‘紅地球’葡萄VvARF18功能分析

袁苗，周娟，黨仕卓，湯學燊，張亞紅

‘紅地球’葡萄功能分析

袁苗，周娟，黨仕卓，湯學燊，張亞紅

寧夏大學葡萄酒與園藝學院，銀川 750021

【目的】生長素響應因子ARF是生長素信號轉(zhuǎn)導途徑中的重要調(diào)控因子，在植物生長發(fā)育和各類生理過程中發(fā)揮著重要作用。分析‘紅地球’葡萄啟動子、異源表達、內(nèi)源激素含量及其對激素響應的表達，以探究在‘紅地球’葡萄生長素（IAA）信號轉(zhuǎn)導途徑及花芽分化進程中的作用機理。【方法】以設施‘紅地球’葡萄花芽為試驗材料，通過同源克隆獲得序列，利用在線數(shù)據(jù)庫PLACE分析啟動子的順式作用元件。以pCAMBIAI2300植物表達載體為基礎，通過雙酶切和同源重組法構(gòu)建植物超表達載體pC2300-。采用電擊法將重組載體pC2300-轉(zhuǎn)化至根癌農(nóng)桿菌GV3101菌株中，以本氏煙草葉片為外植體，通過農(nóng)桿菌介導的愈傷組織轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入煙草中，經(jīng)PCR檢測獲得陽性轉(zhuǎn)基因幼苗。利用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）對轉(zhuǎn)煙草株系表達水平進行分析，篩選出高表達量的轉(zhuǎn)基因株系培養(yǎng)至T3代，并分別進行IAA和GA3處理，以分析的表達情況。通過酶聯(lián)免疫法測定轉(zhuǎn)基因煙草花芽和葉片中的IAA、GA、ABA、CTK含量。【結(jié)果】‘紅地球’葡萄位于第13條染色體，含有3個外顯子和2個內(nèi)含子。啟動子區(qū)域存在多種光響應、植物激素響應和逆境響應的順式作用元件。表型分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因煙草的花芽分化進程快于野生型煙草。qRT-PCR結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)基因煙草花芽發(fā)育的4個時期中呈先上升后下降的表達趨勢，且S3時期表達量達到最高。轉(zhuǎn)基因煙草植株花芽和葉片中IAA、CTK、GA和ABA測定結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因煙草花芽和葉片中4種植物激素的含量均高于野生型植株，其中GA/IAA在轉(zhuǎn)基因煙草花芽發(fā)育的4個時期中變化趨勢與表達趨勢相一致。轉(zhuǎn)基因煙草植株經(jīng)IAA和GA3處理后，的表達量隨IAA處理濃度的增高而降低，也隨GA3處理時間的延長而降低。【結(jié)論】葡萄負調(diào)控生長素參與植物花芽分化進程，可能與赤霉素信號轉(zhuǎn)導途徑中的關(guān)鍵因子相互作用協(xié)同調(diào)控植物花芽中的激素水平，對植物花芽分化具有促進作用。

