基于抗氧化譜效關(guān)系的肉蓯蓉質(zhì)量標(biāo)志物研究△

李瑩曼，宋紫騰，侯淇允，張林林，許浚，4*，張鐵軍*

1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617；2.天津藥物研究院 天津市中藥質(zhì)量標(biāo)志物重點實驗室，天津 300462；3.天津藥物研究院 釋藥技術(shù)與藥代動力學(xué)國家重點實驗室，天津 300462；4.中國中藥協(xié)會 藥食同源物質(zhì)評價和利用專業(yè)委員會，北京 100061

肉蓯蓉是列當(dāng)科肉蓯蓉屬植物肉蓯蓉Cistanche deserticolaY.C.Ma 或管花肉蓯蓉C.tubulosa(Schenk) Wight的干燥帶鱗葉的肉質(zhì)莖，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品[1]。其性溫，味甘、咸，歸腎、大腸經(jīng)，具有補腎陽、益精血、潤腸通便的功效，為補腎填精之要藥[2-3]。腎主藏精，精血同源，若精血虧虛則影響人體的整體生命活動；精生髓藏于骨，腦為髓海，若腎精不足，則骨失所養(yǎng)、腦海虧虛，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松、牙齒脫落、記憶力減退、癡呆、免疫功能下降等退行性變化[4-6]。肉蓯蓉含有苯乙醇苷類、環(huán)烯醚萜類、木脂素類等多種結(jié)構(gòu)類型成分，包括松果菊苷、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷、京尼平苷酸、8-表馬錢子酸、管花苷A 等[7]，目前《中華人民共和國藥典》2020 年版對肉蓯蓉的質(zhì)量控制僅規(guī)定了松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量，不能完全體現(xiàn)中藥多成分、多靶點的作用特點，不利于其質(zhì)量控制和評價。

為提升中藥質(zhì)量控制水平，優(yōu)化中藥質(zhì)量評價，劉昌孝院士提出中藥質(zhì)量標(biāo)志物（Q-marker）的新概念[8]。其中“有效性”是Q-marker“五原則”中的核心要素[9]，也是中藥質(zhì)量評價的核心。針對質(zhì)量標(biāo)準與藥效相關(guān)性較差的研究現(xiàn)狀，挖掘中藥的Qmarker，建立更科學(xué)合理的質(zhì)量標(biāo)準，對中藥的質(zhì)量提升具有重大意義。譜效關(guān)系是將中藥指紋色譜峰與特定的藥效學(xué)數(shù)據(jù)聯(lián)系起來，尋找中藥的有效物質(zhì)，以此反映中藥的內(nèi)在質(zhì)量[10]。建立譜效數(shù)學(xué)模型能夠從“整體觀”角度闡明中藥的Q-marker，為后期的中藥質(zhì)量控制、質(zhì)量標(biāo)準的制定和有效成分的篩選提供更多參考。本研究采用指紋圖譜結(jié)合活性氧自由基（ROS）半數(shù)抑制濃度（IC50）、超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）的含量開展中藥譜效關(guān)系的研究，運用主成分分析（PCA）、皮爾遜相關(guān)性分析（PCC）和偏最小二乘法-回歸分析（PLS）綜合分析肉蓯蓉的Q-marker，為其質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料

1.1 樣品

肉蓯蓉采收自新疆維吾爾自治區(qū)于田縣和內(nèi)蒙古肉蓯蓉良好農(nóng)業(yè)規(guī)范（GAP）種植基地，經(jīng)天津藥物研究院有限公司張鐵軍研究員鑒定為管花肉蓯蓉Cistanche tubulosa(Schenk) Wight 和肉蓯蓉C.deserticolaY.C.Ma，具體信息見表1。

表1 肉蓯蓉藥材產(chǎn)地及批號

1.2 試藥

對照品松果菊苷（批號：111670-201907，純度：91.8%）、毛蕊花糖苷（批號：111530-201914，純度：95.2%）均購自中國食品藥品檢定研究院；異毛蕊花糖苷（批號：61303-13-7）、紅景天苷（批號：10338-51-9）、8-表馬錢子酸（批號：82509-41-9）、京尼平苷酸（批號：Z24A10X95926）、管花苷B（批號：112516-04-08）、2-乙酰基洋丁香酚苷（批號：94492-24-7）均購自上海源葉生物科技有限公司，純度≥98%；肉蓯蓉苷A（批號：MUST-20062806，純度：98.51%）、管花苷A（批號：MUST-19110102，純度：98.57%）均購自成都曼思特生物科技有限公司；色譜純乙腈、甲酸均購自天津市康科德科技有限公司；純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）；維生素E（VE，北京Solarbio 公司）；二甲基亞砜（DMSO，美國Sigma 公司）；CellTiter 96?AQueous 單溶液細胞增殖檢測試劑盒（G3580，美國Promega 公司）；CAT 檢測試劑盒（S0051）、SOD 活性檢測試劑盒（S0101M）、ROS 檢測試劑盒（S0033S）均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 儀器

