拮抗青枯雷爾氏菌的放線菌篩選及其防病作用

廖鑫琳，郭鑫，楊季學，邵嘉朱，袁歆瑜，胡佳燕，陳曉曉，蔣冬花

拮抗青枯雷爾氏菌的放線菌篩選及其防病作用

廖鑫琳，郭鑫，楊季學，邵嘉朱，袁歆瑜，胡佳燕，陳曉曉，蔣冬花

浙江師范大學生命科學學院，浙江金華 321000

【目的】青枯雷爾氏菌（）引起的青枯病是煙草的主要病害。本研究從不同生境的土壤中篩選出對青枯雷爾氏菌有較強拮抗作用的放線菌，探究其對青枯雷爾氏菌的生理特征影響以及對煙草青枯病的防治效果，為進一步開發防病微生物菌劑提供理論依據。【方法】利用共培養法和牛津杯法篩出目標放線菌后，通過形態學研究、生理生化試驗和多基因系統發育分析對目標菌株進行菌種鑒定。通過96孔板法測定目標放線菌粗浸膏對青枯雷爾氏菌的最低抑菌濃度（MIC）。粗浸膏對青枯雷爾氏菌處理后，檢測青枯雷爾氏菌的生長動態變化，并用掃描電子顯微鏡觀察其形態的變化；通過測定-半乳糖苷酶活性和碘化丙啶（PI）熒光試驗以及傅里葉變換紅外光譜觀察對細胞膜通透性和膜成分的影響；通過測定胞外多糖（EPS）、胞內活性氧（ROS）等探究目標放線菌株對青枯雷爾氏菌的影響。并通過盆栽試驗測定目標放線菌株對煙草青枯病的防治效果。【結果】根據形態特征、生理生化試驗結果和測序結果，將篩選得到的目標放線菌Sa-21菌株鑒定為雷帕鏈霉菌（），對青枯雷爾氏菌的抑菌圈直徑達47.9 mm。Sa-21菌株粗浸膏抑制青枯雷爾氏菌的最低抑菌濃度為0.5 μg·mL-1，對菌體增殖也有明顯的抑制作用，并且試驗范圍內隨著粗浸膏濃度的升高抑制作用增強。掃描電子顯微鏡觀察到粗浸膏處理后的青枯雷爾氏菌菌體結構發生改變，導致菌體出現穿孔和皺縮等現象，試驗范圍內隨著粗浸膏濃度的升高，破裂菌體數量增加，皺縮程度增強，并且粗浸膏處理后，碘化丙啶可以穿過細胞膜與胞內物質結合發出熒光，且-半乳糖苷酶活性顯著增加，說明處理后的青枯雷爾氏菌細胞膜通透性提高。進一步研究發現，粗浸膏處理可導致青枯雷爾氏菌胞內活性氧積累，胞外多糖產量下降，說明對細胞膜造成了一定程度的損傷。盆栽防病試驗表明，先接種病原菌后噴施發酵濾液10倍稀釋液的處理對煙草青枯病的相對防治效果為67.61%，而先噴施發酵濾液10倍稀釋液再接種的處理對煙草青枯病的相對防治效果為85.89%。【結論】鏈霉菌Sa-21能抑制青枯雷爾氏菌菌體增殖、破壞細胞膜結構，對煙草青枯病有較好的防治效果，具有一定的開發潛力和應用價值。

青枯雷爾氏菌；雷帕鏈霉菌；放線菌；生物防治

0 引言

【研究意義】青枯病是一種世界性細菌病害，因其發病率高難以防治被稱為“植物癌癥”[1]。煙草青枯病是由青枯雷爾氏菌（）引起的一種土傳性維管束病害，可造成植物大量死亡，危害十分嚴重。該病在我國分布廣泛，大部分煙草省產區中均記載了青枯病的發生[2]。青枯雷爾氏菌不僅能夠侵染煙草，還能侵染番茄、辣椒、花生、馬鈴薯等多種重要經濟作物，對作物品質與產量均有影響，從而造成巨大的經濟損失。且隨著全球氣候變暖，青枯病發生的危害在世界范圍內也呈現越來越嚴重的趨勢[3]。因此，篩選對青枯雷爾氏菌有較強拮抗作用的生防菌株，對青枯病的綠色防控具有重要意義。【前人研究進展】目前煙草青枯病的防治主要有農業防治、化學防治和生物防治等措施。She等[4]研究了煙草植株長期連作的土壤群落結構，表明連作后煙草青枯病發病率明顯上升，因此，輪作或間作的種植方式有利于降低植物青枯病的發生率。抗病品種選育是農業防治的重要措施，目前篩選的高抗品種有云煙311、云煙317、K596[5]和K326[6]等，但抗病品種的選育周期長、見效慢，尤其是病原菌變異較頻繁，高抗品種不能完全適應病原菌的快速變異。化學防治是使用最多的防治辦法，具有見效快、方便和損失低等優點。目前傳統防治青枯病的化學藥劑有噻菌銅、溴菌腈·壬菌銅、乙蒜素等，防治效果均在50%以上[7]，但長期使用化學農藥可能會影響植物的生長，同時影響環境安全，對土壤造成損害。生物防治是通過利用生物資源保護植物免受病蟲害危害的一種防治措施，相比化學防治，其具有綠色環保、低毒無害等優點，更符合綠色發展理念[8]。目前，生物防治研究已取得較大進展，如木霉菌（）早在20世紀20年代就作為生物抗菌劑應用于植物病害的防治[9]，此外，假單胞菌（）、芽孢桿菌（）和放線菌也是生物防治中的重要成員。有研究表明多種微生物資源可應用于防治作物青枯病，如Li等[10]篩選到的解淀粉芽孢桿菌（）Y4和假單胞菌（sp.）Y8，對青枯雷爾氏菌的生長表現出抑制作用，大田試驗數據顯示處理組煙草青枯病發病率降至對照組發病率的25%—33.3%；Kaari等[11]研究表明，鏈霉菌UT4A49對青枯雷爾氏菌的抑制率為78.5%；黃偉等[12]研究發現，芽孢桿菌屬JK19對青枯雷爾氏菌等多種植物病原菌均有明顯的抑制作用；賴寶春等[13]將親和性菌株灰銹赤鏈霉菌（）FX81和深紅紫鏈霉菌（）FX28等比例同時復合發酵，復合發酵液對青枯雷爾氏菌的抑菌圈直徑達36.0 mm，且促進了番茄地上部分的生長，干重增加76.58%。綜上，對青枯病開展生物防治能有效降低化學農藥使用量，減少經濟損失。【本研究切入點】前期于香樟（）根際土壤分離得到一株對青枯雷爾氏菌有較強拮抗作用的放線菌Sa-21，鑒定為雷帕鏈霉菌（），其對青枯雷爾氏菌的生理特征影響和對青枯病的防治效果還需進一步明確。【擬解決的關鍵問題】從不同生境的土壤中篩選出拮抗青枯雷爾氏菌的放線菌菌株，利用96孔板法、傅里葉變換紅外光譜、熒光染色法等方法對目標放線菌拮抗青枯雷爾氏菌進行探究。以煙草為材料，通過盆栽試驗分析目標放線菌對煙草青枯病的防治效果，為作物青枯病防治提供借鑒，為放線菌在生物防治中的應用打下基礎。