‘紅地球’葡萄；；轉(zhuǎn)基因植株；花芽分化；植物激素

0 引言

【研究意義】葡萄（）是世界上廣泛栽培的經(jīng)濟果樹之一。花芽分化是開花的先決條件，葡萄花芽分化的好壞直接影響葡萄的生長發(fā)育、成熟期以及產(chǎn)量和品質(zhì)[1]。在設施葡萄栽培中，由于棚膜老化透光率低，光照不均勻形成的弱光環(huán)境以及葉幕遮光等因素造成葡萄受光不足，從而導致葡萄花芽發(fā)育不良，成花能力差，嚴重影響了設施葡萄經(jīng)濟產(chǎn)量和產(chǎn)業(yè)發(fā)展[2-4]。因此，挖掘葡萄中與花芽分化相關(guān)的基因并研究其功能和作用機理，對解決花芽分化不良阻礙設施葡萄產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展問題具有重要的理論意義和實際應用價值。【前人研究進展】花芽分化是葡萄生長發(fā)育過程中十分重要的階段，葡萄花芽分化可分為生理分化和形態(tài)分化兩個階段[5]。生理分化即成花誘導，葡萄芽生長點內(nèi)部發(fā)生一系列生理變化，是決定芽未來發(fā)育性質(zhì)的關(guān)鍵時期[1]；形態(tài)分化跨越兩個生長季，花序分化時間相對較長，在新梢生長的當年完成，是決定葡萄第2年有無花的關(guān)鍵階段；花器官分化，于翌春萌芽前后至開花前完成，分化集中且短，主要決定花的質(zhì)量[6]。環(huán)境因素（光照、溫度、水分）、樹體營養(yǎng)（碳水化合物和礦質(zhì)元素）、栽培技術(shù)和內(nèi)源激素水平是影響葡萄花芽分化的主要因素[1,6]。生長素（auxin，IAA）是最先發(fā)現(xiàn)的植物內(nèi)源生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，在胚胎形成，維管束分化、莖的伸長、根的生長、花芽分化以及形態(tài)建成等植物發(fā)育過程中發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用[7-9]。生長素響應因子（auxin response factor，ARF）作為生長素信號轉(zhuǎn)導途徑中的重要作用元件，能夠特異地與生長素響應基因啟動子區(qū)域的生長素響應元件（auxin response element，AuxRE）“TGTCTC”結(jié)合，激活或抑制基因的表達，進而參與調(diào)控胚胎發(fā)生、葉片器官衰老、維管束形成、花和子葉發(fā)育等植物生長發(fā)育過程[10-12]。近年來，隨著基因組測序技術(shù)的快速發(fā)展，越來越多植物中的ARF家族成員被鑒定，在擬南芥（）[13]、煙草（）[14]、水稻（）[15]、大豆（）[16]、番茄（）[17]、黃瓜（）[18]、葡萄[19]、梨（）[20]等植物中分別鑒定出23、50、25、51、21、15、19和31個ARF家族成員。隨著對的深入研究，發(fā)現(xiàn)在植物花器官發(fā)育和花芽分化過程中扮演著重要角色。擬南芥參與花器官的發(fā)育[21-22]；和調(diào)控花器官成熟[23]；促進花藥及花粉管壁的形成[24]。番茄在花芽中的表達量最高，對花的發(fā)育具有促進作用[25]。ARF家族基因整體上在葡萄剛萌動的葉芽、休眠芽和果實中的表達量較高，在腋芽中表達量相對較低[26]；葡萄、和在果實發(fā)育過程中呈高水平表達，而在花中表達水平較高，表明可能參與調(diào)控葡萄花和果實的發(fā)育[19]；vvi-miR160c/d/e可能介導其靶基因在葡萄種子發(fā)育的特定階段調(diào)控種子的發(fā)育形成[27]。在番木瓜（）花芽分化進程中呈不斷上升的表達趨勢，推測可能參與番木瓜花芽的形成[28]。ARF不僅能與生長素響應基因特異結(jié)合引發(fā)生長素介導的多種生理效應，還能與其他植物激素相互作用影響植物生長發(fā)育[29]。在番茄坐果和發(fā)育過程中同時受生長素和赤霉素反應的調(diào)節(jié)作用[30]。【本研究切入點】筆者課題組前期對‘紅地球’葡萄花芽分化過程中4個發(fā)育階段的冬芽進行轉(zhuǎn)錄測序分析，通過KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)差異表達基因在植物激素信號轉(zhuǎn)導通路中顯著富集，其中在葡萄冬芽發(fā)育的后3個階段高度表達，推測在葡萄花芽分化過程中可能起到重要的調(diào)控作用。目前，關(guān)于ARF家族基因的研究多集中在一些模式植物上，且對與植物激素在葡萄芽發(fā)育過程中的生物功能及調(diào)控機制的研究較少，在葡萄花芽分化過程中的分子機理尚不明確，是否參與了葡萄花芽分化及其調(diào)控方式有待研究。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究構(gòu)建植物超表達載體，并獲得轉(zhuǎn)基因煙草材料，探究對煙草花芽發(fā)育的影響，為進一步開展參與葡萄花芽分化調(diào)控機理的研究提供參考。