H-class-PDA 型超高效液相色譜儀（美國Waters公司）；Sartorius BT25S 型電子天平（德國賽多利斯公司）；H1650 型高速臺式離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；SpectraMax M5 型酶標(biāo)儀（美谷分子儀器有限公司）；WYS-41XDY 型生物顯微鏡（天津微儀光學(xué)儀器有限公司）。

1.4 細胞

人胚腎細胞HEK293 細胞購自中國科學(xué)院細胞庫。

2 方法

2.1 指紋圖譜的建立

2.1.1 供試品溶液的制備 稱取肉蓯蓉藥材2 g，加10倍量水，加熱回流3次，每次1 h，1.0×105r·min–1離心15 min（離心半徑為300 mm），合并上清液，濃縮，制成質(zhì)量濃度100 mg·mL–1母液，稀釋10倍，0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.1.2 混合對照品溶液的制備 分別取8-表馬錢子酸、紅景天苷、松果菊苷、肉蓯蓉苷A、京尼平苷酸、毛蕊花糖苷、管花苷A、異毛蕊花糖苷、2′-乙酰基洋丁香酚苷、管花苷B 對照品適量，精密稱定，加入50%甲醇溶液使溶解，制備成質(zhì)量濃度為20 μg·mL–1的混合對照品溶液。

2.1.3 色譜條件 ACQUITY UPLC? BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相為乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B），梯度洗脫（0～6 min，5%～8%A；6～10 min，8%～15%A；10～13 min，15%～19%A，13～20 min，19%～25%A）；檢測波長為237 nm；流速為0.4 mL·min–1；柱溫為40 °C；進樣量為3 μL。

2.1.4 參照峰的選擇 在肉蓯蓉超高效液相色譜法（UPLC）色譜圖中，選擇峰面積占比最大、保留時間適中且具有良好的分離度的峰作為指紋圖譜的參照峰。

2.1.5 方法學(xué)考察 精密度試驗：取T1 樣品按2.1.1 項下方法制備供試品溶液，連續(xù)進樣6 次，記錄指紋圖譜，結(jié)果顯示各峰相對峰面積RSD 為0.10%～4.61%，相對保留時間的RSD 為0.08%～1.32%，表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗：取T1 樣品按2.1.1 項下方法平行制備6 份供試品溶液，連續(xù)進樣。結(jié)果顯示各色譜峰的相對峰面積RSD為1.35%～4.80%，相對保留時間RSD為0.10%～1.80%，符合指紋圖譜的要求，表明儀器的重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗：取T1 樣品按2.1.1 項下方法制備供試品溶液，分別在0、2、4、8、12 h 進樣檢測，記錄指紋圖譜。計算各色譜峰相對峰面積RSD 為0.53%～4.82%，相對保留時間的RSD 為0.09%～2.17%，符合指紋圖譜的要求，表明供試品在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2 肉蓯蓉抗氧化作用的研究

2.2.1 肉蓯蓉母液的制備 取2.1.1 項下母液，濾過除菌，臨用時用培養(yǎng)基稀釋至所需濃度即可。

2.2.2 肉蓯蓉對HEK293 細胞活力的影響 設(shè)置正常組（細胞懸液）、肉蓯蓉給藥組（25、50、100、200、400 μg·mL–1），每個質(zhì)量濃度設(shè)置6 個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h，每孔加入CellTiter 96? AQueous 單溶液試劑20 μL 檢測細胞存活率，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，使用酶標(biāo)儀檢測490 nm 下各孔吸光度（A），按公式（1）計算細胞存活率（%）。

2.2.3 肉蓯蓉對H2O2誘導(dǎo)HEK293 細胞的ROS 的影響 將細胞分為正常組（細胞懸液）、肉蓯蓉給藥組（6.25、12.50、25.00、50.00、100.00 μg·mL–1肉蓯蓉和60 μm·L–1H2O2），培養(yǎng)24 h。按照ROS 檢測試劑盒操作步驟進行后續(xù)操作，通過顯微鏡直接觀察細胞染色情況，并使用酶標(biāo)儀檢測各組熒光強度。參數(shù)設(shè)置使用488 nm 激發(fā)波長，525 nm 發(fā)射波長。實驗重復(fù)3次。