1 材料與方法

試驗于2020年2月至2023年8月在浙江師范大學生命科學學院微生物資源與開發實驗室（以下稱本實驗室）完成。

1.1 材料

1.1.1 菌株 放線菌菌株由本實驗室從腐殖質豐富的煙草、香樟等根際土壤中篩選得到，共106株；青枯雷爾氏菌保存于本實驗室-80 ℃冰箱中。

1.1.2 培養基 放線菌液體（高氏1號）和固體培養基、B培養基和BGT培養基[14]。

1.1.3 供試煙草品種 易感本氏煙，由浙江師范大學生命科學學院遺傳學實驗室提供。

1.2 拮抗青枯雷爾氏菌放線菌的分離與篩選

1.2.1 青枯雷爾氏菌活化 在滅菌后的BGT培養基中加入25%的葡萄糖和1%的2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC），使培養基中葡萄糖和TTC終濃度分別為5和0.05 mg·mL-1，將青枯雷爾氏菌劃線接種于平板上，28 ℃培養2 d，挑取單菌落轉接于B培養基中擴大培養，當菌液OD600值達到0.6時取出備用。

1.2.2 放線菌的分離、純化與保藏在煙草、香樟等植株根際收集土壤，去除大顆粒，自然風干2 d，稱取5 g土壤加入到95 mL無菌水中，并定容至100 mL，28 ℃、160 r/min搖床振蕩混勻30 min，室溫靜置10 min后取上層液體，用無菌水對上層液體進行梯度稀釋（10-2—10-5），取每個梯度的稀釋液100 μL均勻涂抹在含重鉻酸鉀（每100 mL培養基加入330 μL）的高氏1號培養基上，28 ℃培養5—7 d，挑取具有典型放線菌菌落特征的菌株用平板劃線法純化出單菌落，純化3次后，對已純化的菌株進行編號，25%甘油管保存于-80 ℃冰箱中。

1.2.3 拮抗青枯雷爾氏菌放線菌的篩選采用共培養法對拮抗青枯雷爾氏菌的放線菌菌株進行初篩：將1 mL的青枯雷爾氏菌菌液與99 mL BGT培養基混勻倒板，將放線菌菌餅置于平板中央，以空白高氏1號固體培養基為對照，28 ℃培養2 d，十字交叉法測量抑菌圈大小，每組試驗設置3個重復。利用牛津杯法對拮抗青枯雷爾氏菌的放線菌菌株進行復篩：用無菌打孔器（6 mm）打取初篩中具有拮抗作用的放線菌菌株接種于高氏1號液體培養基中，28 ℃、160 r/min培養7 d，吸取2 mL發酵液10 000 r/min離心10 min，取上清液，用0.22 μm的微孔濾膜過濾除菌，得發酵濾液。將1 mL的青枯雷爾氏菌菌液與99 mL BGT培養基混勻倒板，滅菌的牛津杯置于平板中央，取200 μL發酵濾液加入到牛津杯中，以空白高氏1號液體培養基為對照，28 ℃培養2 d，十字交叉法測量抑菌圈直徑，每組試驗設置3個重復。

1.3 目標菌株的鑒定

1.3.1 形態學鑒定 參照文獻[15-16]配制菌落特征培養基，用接種環劃線接種目標菌株于各培養基上，28 ℃培養3、5、7 d，觀察菌落形態和生長情況。用無菌鑷子在高氏1號固體培養基中央制作凹槽，將目標菌株用無菌棉棒均勻涂布在凹槽四周，蓋上滅菌蓋玻片，28 ℃培養3、5、7 d，取蓋玻片于光學顯微鏡下觀察目標菌株的菌絲和孢子絲形態。取培養7 d的目標菌株菌絲，用PBS緩沖液清洗3次，加入500 μL 2.5%的戊二醛固定4 h，離心去上清，用30%—90%的梯度乙醇（每20%為一個梯度）進行脫水，每次脫水30 min，再用無水乙醇處理30 min，離心留菌體，用叔丁醇置換3次，每次20 min，最后一次留少許叔丁醇，將樣品放在-20 ℃下冷凍30 min，然后在冷凍干燥機中干燥過夜，取少量干燥后的菌絲粘于導電膠上，噴金，放入掃描電子顯微鏡下觀察菌絲顯微結構。