1 材料與方法

試驗于2021—2022年在寧夏大學葡萄酒與園藝學院葡萄抗逆分子育種實驗室進行。

1.1 試驗材料

供試葡萄材料為10年生‘紅地球’葡萄（cv. Red Globe），栽培于銀川市賀蘭縣園藝產(chǎn)業(yè)園（106°16′ E，38°20′ N）15號陰陽結(jié)合型日光溫室。供試煙草材料在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)至4—6葉期備用。

試驗中所用的高保真酶、DNA Marker、限制性內(nèi)切酶、無縫克隆試劑盒均購自南京諾唯贊生物科技有限公司；膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、大腸桿菌（）DH5均購于北京天根生化科技有限公司；根癌農(nóng)桿菌（）菌株GV3103和pCAMBIA2300植物表達載體均由寧夏大學葡萄抗逆分子育種實驗室保存；引物合成和測序均由上海生工生物工程有限公司完成；其余試劑均為國產(chǎn)或進口分析純。

1.2 生物信息學分析

筆者課題組前期通過同源克隆獲得葡萄序列[31]。運用在線網(wǎng)站Grape Genome Browser（https:// www.genoscope.cns.fr/externe/GenomeBrowser/Vitis/）分析的染色體定位、內(nèi)含子及外顯子區(qū)域。使用在線工具ExPASy ProtParam（https://web.expasy. org/protparam/）分析VvARF18蛋白的基本理化性質(zhì)；利用在線數(shù)據(jù)庫PLACE（https://www.dna.affrc.go.jp/ PLACE/?action=newplace）預測ATG上游1 500 bp區(qū)域的啟動子順式作用元件。

1.3 VvARF18過表達載體的構(gòu)建

根據(jù)的編碼序列（coding sequence，CDS）設計植物表達載體的特異性引物（表1）。以‘紅地球’葡萄花芽反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，通過PCR擴增獲得目的片段。I和I雙酶切過表達載體pCAMBIAI2300后，將膠回收的目的片段與酶切后線性化載體通過同源重組的方法連接到一起，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆，經(jīng)測序驗證后得到pC2300-植物過表達載體。

1.4 轉(zhuǎn)基因本氏煙草株系的獲得及鑒定

pC2300-植物過表達載體通過電擊法轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)，然后利用根癌農(nóng)桿菌GV3101轉(zhuǎn)化煙草葉盤[32]，用50 mg·L-1的卡那霉素和潮霉素篩選出20個轉(zhuǎn)基因煙草株系，實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）鑒定出10個轉(zhuǎn)基因煙草株系并分析基因在轉(zhuǎn)基因陽性植株的相對表達量，確定過表達煙草株系。隨后對T1代種子進行分離，并在培養(yǎng)箱中繁殖出相應的T3代轉(zhuǎn)基因植株。

1.5 植物激素的測定

參考劉鑫等[33]的方法提取本氏煙草幼葉（莖2—3節(jié)）、嫩葉（莖6—7節(jié)）、老葉（莖10—12節(jié)）和花芽發(fā)育S1（0.5 cm）、S2（1 cm）、S3（1.5 cm）、S4（2 cm）4個時期中的植物激素，植物激素的測定使用酶聯(lián)免疫試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司），使用酶標儀（Labsystems Multiskan MS-352）測定生長素、赤霉素（gibberellin，GA）、細胞分裂素（cytokinin，CTK）、脫落酸（abscisic acid，ABA）含量[34]，試驗設置3次生物學重復。

