiella）和假單胞菌屬（Pseudomonas），醇化香料煙的優勢菌屬為泛菌屬（Pantoea）、假單胞菌屬（Pseudomonas）和不動桿菌屬（Acinetobacter），醇化烤煙片煙的優勢菌屬為泛菌屬（Pantoea）、芽孢桿菌屬（Bacillus）和土地芽孢桿菌屬（Terribacillus）。與醇化樣品淀粉、蛋白質和果膠含量顯著負相關的菌屬分別有3個［大腸桿菌屬（Escherichia）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）和檸檬酸桿菌屬（Citrobacter）］、8 個［根霉菌屬（Rhizopus）、大腸桿菌屬（Escherichia）、鮑 特 菌 屬（Bordetella）、寡 養 單 胞 菌 屬（Stenotrophomonas）、腸球菌屬（Enterococcus）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、檸檬酸桿菌屬（Citrobacter）和克雷伯氏菌屬（Klebsiella）］和2 個［土壤芽孢桿菌屬（Terribacillus）和芽孢桿菌屬（Bacillus）］。鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）具有較強的淀粉降解能力，鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、寡養單胞菌屬（Stenotrophomonas）和克雷伯氏菌屬（Klebsiella）具有較強的蛋白質降解能力，芽孢桿菌屬（Bacillus）具有較強的果膠降解能力。