1.3.2 生理生化試驗 根據《放線菌快速鑒定與系統分類》[17]和《放線菌系統學-原理、方法及實踐》[18]配制生理生化特征培養基，通過劃線、點接等方式將目標菌株接種到各種鑒別培養基上，主要測定目標菌株產淀粉酶、纖維素酶、脲酶、脂肪酶、過氧化氫酶和蛋白酶能力；測定目標菌株是否能夠產生黑色素、硫化氫等；并測定目標菌株對碳源和氮源的利用能力。

1.3.3 系統發育分析 用Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒提取目標菌株的總DNA，使用通用引物27F（5′-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′）對目標菌株的16S rDNA片段進行擴增[19]，得到的PCR產物在上海生工生物有限公司進行序列測定初步鑒定，再通過、和等引物[20-21]（如表1所示）擴增相應管家基因序列，測序結果與NCBI數據庫中的DNA序列進行BLAST比對，結合多基因比對結果，使用MEGA 11鄰接法（neighbor-joining）構建系統發育樹。結合形態學鑒定、生理生化特征和系統發育分析確定目標菌株分類地位。

表1 擴增gyrB、recA和rpoB管家基因所用引物

1.4 目標菌株拮抗青枯雷爾氏菌活性及對其生理特征的影響

1.4.1 粗浸膏的制備 通過預試驗確定活性物質可用乙酸乙酯提取（分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇3種極性有機試劑先后提取發酵液中的活性物質，用牛津杯法測量提取的有機試劑是否有抑菌活性，純有機試劑作為對照）。取培養5 d的Sa-21菌株菌餅接種于高氏1號液體培養基中（100 mL/250 mL），28 ℃、160 r/min振蕩培養3 d制成種子液，將種子液轉接至大容量錐形瓶中（1 L/3 L）同樣條件發酵7 d得到發酵液，用乙酸乙酯法對發酵液進行反復萃取直至萃取液無色，將萃取液合并后用旋轉蒸發儀濃縮后得到粗浸膏。

1.4.2 粗浸膏抑制青枯雷爾氏菌的最低抑菌濃度（MIC） 根據美國藥物敏感性試驗方法適當改動，通過96孔微量培養板測定鏈霉菌Sa-21粗浸膏對青枯雷爾氏菌的MIC。粗浸膏母液配制：用甲醇將粗浸膏配制成濃度分別為6 400、3 200、1 600、800、400、200、100、50、25和12.5 μg·mL-1的母液，備用。菌液準備：將過夜培養的青枯雷爾氏菌菌液先稀釋至0.5個麥氏濁度（菌群濃度約為（1—2）×108cfu/mL），再稀釋100倍，備用。將粗浸膏母液用B培養基稀釋100倍，吸取100 μL加至96孔聚苯乙烯微量培養板中，第1列加入64 μg·mL-1的粗浸膏溶液，第2列加入32 μg·mL-1的粗浸膏溶液，直至第10列加入0.125 μg·mL-1的粗浸膏溶液，第11列加入100 μL甲醇-B培養基混合液（1%甲醇，V/V），第12列加入200 μL甲醇-B培養基混合液（1/200甲醇，V/V），接著在第1列至第11列，加入100 μL的稀釋后的青枯雷爾氏菌菌液（（1—2）×106cfu/mL），每孔總量為200 μL，使得最終第1列至第10列粗浸膏濃度分別為32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125和0.0625 μg·mL-1，第11列為陽性對照，判斷青枯雷爾氏菌是否正常生長，第12列為陰性對照，判斷培養過程是否污染，將96孔板置于生化培養箱中28 ℃培養22 h，觀察并記錄生長情況，用酶標儀檢測600 nm處的吸光值，試驗設置4個重復。

1.4.3 粗浸膏對青枯雷爾氏菌生長動態變化的影響 由1.4.2測定結果確定Sa-21菌株粗浸膏抑制青枯雷爾氏菌的MIC值。粗浸膏母液配制：用甲醇將粗浸膏配制成濃度分別為0、2×、10×、20×、50×和100×MIC的母液，備用。菌液準備：將過夜培養的青枯雷爾氏菌菌液稀釋至0.5個麥氏濁度（菌群濃度約為（1—2）×108cfu/mL）備用。取1 mL的粗浸膏母液與98 mL的B培養基混勻，再加入1 mL稀釋后的青枯雷爾氏菌菌液，使錐形瓶中粗浸膏終濃度分別為0、0.02×、0.1×、0.2×、0.5×、1×MIC，于28 ℃、160 r/min條件下振蕩培養，每隔2 h用紫外分光光度計測定波長600 nm處的吸光值，檢測青枯雷爾氏菌在不同濃度粗浸膏處理下的生長繁殖情況，每組試驗設置3個重復。

1.4.4 粗浸膏對菌體形態的影響 粗浸膏母液配制：用甲醇將粗浸膏配制成濃度分別為0、4×、20×和40×MIC的母液，備用。菌液準備同1.4.3。取稀釋后的青枯雷爾氏菌菌液5 mL，10 000 r/min離心3 min，棄上清液，菌體用5 mL的PBS緩沖液重懸，按1﹕1的比例加入粗浸膏母液使其終濃度分別為0、2×、10×和20×MIC，28 ℃處理4 h，經過洗滌（PBS）-固定（2.5%戊二醛）-洗滌（PBS）-脫水（乙醇）-置換（叔丁醇）-冷凍干燥后，在掃描電鏡下觀察病菌形態是否變化，每組試驗設置3個重復。