1.6 VvARF18對生長素和赤霉素的響應

為進一步探究對生長素的響應，選取4—6周生長一致的轉(zhuǎn)基因本氏煙草，外源噴施IAA和GA3，處理方法參考LAKEHAL等[35]，配制1 mmol·L-1的IAA母液和GA3母液，在此基礎上分別稀釋至20、50和100 μmol·L-1濃度對轉(zhuǎn)基因煙草進行噴施處理，篩選出最佳濃度，分別處理1、3、5和8 h，每個處理3個重復，以外源噴施無菌水為對照（CK），將處理后的煙草采集統(tǒng)一位置葉片用錫紙包裹住，迅速用液氮冷凍，保存至超低溫冰箱。提取不同處理的煙草葉片總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后，參考袁苗等[31]反應體系和反應程序進行qRT-PCR，分析噴施不同濃度和不同處理時間下生長素和赤霉素對葡萄表達的影響。

1.7 數(shù)據(jù)處理和分析

使用Excel 2019整理數(shù)據(jù)，并采用IBM SPSS 25.0對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，利用單因素ANOVA檢驗和Student’s-test進行顯著性分析（＜0.05），然后使用Origin Pro 2021作圖。試驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差（SD）表示，試驗設置3次生物學重復。

表1 引物列表

下劃線部分為限制性內(nèi)切酶位點 The underlined sequences are the site of restriction endonuclease

2 結(jié)果

2.1 VvARF18的生物信息學分析

定位于第13條染色體，含有3個外顯子，2個內(nèi)含子；VvARF18中丙氨酸占比最高，為6.9%，分子量約為74.82 kDa，理論等電點pI為6.43，不穩(wěn)定指數(shù)為49.07，GRAVY（grand average of hydropathicity）值為-0.404，屬于酸性不穩(wěn)定親水蛋白（圖1）。

2.2 VvARF18啟動子分析

選取上游1 500 bp區(qū)域的啟動子序列并利用PlantCARE在線軟件進行分析，該基因啟動子區(qū)域除TATA-box、CAAT-box等一些基本順式作用元件外，還存在光響應元件G-Box、G-box、AE-box、Box 4、TCCC-motif和GT1-motif；激素響應元件TGACG-motif、AuxRR-core、ABRE和P-box；同時還包含低溫響應的順式作用元件LTR和參與干旱脅迫的順式元件MBS（表2）。

2.3 VvARF18在煙草中的遺傳轉(zhuǎn)化和陽性鑒定

通過同源重組獲得pC2300-重組質(zhì)粒（圖2-A）。對構(gòu)建的pC2300-重組質(zhì)粒進行PCR檢測，經(jīng)檢測已正向插入pC2300表達載體中，過表達載體pC2300-構(gòu)建成功（圖2-B）。進一步使用葉盤轉(zhuǎn)化法將pC2300-重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至煙草葉片中，通過抗性篩選后仍正常生長的煙草幼苗為陽性植株，說明已成功轉(zhuǎn)入煙草的基因組中（圖2-C）。

為進一步探究在轉(zhuǎn)基因煙草植株中的表達情況，采用qRT-PCR對轉(zhuǎn)基因煙草的表達量進行測定。10個轉(zhuǎn)基因煙草株系中的表達量存在差異，其中轉(zhuǎn)基因煙草株系OE#1、OE#2、OE#5、OE#7、OE#8、OE#10的表達量顯著高于野生型（CK）。此外，OE#1、OE#7和OE#8的表達量顯著高于其他轉(zhuǎn)基因株系（圖3），因此，挑選出OE#1、OE#7和OE#8轉(zhuǎn)基因煙草植株培養(yǎng)至T3代進行異源表達的功能分析。