2.2.4 肉蓯蓉對H2O2誘導(dǎo)HEK293 細胞的SOD 的影響 將細胞分為正常組（細胞懸液）、模型組（60 μm·L–1H2O2）、VE組（60 μm·L–1VE和60 μm·L–1H2O2）、肉蓯蓉給藥組（100 μg·mL–1肉蓯蓉和60 μm·L–1H2O2），培養(yǎng)24 h 后收集細胞，加SOD 樣品制備液裂解細胞，4 ℃、12 000 r·min-1離心5 min（離心半徑為300 mm），取上清液作為待測樣品，按照SOD 檢測試劑盒操作步驟進行后續(xù)操作。實驗重復(fù)3次。

2.2.5 肉蓯蓉對H2O2誘導(dǎo)HEK293細胞的CAT的影響 按2.2.4 項下方法及分組給藥處理后加入裂解液，4 ℃、12 000 r·min–1離心10 min（離心半徑為300 mm），取上清，按照CAT 檢測試劑盒操作步驟進行后續(xù)操作。實驗重復(fù)3次。

2.2.6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 26.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，各組數(shù)據(jù)均以（±s）表示，對符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，如果方差齊，采用Least-Significant Difference法，如果方差不齊，采用Dunnett′s T3 法。使用GraphPad Prism 8 作圖，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.3 肉蓯蓉抗氧化的譜-效關(guān)聯(lián)分析

2.3.1 PCA 將已建立指紋圖譜的10 批肉蓯蓉共有峰的峰面積進行Z值標(biāo)準化處理，制作成10×17階數(shù)據(jù)矩陣，將其導(dǎo)入SPSS 26.0軟件進行PCA。

2.3.2 PCC 運用SPSS 26.0 進行雙變量分析，研究肉蓯蓉指紋圖譜與抗氧化之間的譜效關(guān)系，顯著性檢測采用雙側(cè)檢驗（T）以P<0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義的標(biāo)準。

2.3.3 PLS 將肉蓯蓉標(biāo)準化峰面積和抗氧化的實驗結(jié)果導(dǎo)入SIMCA-P 14.1 軟件，將峰面積設(shè)為X變量，藥效指標(biāo)設(shè)為Y變量，進行PLS。

2.4 肉蓯蓉Q-marker抗氧化活性驗證

2.4.1 活性成分母液的制備 精密稱定京尼平苷酸、8-表馬錢子酸、松果菊苷、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷、管花苷A 適量，分別加入DMSO 使其溶解成10 mmol·L–1的對照品溶液。

2.4.2 活性成分對HEK293 細胞毒性的影響 將HEK293細胞孵育24 h后，每孔分別加入不同濃度的2.4.1 項下活性成分溶液（0.781、1.563、3.125、6.250、12.500、25.000、50.000、100.000 μmol·L–1）100 μL，持續(xù)刺激細胞24 h 后加入CellTiter 96?AQueous單溶液試劑檢測細胞存活率。

2.4.3 活性成分對H2O2誘導(dǎo)HEK293 細胞的抗氧化損傷作用 細胞分組如下：正常組、模型組、VE組同2.2.4項下分組，實驗組（0.781、1.563、3.125 μm·L–1活性成分和60 μm·L–1H2O2），培養(yǎng)24 h。分別按2.2.3、2.2.4、2.2.5 項下方法測定細胞內(nèi)ROS 水平、SOD和CAT含量。

3 結(jié)果

3.1 指紋圖譜的建立

按2.1 項下方法制備10 批供試品溶液，采用2.2 項下的色譜條件進行檢測，獲得各批次樣品的指紋圖譜（圖1），選擇11 號峰（C11）作為指紋圖譜的參照峰。將肉蓯蓉供試品指紋圖譜的液相數(shù)據(jù).AIA文件導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”（2012 版）。在共有模式下標(biāo)定了17 個共有色譜峰，與混合對照品圖譜（圖2）比對，共指認出10個共有峰。

圖1 10批肉蓯蓉UPLC指紋圖譜

圖2 10批肉蓯蓉共有色譜峰的指認圖譜

3.2 肉蓯蓉抗氧化作用的研究

3.2.1 肉蓯蓉對HEK293 細胞活力的影響 與正常組細胞相比，肉蓯蓉質(zhì)量濃度為50～100 μg·mL–1時未產(chǎn)生細胞毒性，細胞存活率均大于90%。隨著肉蓯蓉的質(zhì)量濃度的增加，細胞活力隨之下降。因此，后續(xù)實驗選擇質(zhì)量濃度為100 μg·mL–1的肉蓯蓉給藥。

3.2.2 肉蓯蓉對H2O2誘導(dǎo)HEK293 細胞的ROS 的影響 通過GraphPad Prism 8軟件計算肉蓯蓉在不同濃度下的ROS IC50，結(jié)果見圖3、表2。