1.4.5 粗浸膏對膜通透性的影響 用乳糖類似物2-硝基苯基--D-吡喃半乳糖（ONPG）檢測細胞膜上-半乳糖苷酶活性的變化。粗浸膏母液配制：用甲醇將粗浸膏配制成濃度分別為0、0.4×、1×、2×、4×、20×、40×MIC的母液，備用。菌液準備同1.4.3。取稀釋后的青枯雷爾氏菌菌液5 mL，10 000 r/min離心3 min，棄上清液，加入500 μL濃度為30 mmol·L-1的ONPG，再加入PBS緩沖液至5 mL，按1﹕1的比例加入粗浸膏母液使其終濃度分別為0、0.2×、1×、2×、10×、20×MIC，另取10 mL的PBS緩沖液作為陰性對照，28 ℃、160 r/min處理4 h，1 000 r/min離心3 min，取上清液測定420 nm處的吸光值，每組試驗設置3個重復。取稀釋后的青枯雷爾氏菌菌液5 mL，10 000 r/min離心3 min，棄上清液，菌體用PBS緩沖液等體積重懸，按1﹕1的比例加入粗浸膏母液使其終濃度分別為0、0.5×、1×、2×、10×和20×MIC，于28 ℃、160 r/min條件下孵育4 h，取500 μL在1 000 r/min條件下離心3 min，菌體用1×PBS緩沖液等體積重懸，加入30 μL的碘化丙啶（PI）染料，避光孵育15 min，PI染料的激發波長400 nm，發射波長615 nm[22]，熒光顯微鏡下觀察不同處理的樣品產生的熒光，熒光分光光度計檢測各處理熒光強度，每組試驗設置3個重復。

1.4.6 粗浸膏對胞外多糖（EPS）的影響 粗浸膏母液配制：用甲醇將粗浸膏配制成濃度分別為0和20×MIC，備用。菌液準備同1.4.3。取1 mL的粗浸膏母液與98 mL的B培養基混勻，再加入1 mL稀釋后的青枯雷爾氏菌菌液，使錐形瓶中粗浸膏終濃度為0和0.2×MIC，于28 ℃、160 r/min條件下振蕩培養，當菌液OD600的吸光值達到0.25、0.5、0.75、1、1.25和1.5時取出，每個吸光值處取10 mL放入50 mL離心管中，離心留上清，加入3倍體積的無水乙醇與上清液混合，過夜沉淀得到EPS沉淀，將沉淀離心收集，50 ℃烘箱中干燥，直至3次稱量恒重[23]，記錄數據，每組試驗設置3個重復。

1.4.7 粗浸膏對膜成分的影響 粗浸膏母液配制同1.4.5。菌液準備同1.4.3。取稀釋后的青枯雷爾氏菌菌液5 mL，10 000 r/min離心3 min，棄上清液，菌體用等體積的PBS緩沖液重懸，按1﹕1的比例加入粗浸膏母液使其終濃度分別為0、0.5×和20×MIC，28 ℃處理4 h，10 000 r/min離心3 min后用PBS沖洗3次，棄上清液，加入500 μL的2.5%戊二醛重懸，4 ℃條件下固定過夜，離心留菌體，用30%—90%的梯度乙醇（每20%為一個梯度）進行脫水，每次脫水30 min，再用無水乙醇處理30 min，離心留菌體，脫水后用叔丁醇置換3次，每次20 min，最后一次留少量叔丁醇重懸菌體，置于冷凍干燥儀中干燥過夜，干燥后的菌體使用傅里葉紅外光譜儀通過壓片法測定光譜數據，再用OMNIC 7.3對膜成分的變化進行分析，每組試驗設置3個重復。

1.4.8 粗浸膏對胞內活性氧（ROS）的影響 粗浸膏母液配制：用甲醇將粗浸膏配制成濃度分別為0、1×、2×、4×、20×和40×MIC的母液，備用。菌液準備同1.4.3。取稀釋后的青枯雷爾氏菌菌液5 mL，10 000 r/min離心3 min，棄上清液，菌體用等體積的PBS緩沖液重懸，按1﹕1的比例加入粗浸膏母液使其終濃度分別為0、0.5×、1×、2×、10×和20×MIC，28 ℃、160 r/min處理4 h，取500 μL在1 000 r/min條件下離心3 min，菌體用無菌水等體積重懸，加入30 μL的2,7-二氯二氫熒光素二乙酸酯（DCFH-DA），避光孵育15 min，DCFH-DA的激發波長488 nm，發射波長525 nm，通過熒光顯微鏡觀察不同處理的樣品產生的熒光，熒光強度由熒光分光光度計檢測，每組試驗設置3個重復。

1.5 目標菌株對煙草青枯病的防治效果

1.5.1 煙草植株的培育 選取易感本氏煙作為實驗對象。從保存的種子中選取顆粒飽滿的煙草種子播種在土壤中，噴灑無菌水至土壤濕潤，用保鮮膜密封保濕培養，待其長至3真葉時轉移到單獨的育苗盆中培育。育苗盆尺寸為口徑7 cm、底徑5 cm、高7.3 cm，一個育苗盆種植一株煙草，每盆裝土至盆口鋪滿，用土約130 g。培養條件：光周期L﹕D=14 h﹕10 h、溫度（28±1）℃、相對濕度75%—85%。當幼苗生長10 d左右，一周噴灑一次營養液，植株高度達到8—10 cm時，備用。

1.5.2 目標菌株對煙草青枯病的防治效果 挑選長勢大小一致的煙草成熟植株進行試驗，將青枯雷爾氏菌稀釋至0.5個麥氏濁度（（1—2）×108cfu/mL），采用不傷根接種法接種病菌，每株煙草灌根接種15 mL菌液。設置對照1（CK1）、對照2（CK2）、處理1（T1）、處理2（T2）4種處理，每處理分3組，一組5株，共計60株煙苗，觀察植株21 d內的發病情況，計算病情指數和防治效果。具體處理方式：對照1（CK1），不接種病菌，施加等量的高氏1號液體培養基稀釋液處理（高氏1號液體培養基稀釋10倍，下同）；對照2（CK2），接種病菌，施加等量的高氏1號液體培養基稀釋液處理；處理1（T1），先接種病菌，24 h后再施加發酵濾液稀釋液（發酵濾液稀釋10倍，下同）于根部（施加3次，每次15 mL，間隔1 h）；處理2（T2），先施加發酵濾液稀釋液于根部（施加3次，每次15 mL，間隔1 h），24 h后再接種病菌。對煙草青枯病進行病情分級[24]，詳見表2。