2.4 轉(zhuǎn)基因煙草表型分析

通過對T3代轉(zhuǎn)基因煙草植株與野生型煙草植株的表型觀察發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)入葡萄的煙草能夠正常的生長發(fā)育及開花結(jié)果，進一步觀察本氏煙草花芽分化進程時發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因煙草的花芽分化進程要快于野生型煙草植株，說明轉(zhuǎn)基因煙草生殖生長階段快于野生型煙草，葡萄對花芽分化進程具有促進作用（圖4-A）。

2.5 轉(zhuǎn)基因煙草不同發(fā)育時期花芽中VvARF18的表達特性分析

為進一步研究在花芽分化進程中的功能，首先采集轉(zhuǎn)基因煙草植株不同發(fā)育時期的花芽（圖4-B），利用qRT-PCR對在轉(zhuǎn)基因煙草花芽發(fā)育4個時期的表達模式進行分析。結(jié)果顯示（圖4-C），在轉(zhuǎn)基因煙草花芽發(fā)育的4個時期中呈現(xiàn)出先上升后下降的表達趨勢，且在花芽發(fā)育的S3時期表達量最高，分別約為S1、S2、S4時期的2.8、2.4和6.1倍，表明可能參與植物花芽發(fā)育過程，對植物花芽分化具有促進作用。

2.6 轉(zhuǎn)基因煙草不同花芽發(fā)育時期中植物激素水平分析

轉(zhuǎn)基因煙草花芽中IAA、CTK、GA和ABA 4種植物激素的含量均高于野生型煙草（圖5），說明轉(zhuǎn)基因煙草植株中各植物激素代謝相對較旺盛，對植株的花芽分化具有良好的促進作用。GA和ABA在轉(zhuǎn)基因煙草4個發(fā)育時期的花芽中呈先上升后下降的變化趨勢，這與在轉(zhuǎn)基因煙草花芽發(fā)育4個時期中的表達趨勢類似，說明可能與GA和ABA協(xié)同參與植物花芽分化進程。IAA和CTK在轉(zhuǎn)基因煙草花芽發(fā)育的4個時期中變化趨勢與的表達趨勢均相反，呈現(xiàn)出先下降后上升的趨勢，表明可能負調(diào)控IAA參與植物花芽分化進程。

A：植物超表達載體pC2300-VvARF18構(gòu)建過程示意圖。B：重組載體pC2300-VvARF18的菌液PCR檢測，M：DL4500 bp DNA marker；泳道1—3：pC2300-VvARF18菌液PCR檢測。C：農(nóng)桿菌介導的煙草葉片組織培養(yǎng)，a：煙草葉片共培養(yǎng)；b：誘導轉(zhuǎn)基因煙草的愈傷組織；c：篩選的陽性植株；d：分化過程；e：生根培養(yǎng)的轉(zhuǎn)基因植株

OE#1—10表示轉(zhuǎn)基因植株的不同株系 OE#1-10 indicate different strains of transgenic plant。*: P＜0.05；**: P＜0.01

表2 VvARF18啟動子順式作用元件分析

WT：野生型煙草；OE：轉(zhuǎn)基因煙草。不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05）。下同

圖5 轉(zhuǎn)基因煙草不同發(fā)育時期花芽中激素含量

進一步分析發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因煙草4個發(fā)育時期的花芽中各植物激素比值的變化趨勢相差較大（圖6）。在野生型煙草花芽發(fā)育的4個時期中，CTK/IAA、ABA/GA和ABA/IAA均呈現(xiàn)出先下降后上升的變化趨勢；CTK/ IAA和ABA/IAA在轉(zhuǎn)基因煙草中呈先上升后下降的趨勢，ABA/GA呈上升趨勢，而GA/IAA的變化趨勢與在轉(zhuǎn)基因煙草花芽發(fā)育4個時期中表達趨勢相一致，表明作為生長素信號轉(zhuǎn)導途徑中起負調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子可能與赤霉素、細胞分裂素及脫落酸信號轉(zhuǎn)導途徑中的關(guān)鍵因子相互作用協(xié)同調(diào)控植物花芽中的激素水平，從而促進植物花芽分化的進程。