發病率=（發病株數/調查總株數）×100%；病情指數=∑[（各級病株或葉數×該病級值）/（調查總株數或葉數×最高級值）]×100；防治效果=（對照病情指數-處理病情指數）/對照病情指數×100%。

表2 煙草青枯病的病情分級

1.6 數據處理與分析

使用Microsoft Excel 2016對數據進行統計后，利用IBM SPSS Statistics 21統計學軟件對數據進行顯著性分析（＜0.05），選擇SNK（Student-Newman- Keuis）進行多重比較，最后通過Origin 2021軟件繪圖。

2 結果

2.1 拮抗青枯雷爾氏菌放線菌的分離與篩選

通過共培養法對分離得到的106株放線菌進行篩選，結果顯示Sa-21、Sa-48、Zl-5、Hs-17和Yl-76菌株能夠有效抑制青枯雷爾氏菌的生長，菌餅周圍出現直徑分別為（36.4±1.3）（31.2±1.7）（30.7±0.9）（25.4±1.5）（18.5±1.4）mm（圖1-A1—E1）的抑菌圈，說明Sa-21菌株菌餅拮抗效果最好。同時，用牛津杯法對上述5種菌株進行復篩，抑菌圈直徑分別為（47.9±1.4）（18.7±1.2）（12.2±0.8）（11.8±0.6）（10.3±0.9）mm（圖1-A2—E2），同樣表明Sa-21菌株拮抗效果最好。綜合兩種篩選方式結果，表明Sa-21菌株對青枯雷爾氏菌的抑制作用最強，因此，選擇Sa-21菌株進行后續試驗。

2.2 Sa-21菌株的鑒定

2.2.1 形態學特征 Sa-21菌株在5種菌落特征培養基上均能正常生長，菌落凸起，多呈粉堆狀，菌落顏色多為白色，且菌絲與培養基之間連接不緊密，易于刮落，菌絲不產生可溶性色素，生長速率情況見表3，其中在高氏1號固體培養基和無機鹽淀粉瓊脂培養基（ISP4）上生長速度較快，菌絲豐富，在察氏固體培養基、葡萄糖天門冬素瓊脂培養基和甘油天門冬素瓊脂培養基（ISP5）上生長速度較慢，菌絲相對稀疏，但在察氏固體培養基上的菌落邊緣放射狀明顯。埋片法觀察Sa-21菌株的顯微結構，氣生菌絲多分枝，菌絲中間無隔（圖2-A），能產生大量孢子，孢子絲緊密螺旋（圖2-B、2-C）。

2.2.2 生理生化特征 將Sa-21菌株接種至生理生化培養基中進行培養，結果如表4所示。Sa-21菌株具有較強的分解淀粉、尿素和蛋白質能力，能產生纖維素酶、脂肪酶和過氧化氫酶；MR和V-P試驗陰性，不能產生黑色素和硫化氫；碳、氮源利用的結果顯示（表5），Sa-21菌株在所測定的碳源中都能夠生長，當唯一碳源為-乳糖、D-麥芽糖、棉子糖、肌醇、D-甘露醇時，菌絲生長較為旺盛，在以蛋白胨、硝酸鉀、賴氨酸、亮氨酸、組氨酸為唯一氮源的培養基上長勢較好，但不能利用谷氨酸。

A1—E1：共培養法初篩Co-culture method for primary screening；A2—E2：牛津杯法復篩Oxford cup method re-screening。A1, A2: Sa-21; B1, B2: Sa-48; C1, C2: Zl-5; D1, D2: Hs-17; E1, E2: Yl-76

表3 Sa-21菌株在不同培養基上的生長情況

A：光學顯微鏡下的氣生菌絲和基內菌絲Aerial mycelium and substrate mycelium under light microscope；B：光學顯微鏡下的孢子絲Chains of spores under light microscope；C：掃描電子顯微鏡下的氣生菌絲和孢子絲Aerial mycelium and chains of spores under scanning electron microscope

表4 Sa-21菌株生理生化特性

-：無該能力或試驗結果陰性no ability or negative test results；+：有該能力或試驗結果陽性Having the ability or positive test results

表5 Sa-21菌株在不同的碳源和氮源中的生長情況

-：不能利用該種碳源或氮源this type of carbon source or nitrogen source can not be utilized；+：利用該種碳源或氮源能力一般the utilization capacity of this type of carbon source or nitrogen source is average；++：利用該種碳源或氮源能力較強the utilization capacity of this type of carbon source or nitrogen source is stronger；+++：利用該種碳源或氮源能力強The utilization capacity of this type of carbon source or nitrogen source is strong

2.2.3 系統發育分析及鑒定 將得到的Sa-21菌株16S rDNA（PP391014）測序結果與NCBI數據庫中的序列進行BLAST比對，初步鑒定為鏈霉菌，再將（PP429284）、（PP429282）和（PP429283）3個管家基因測序結果進行比對，取同源性較高的不同菌種的序列與Sa-21菌株序列通過MEGA 11采用鄰接法多基因聯合構建系統發育樹，如圖3所示，最終Sa-21菌株與雷帕鏈霉菌聚在同一分支，結合形態學和生理生化試驗結果，鑒定Sa-21菌株為雷帕鏈霉菌。

2.3 鏈霉菌Sa-21拮抗青枯雷爾氏菌活性及對其生理特征的影響

2.3.1 粗浸膏的制備 通過大量發酵培養獲得鏈霉菌Sa-21發酵液共15 L，用有機試劑乙酸乙酯反復萃取，旋轉蒸發儀濃縮得到暗紅色膏狀物質7.32 g，用于后續試驗。

2.3.2 最低抑菌濃度（MIC） 通過96孔板法[25]測定鏈霉菌Sa-21粗浸膏對青枯雷爾氏菌的最低抑菌濃度，經過培養后的陽性對照（第11列）渾濁，表明有青枯雷爾氏菌生長，而陰性對照（第12列）澄清，表明培養過程無雜菌污染，而不同濃度的粗浸膏對青枯雷爾氏菌的影響也不同，從第1列（32 μg·mL-1）至第7列（0.5 μg·mL-1）微孔液體透明，不渾濁，從第8列（0.25 μg·mL-1）至第10列（0.0625 μg·mL-1）液體出現不同程度的渾濁，用酶標儀測定波長600 nm處的吸光值，如圖4所示，≥0.5 μg·mL-1濃度的吸光值與陰性對照無顯著性差異，表明無青枯雷爾氏菌生長，該數據與96孔板現象一致，因此0.5 μg·mL-1即為Sa-21菌株粗浸膏抑制青枯雷爾氏菌的MIC。

2.3.3 生長動態 根據2.3.2 MIC值設定0、0.01、0.05、0.1、0.25和0.5 μg·mL-1共6個粗浸膏濃度，測定36 h內青枯雷爾氏菌的生長情況。結果顯示（圖5），加入粗浸膏的處理組青枯雷爾氏菌菌體數量明顯低于對照組，并且隨著粗浸膏濃度增加，菌體開始增長的時間表現出滯后現象，增長速率明顯降低，指數增長期縮短，當粗浸膏濃度達到0.5 μg·mL-1時，青枯雷爾氏菌的生長幾乎完全被抑制，表明Sa-21菌株粗浸膏對青枯雷爾氏菌的增殖有抑制作用，并且隨著粗浸膏濃度的升高抑制作用增強。

CK1：陽性對照，加入菌液，但不加入粗浸膏Positive control, adding bacterial liquid, but not adding crude extract；CK2：陰性對照，不加入菌液和粗浸膏Negative control, not adding bacterial liquid and crude extract

圖5 不同濃度粗浸膏處理下青枯雷爾氏菌的生長動態變化

2.3.4 粗浸膏對菌體形態的影響 細胞形態對于病原菌侵染植物至關重要，形態的改變會導致菌體無法正常增殖、識別以及結合等。用不同濃度的粗浸膏處理青枯雷爾氏菌，并在掃描電鏡下觀察菌體表面形態變化。未處理過的青枯雷爾氏菌菌體飽滿，表面光滑無褶皺，菌體生長良好，完整無破裂（圖6-A），Sa-21菌株粗浸膏處理后的菌體形態發生改變（圖6-B—D紅色箭頭所指），部分菌體表面出現破洞、皺縮和扭曲變形等現象，并且隨著粗浸膏濃度的升高，菌體破裂數量增加，皺縮程度增強。表明Sa-21菌株能夠直接作用于青枯雷爾氏菌的菌體表面，很可能引起病原菌的代謝紊亂，最終導致菌體死亡。

A：未處理Untreated (CK)；B—D：粗浸膏濃度分別為1、5、10 μg·mL-1 The concentration of crude extract was 1, 5 and 10 μg·mL-1, respectively

2.3.5 粗浸膏對膜通透性的影響-半乳糖苷酶是微生物普遍存在的一種胞內酶，細胞內膜通透性的改變會導致菌體內的-半乳糖苷酶泄漏，并與外源加入的2-硝基苯基--D-吡喃半乳糖（ONPG）反應形成黃色化合物鄰硝基苯酚（ONP），該物質在420 nm處有吸收值[26]。通過對420 nm處的吸光值測定結果表明（圖7），經過0.1、0.5、1 μg·mL-1粗浸膏處理后的細胞內膜通透性與對照無顯著差異，但當濃度升至5 μg·mL-1時，細胞內膜通透性顯著改變，吸光值增至0.083，而當濃度升至10 μg·mL-1時，吸光值為0.108，接近陽性對照的兩倍，表明Sa-21菌株能夠影響青枯雷爾氏菌細胞內膜通透性，并且隨著粗浸膏濃度的增加，內膜通透性增加。

PI是一種膜不透性的熒光染料，活細胞的細胞膜會阻礙該染料的進入，但當細胞膜通透性改變時，PI染料可以進入細胞內與核酸結合[27]，因此，可以通過PI染料的熒光強度來判斷膜通透性是否受損。如圖8所示，從熒光顯微鏡中可以觀察到，對照組基本不顯示熒光，表明細胞生長正常，膜通透性較低，而經過10 μg·mL-1粗浸膏處理菌體發出大量紅色熒光，說明經過粗浸膏處理后，青枯雷爾氏菌膜通透性增加，熒光強度測定結果見圖9，隨著處理的粗浸膏濃度增加，熒光強度升高，表示膜通透性逐漸增加，膜透性的改變不僅會使細胞外物質侵入，還會使胞內物質大量流失，導致菌體無法正常生長。

CK1：不加菌液的PBS緩沖液PBS buffer without bacterial solution；CK2：未處理Untreated

A：未處理Untreated (CK)；B：處理組Treatment group (10 μg·mL-1)

2.3.6 粗浸膏對胞外多糖（EPS）的影響 由圖10所示，對照組的EPS質量隨著青枯雷爾氏菌菌群濃度的增加而增加，處理組的EPS呈同樣趨勢，不同的是，兩組試驗起始值（OD600=0.25）相差不大，均在0.1 g左右，但隨著菌群濃度的增加，在同一菌群密度的條件下，處理組的EPS質量相對對照組有一定的減少，表明粗浸膏的存在一定程度上阻礙了青枯雷爾氏菌EPS的產生，而且時間越長，菌群濃度越大，這種差異就越明顯，當OD600=1.25時，處理組的EPS被抑制了23.2%。表明鏈霉菌Sa-21菌株能夠抑制青枯雷爾氏菌EPS的產生。