2.7 轉(zhuǎn)基因煙草不同葉片組織中植物激素水平分析

轉(zhuǎn)基因煙草植株的3種葉片組織中,IAA、CTK和ABA的含量均顯著高于野生型煙草，GA在野生型煙草幼葉中的含量顯著高于轉(zhuǎn)基因煙草，而在轉(zhuǎn)基因煙草嫩葉和老葉中的含量顯著高于野生型煙草（圖7），表明轉(zhuǎn)基因煙草植株中各內(nèi)源激素在葉片組織中的代謝與積累水平相對較好，能夠促進植株功能葉片的良好發(fā)育。

2.8 外源IAA和GA處理對轉(zhuǎn)基因煙草中VvARF18表達的影響

ARF作為植物生長素響應的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在植物生長發(fā)育過程中可與下游目的基因特異性結(jié)合并調(diào)控其表達，從而引發(fā)IAA介導的諸多生理效應。圖8顯示，IAA處理后，轉(zhuǎn)基因煙草中的表達量總體呈現(xiàn)下降的趨勢，隨著噴施IAA濃度的增高，轉(zhuǎn)基因煙草中的表達量逐步降低（圖8-A）。20 μmol·L-1IAA處理后，轉(zhuǎn)基因煙草中呈先升高后下降的趨勢，的表達量在3 h達到最高，之后逐漸降低（圖8-B）。說明IAA水平能夠影響的表達，推測高水平IAA可能促進VvARF18蛋白的降解，植物體內(nèi)ARF18蛋白的降解容易受IAA水平的影響，也說明在植物生長素信號轉(zhuǎn)導途徑中起負調(diào)控作用。生長素在生物合成水平上與GA存在相互作用[27]。GA3處理后，轉(zhuǎn)基因煙草中的表達量呈先下降后上升的變化趨勢，且在100 μmol·L-1GA3處理下的表達量達到峰值（圖8-C）。100 μmol·L-1GA3使轉(zhuǎn)基因煙草中呈下降表達趨勢，在1 h時表達量達到峰值（圖8-D）。

圖6 轉(zhuǎn)基因煙草不同發(fā)育時期花芽中激素含量的比值

圖7 轉(zhuǎn)基因煙草不同葉片組織中激素含量

圖8 VvARF18在外源IAA和 GA3處理下的表達

3 討論

3.1 VvARF18序列特征

ARF是生長素信號轉(zhuǎn)導途徑中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，能夠特異性結(jié)合生長素響應基因啟動子區(qū)域的AuxRE元件，調(diào)控生長素應答基因的表達，從而影響植物生長發(fā)育[25]。本研究發(fā)現(xiàn)VvARF18屬于植物特有的ARF家族蛋白成員，這與白云赫等[27]從‘魏可’葡萄中克隆的結(jié)果一致。VvARF18蛋白性質(zhì)及結(jié)構(gòu)與WAN等[19]從葡萄基因組中篩選獲得的VvARF18蛋白類似。VvARF18蛋白與擬南芥AtARF3蛋白結(jié)構(gòu)相類似，而在早期花發(fā)育階段中發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用，推測可能在葡萄花芽發(fā)育過程也具有重要的調(diào)節(jié)作用[36]。啟動子不僅具有核心啟動元件，還在高等植物的基因表達調(diào)控中發(fā)揮著重要作用[37]。白云赫等[27]發(fā)現(xiàn)啟動子中除了含有基本的作用元件之外，還含有光響應作用元件，脅迫相關(guān)作用元件及激素類響應元件。而本研究通過對啟動子分析發(fā)現(xiàn)，葡萄啟動子中包含多個光信號、生長素和赤霉素相關(guān)的順式作用元件，還含有低溫、鹽脅迫及干旱脅迫等逆境脅迫相關(guān)的順式作用元件，由此推測可能參與生長素和赤霉素等植物激素信號通路，協(xié)同調(diào)控葡萄花芽發(fā)育進程。