CK：未處理Untreated。下同The same as below

2.3.7 粗浸膏對膜成分的影響 有機體的生命活動伴隨著細胞的新生和死亡，在細胞死亡中又分為細胞凋亡和細胞壞死，細胞凋亡通常會出現細胞和染色質的收縮，而細胞壞死往往會引起膜透性改變、DNA降解以及功能喪失[28]，傅里葉變換紅外光譜（FTIR）廣泛應用于結構解析，可以利用該技術分析細胞不正常死亡引起的成分變化。將處理后的青枯雷爾氏菌用FTIR測定500—4 000 cm-1的光譜數據，該范圍區域分別代表脂質（2 800—3 000 cm-1）、蛋白質（1 480—1 800 cm-1）、核酸和多糖（900—1 250 cm-1）[29]，結果如圖11所示，青枯雷爾氏菌的光譜數據在1 060.175、1 220.238、1 540.363、 1 644.982和3 279.358位置發生了偏移，表明處于以上光譜位置的成分發生了改變，如表6所示，3 279.358位置可能包含某些多糖，這與關于EPS的改變結果相符。表明鏈霉菌Sa-21粗浸膏會導致青枯雷爾氏菌表面膜成分變化。

圖10 粗浸膏對青枯雷爾氏菌胞外多糖的影響

2.3.8 粗浸膏對胞內活性氧（ROS）的影響 胞內ROS的增加會導致細胞膜結構受到損傷，通過2,7-二氯二氫熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）與ROS反應，可以生成2,7-二氯熒光素（DCF），該物質可以發出綠色熒光。結果顯示（圖12），對照組的青枯雷爾氏菌只有少數的菌體發出綠色熒光，而經過粗浸膏處理的青枯雷爾氏菌發出大量熒光，表明菌體內有較多的ROS產生。同時，將孵育的樣品置于熒光分光光度計中檢測，結果（圖13）與熒光顯微鏡情況一致，對照組的熒光強度為5.235，而經過粗浸膏處理的青枯雷爾氏菌熒光強度隨粗浸膏濃度的增加而增加，當粗浸膏濃度為10 μg·mL-1時，熒光強度為20.65，遠高于對照組，說明鏈霉菌Sa-21粗浸膏會導致青枯雷爾氏菌的胞內ROS增加，改變菌體膜的性質，從而造成菌體的氧化損傷[30]。

圖11 粗浸膏對青枯雷爾氏菌成分影響的FTIR圖譜

表6 粗浸膏處理后的青枯雷爾氏菌傅里葉變換紅外的振動峰分配

A：未處理Untreated (CK)；B：處理組Treatment group (10 μg·mL-1)

2.4 鏈霉菌Sa-21對煙草青枯病的防治效果

Sa-21菌株的發酵液對煙草青枯病具有較好的防治效果。陰性對照（CK1）植株生長正常，陽性對照（CK2）植株接種青枯雷爾氏菌后發病率為86.68%，病情指數28.15，通過施加Sa-21菌株發酵濾液稀釋液可以顯著降低煙草植株的病理情況，其中T1組發病率和病情指數分別為60.02%和8.89，T2組發病率和病情指數分別為26.64%和3.70，兩組最終防治效果分別為67.61%和85.89%，此外，先施加發酵濾液稀釋液防治效果優于先接種，表明預防處理是防止煙草青枯病發生的更好選擇（表7）。

圖13 粗浸膏促進青枯雷爾氏菌ROS的積累

表7 Sa-21菌株發酵濾液對盆栽煙草青枯病的防治效果

數據為平均值±標準差，數據后不同小寫字母表示在＜0.05水平差異顯著

The data are mean±SD, and different lowercases after the data indicate significant differences at＜0.05 level

3 討論

3.1 鏈霉菌代謝產物價值

鏈霉菌的種類繁多，其代謝產物豐富多樣，在多個領域都有研究和應用的價值。Zheng等[31]從病害嚴重的土壤中篩選到鏈霉菌FJAT-31547，盆栽試驗結果顯示，該菌株使番茄枯萎病和青枯病的發病率分別降低80.59%和76.92%，且對番茄植株有促生作用；Ling等[32]從土壤中篩選到一株放線菌，經鑒定為鏈霉菌屬的一種，對于番茄青枯病有較好的防治效果，并且從其代謝產物中分離出放線菌素D，該物質對于青枯病有顯著的預防作用；JIANG等[33]研究表明鏈霉菌可抑制南方根結線蟲（），明顯減少線蟲和植物根部卵團的數量。此外，鏈霉菌所產生的聚酮化合物對于流感病毒有抑制活性，表明這些化合物可以應用于醫學領域[34]。Sa-21菌株于浙江省金華市浙江師范大學校園香樟根際土壤分離得到，該菌株發酵液抑菌圈達47.9 mm，并對多種其他病原真菌和病原細菌有抑制作用，其發酵液提取的粗浸膏MIC值為0.5 μg·mL-1。Promnuan等[35]分離得到的放線菌DSC3-6粗提物能夠抑制青枯雷爾氏菌，MIC值為32 μg·mL-1，本研究中鏈霉菌Sa-21菌株粗浸膏抑制青枯雷爾氏菌的MIC值更低。

3.2 生物防治機制

生物防治主要是依靠胞外產物的產生、誘導植物防御系統抗性增加以及植物根際定殖等來抑制病原菌對植物的危害[36]。Chen等[37]研究了解淀粉芽孢桿菌FJAT-2349所分泌的脂肽對青枯雷爾氏菌的抗菌活性，結果顯示，純化后的泛革素對青枯雷爾氏菌有抗菌活性，且脂肽類物質對青枯病的生防效果達97.6%；Shiva等[38]報道了番茄植株與青枯雷爾氏菌和假單胞菌互作時，番茄植株防御基因表達增強；Achari等[39]研究了內生細菌在茄子根際定殖對青枯雷爾氏菌的抑制作用，發現接種后的細菌會在根際土壤和植物內生組織如根面、皮層和木質部導管有不同程度的定殖，這種定殖可以防止青枯病對茄子的危害；Elsayed等[40]研究了植物、拮抗菌、根際微生物群落和青枯菌之間的復雜關系，結果表明貝萊斯芽孢桿菌（）B63和假單胞菌P142可以降低青枯病菌在番茄根際的豐度，并且接種后的根際群落結構變化，這可能引起植物對青枯病的防御。芽孢桿菌和假單胞菌對病原菌和植物的影響機制目前已逐漸清晰，但鏈霉菌對青枯雷爾氏菌致病機制的影響尚未完全了解，Xue等[41]研究表明，由白黃鏈霉菌（）TD1產生的活性代謝產物能夠增加青枯雷爾氏菌的膜通透性和細胞壁完整性，抑制病原菌核酸和蛋白質的合成。本文探究了鏈霉菌Sa-21對青枯雷爾氏菌膜通透性的影響，并對胞外多糖（EPS）產生、菌體表面膜成分以及胞內活性氧（ROS）進行了分析，結果表明Sa-21粗浸膏能夠導致菌體變形、扭曲，膜通透性增加和內容物外漏，這很大程度會導致菌體形態改變甚至菌體死亡。EPS等物質是青枯雷爾氏菌致病力的關鍵因子，病菌菌體和EPS可以堵塞植物的維管束[42-43]，對EPS的測定結果表明，Sa-21能夠抑制青枯雷爾氏菌EPS的產生。而對菌體表面成分分析結果與前人結果相符，糖類等物質成分有所改變，同時，胞內活性氧增加，導致青枯雷爾氏菌受到氧化損傷。

4 結論

鏈霉菌Sa-21能抑制青枯雷爾氏菌生長，對菌體和細胞膜有明顯的破壞作用，還能降低青枯雷爾氏菌胞外多糖合成，使其胞內活性氧增加。盆栽試驗表明鏈霉菌Sa-21能夠有效防治煙草青枯病，且預防效果好于治療效果。Sa-21菌株有望開發成為一種新的生物防治菌劑。

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Screening of actinomycetes againstand Its disease prevention Function

LIAO XinLin, GUO Xin, YANG JiXue, SHAO JiaZhu, YUAN XinYu, HU JiaYan, CHEN XiaoXiao, JIANG DongHua

College of Life Sciences, Zhejiang Normal University, Jinhua 321000, Zhejiang

【Objective】Tobacco bacterial wilt caused byis the main disease of tobacco in cash crops. In this paper, the actinomycetes with strong antagonism againstwere screened from the soil of different habitats, and their antibacterial mechanism and biocontrol effect were determined, which provided a theoretical basis for the further development of anti-disease microbial agents.【Method】After screening the target actinomycetes by co-culture method and Oxford cup method, the target strain was identified by morphological studies, physiological and biochemical experiments and polygenic phylogenetic analysis. The minimum inhibitory concentration (MIC) of actinomycetes crude extract againstwas determined by the 96-well plate method. After co-culture treatment ofwith crude extract, the growth dynamics ofwere detected and the morphological changes ofwere observed. The effects on membrane permeability and membrane composition were observed by measuring-galactosidase activity and propidium iodide (PI) fluorescence experiments and Fourier transform infrared spectroscopy. The antibacterial activity and mechanism of target actinomyces antagonisticwere preliminarily explored by measuring protein synthesis, extracellular polysaccharides (EPS), intracellular reactive oxygen species (ROS), and so on. The effect of the target actinomycetes on tobacco bacterial wilt control was determined by pot experiments.【Result】According to the morphological characteristics, physiological and biochemical experimental results and sequencing results, the target actinomyces strain Sa-21 was identified as, and the diameter of the inhibition zone againstwas 47.9 mm. The results of mechanism experiments showed that the minimum inhibitory concentration of Sa-21 strain crude extract inhibitingwas 0.5 μg·mL-1, which also had a significant inhibitory effect on bacterial proliferation, and the inhibitory effect increased with the increase of crude extract concentration in the test range. Scanning electron microscopy showed that the structure ofchanged after crude extract treatment, resulting in perforation and shrinkage of the bacteria, and with the increase of the concentration of crude extract in the test range, the number of ruptured bacteria increased, and the degree of shrinkage increased. After crude extract treatment, propidium iodide could pass through the cell membrane and bind to intracellular substances to fluoresce, and the activity of-galactosidase was significantly increased, indicating that the permeability of the cell membrane ofwas improved. Further studies showed that crude extract treatment could lead to the accumulation of intracellular reactive oxygen species and the decrease of extracellular polysaccharide production in, indicating that the cell membrane was damaged to a certain extent. The results of potted plant disease control test showed that the relative control effect of 10-fold dilution of fermentation filtrate of treatment group was 67.61%, while the relative control effect of 10-fold dilution of fermentation filtrate of prevention group was 85.89%.【Conclusion】Sa-21 can inhibit the proliferation ofand destroy the cell membrane structure, which has a good control effect on tobacco bacterial wilt, and has certain development potential and application value.

;; actinomycete; biological control

10.3864/j.issn.0578-1752.2024.07.009

2023-09-22；

2024-01-11

浙江省基礎公益研究計劃（LGN22C140004）

廖鑫琳，E-mail：1546109773@qq.com。郭鑫，E-mail：gx1121gx@163.com。廖鑫琳和郭鑫為同等貢獻作者。通信作者蔣冬花，E-mail：jdh@zjnu.cn

（責任編輯 岳梅）