3.2 ARF在花芽分化中的功能

花芽分化是植物開花的前提，植物激素在這個過程中起重要調(diào)節(jié)作用，并在體內(nèi)具有一定的動態(tài)平衡，且通過平衡互作調(diào)控植物花芽分化過程[38]。本研究觀察異源表達的轉(zhuǎn)基因煙草，發(fā)現(xiàn)其花芽分化進程和花器官的形態(tài)建成要快于野生型煙草，表明參與植物花芽發(fā)育和花器官形態(tài)建成過程，與SONG等[39]在果梅（）中的研究結(jié)果類似。朝倉花椒（）和在花中的表達水平較高，可能在早期花發(fā)育過程中起重要作用[40]。在處于始分化期的葡萄花芽中表達量較高，表明的高表達可能會促進葡萄花芽分化進程[31]。本研究中在轉(zhuǎn)基因煙草花芽發(fā)育的4個時期中呈先升后降的表達趨勢，且在S3時期時表達量達到最高，表明對植物花芽分化進程具有促進作用，與前期研究結(jié)果類似[31,40]。植物內(nèi)源激素是果樹花芽分化的關(guān)鍵誘導因子之一，對花芽分化的順利進行起著重要的調(diào)控作用。在果梅花芽發(fā)育過程中，GA含量變化和的表達趨勢一致；ABA和CTK含量變化總體上與的表達呈相反的趨勢；而在成熟花器官中IAA的含量變化與的表達表現(xiàn)出相反的趨勢[29]。本研究推測可能受到GA與ABA的正調(diào)控作用和IAA與CTK負調(diào)控作用，協(xié)同參與植物花芽分化進程，促進成花誘導，與果梅的研究結(jié)果略有不同，主要原因可能是物種與基因功能存在差異。植物的花芽分化不僅受單一激素的影響，也受各種內(nèi)源激素相互作用，協(xié)調(diào)達到一種動態(tài)平衡關(guān)系，調(diào)控植物花芽分化進程。CTK/IAA、ABA/IAA、CTK/GA、IAA/GA、ABA/GA之間的動態(tài)平衡與綜合作用促進了杏（）的花芽分化，對花期的調(diào)控具有重要意義[41]。較高的CTK/IAA、ABA/IAA和GA/IAA的比值有利于棗（）花芽分化和花芽形成[42]。本研究發(fā)現(xiàn)GA/IAA的變化模式與的表達趨勢相吻合，推測可能與GA、CTK和ABA信號轉(zhuǎn)導途徑中的關(guān)鍵因子相互作用協(xié)同調(diào)控植物花芽中的激素水平。

3.3 ARF響應植物激素調(diào)控

ARF不僅在植物生長素信號途徑中發(fā)揮著重要的作用，對其他植物激素信號轉(zhuǎn)導調(diào)控途徑也產(chǎn)生重要影響[10]。麻風樹（）/在IAA處理1 h后顯著上調(diào)表達，推測這些基因可能參與生長素的響應調(diào)控[43]。在薔薇科植物月季（）中，的表達量隨著生長素濃度的升高而降低，并以依賴生長素的方式調(diào)控雄蕊和花瓣器官的發(fā)育[44]。擬南芥AtARF6/8特異性地與轉(zhuǎn)錄因子BZR1和PIF4相互作用，協(xié)同響應GA和IAA激素信號，以調(diào)控胚軸細胞伸長和花芽器官的發(fā)育[45]。番茄降低的表達可誘發(fā)單性果實的形成，在番茄坐果和發(fā)育過程中起到IAA和GA激素信號反應調(diào)節(jié)劑的作用[30]。本研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草中的表達量隨IAA濃度的增高而降低，的表達受IAA水平高低的影響。

4 結(jié)論

‘紅地球’葡萄位于第13條染色體，含有3個外顯子，2個內(nèi)含子，其啟動子區(qū)域含有光響應、植物激素響應及逆境響應的順式作用元件。參與植物花芽發(fā)育過程，對植物花芽分化具有促進作用，其可能通過與GA、CTK和ABA信號轉(zhuǎn)導途徑中的關(guān)鍵因子相互作用協(xié)同調(diào)控植物花芽中的激素水平，從而促進植物花芽分化的進程。IAA濃度水平能夠影響的表達，與GA在IAA調(diào)控植物生長發(fā)育和花芽分化過程中可能存在協(xié)同作用。

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Functional Analysis ofGene in Red Globe Grape

YUAN Miao, ZHOU Juan, DANG ShiZhuo, TANG XueShen, ZHANG YaHong

College of Enology and Horticulture, Ningxia University, Yinchuan 750021

【Objective】Auxin response factor (ARF) is a significant regulatory factor in the auxin signaling pathway and plays an important role in plant growth and development as well as various physiological processes.Analysis of the Red Globe grapepromoter, heterologous expression, endogenous hormone content and its expression in response to hormones was made in order to explore the mechanism ofgene in the auxin (IAA) signaling pathway and flower bud differentiation process in Red Globe grapes.【Method】Thegene sequence was obtained by homologous cloning by using facility Red Globe grape flower buds as experimental materials. The cis-acting elements of the promoter were analyzed using the online database PLACE. The plant overexpression vector pC2300-was constructed based on the pCAMBIAI2300 plant expression vector by double enzyme digestion and homologous recombination method. The recombinant vector pC2300-was transformed intostrain GV3101 by using electrical shock method. The tobacco leaves were used as explants and transferred into tobacco by-mediated callus transformationmethod, and positive transgenic seedlings were obtained by PCR. The quantitative real-time PCR (qRT-PCR) was used to analyze the expression level oftransgenic tobacco lines, and the transgenic lines with high expression level were screened and cultured to T3 generation, and treated with IAA and GA3to analyze the expression level of. The content of IAA, GA, ABA and CTK in flower buds and leaves of transgenic tobacco were determined by enzyme-linked immunosorbent assay. 【Result】of Red Globe grape located on chromosome 13, and contained 3 exons and 2 introns.There are multiple cis-acting elements in thepromoter region that respond to light, plant hormones, and stress.The phenotypic analysis found that the process of flower bud differentiation was faster in transgenic tobacco than in wild-type tobacco. The qRT-PCR results showed that the expression of VvARF18 showed an increasing and then decreasing trend during the four periods of flower bud development in transgenic tobacco, and the highest expression level was reached in the S3 stage. The results of IAA, CTK, GA and ABA determination in flower buds and leaves of transgenic tobacco plants showed that the content of four plant hormones in flower buds and leaves of transgenic tobacco plants were higher than those of wild-type plants. The change trend of GA/IAA during the four periods of transgenic tobacco flower bud development were consistent with the expression trend of. The expressionlevel ofVvARF18 in transgenic tobacco plants treated with IAA and GA decreased with the increase of IAA treatment concentration and alsodecreased with the extension of GA3treatmenttime.【Conclusion】Grapenegatively regulated auxin to participate in the process of plant flower bud differentiation, which could interact with key factors in the gibberellin signaling pathway to synergistically regulate hormone levels in plant flower buds and had a facilitative effect on plant flower bud differentiation.

Red Globe grape;; transgenic plants; flower bud differentiation; phytohormone

10.3864/j.issn.0578-1752.2024.07.012

2023-05-11；

2024-02-29

寧夏回族自治區(qū)重點研發(fā)計劃（2021BEF02016）

袁苗，E-mail：yuanmiao970915@163.com。通信作者張亞紅，E-mail：zhyhcau@sina.com

（責任編輯 趙伶俐）