圖3 10批肉蓯蓉對ROS抑制率曲線（±s,n=6）

表2 10批肉蓯蓉對ROS的IC50數(shù)據(jù) μg·mL–1

3.2.3 肉蓯蓉對H2O2誘導(dǎo)HEK293 細胞的SOD 的影響 如圖4 所示，與正常組相比，模型組細胞中SOD 活性顯著降低，肉蓯蓉給藥組SOD 活性均有不同程度的升高（P<0.001），說明肉蓯蓉可以提高胞內(nèi)SOD酶活力。

圖4 10批肉蓯蓉對HEK293細胞氧化損傷后SOD含量的影響（±s,n=6）

3.2.4 肉蓯蓉對H2O2誘導(dǎo)HEK293細胞的CAT的影響 如圖5 所示，H2O2可導(dǎo)致細胞內(nèi)CAT 酶活性顯著下降（P<0.001），活力僅達到正常組的30%，說明H2O2嚴重損傷了細胞的抗氧化系統(tǒng)，肉蓯蓉給藥后，細胞內(nèi)CAT酶活力明顯升高（P<0.001）。

圖5 10批肉蓯蓉對HEK293細胞氧化損傷后CAT含量的影響（±s,n=6）

3.3 基于譜效關(guān)聯(lián)分析的肉蓯蓉Q-marker篩選

3.3.1 PCA 以特征值>1 和累積方差貢獻率>85%為標(biāo)準，提取得到4個主成分，其中前3個主成分的碎石圖（圖6）曲線較陡，代表其方差貢獻率較大。4 個主成分的累積方差貢獻率為87.640%，表明這4個主成分可以代表原有變量87.640%的信息。初始特征值和方差貢獻率見表3。

圖6 10批肉蓯蓉的PCA碎石圖

表3 10批肉蓯蓉4個主成分的PCA特征值和方差貢獻率

用凱撒正態(tài)化最大方差法處理得到旋轉(zhuǎn)成分矩陣，見表4。根據(jù)各色譜峰在4 個主成分上的載荷值，可提取出每個主成分所反映的信息，即載荷值越大，說明該色譜峰對該主成分的影響越大。在主成分1 中，峰1～3、5、7、11、13～15 的載荷絕對值最大；在主成分2 中，峰6、16 的載荷絕對值最大；峰17解釋主成分3的信息，峰8對主成分4的影響最大，因此選擇峰1～3、5～8、11、13～17 這13 個化學(xué)成分作為肉蓯蓉的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，進行后續(xù)的譜效分析。

表4 10批肉蓯蓉的PCA因子載荷矩陣

3.3.2 PCC ROS IC50為藥效負向指標(biāo)，因此相關(guān)系數(shù)為負則代表因變量與藥效呈正相關(guān)，肉蓯蓉的13 個色譜峰相關(guān)系數(shù)均為負，說明都與清除ROS IC50呈正相關(guān)，其中峰14、3、7、11、1、13 與ROS IC50呈極強相關(guān)（P<0.01），峰2、5、15 呈強相關(guān)（P<0.05）；13個色譜峰均與SOD呈正相關(guān)，其中峰13、3、15、11、2 與SOD 呈極強相關(guān)（P<0.01），峰1、14、7、5、6 呈強相關(guān)（P<0.05）；有11 個峰與CAT 呈正相關(guān)，峰5 與CAT 呈強相關(guān)（P<0.05）。結(jié)果見表5。

表5 肉蓯蓉抗氧化Pearson相關(guān)系數(shù)

結(jié)合ROS IC50、SOD、CAT 的PCC 結(jié)果，選擇峰1～3、5、7、11、13～15 作為肉蓯蓉發(fā)揮抗氧化作用的活性成分群。

3.3.3 PLS 在PLS 中，13 個色譜峰的ROS IC50回歸系數(shù)均為負，與藥效活性呈正相關(guān)，其中VIP值>1的色譜峰依次為14、3、11、1、7、13、2、5、15（圖7A）；在SOD 酶活力研究中，所有峰的系數(shù)為正，即所有峰與藥效呈正相關(guān)，其中VIP 值>1 的色譜峰依次為13、3、15、11、2、1、14、7（圖7B）；在CAT 酶活力研究中，除峰6、16 外，其余色譜峰均與藥效呈正相關(guān)，其中VIP值>1的色譜峰依次為：5、13、14、11、7（圖7C）。篩選出峰1～3、5、7、11、13～15 所代表的化合物為PLS 模型中潛在的抗氧化活性成分。

圖7 10批肉蓯蓉的抗氧化PLS（±s,n=6）

3.4 肉蓯蓉Q-marker活性驗證

3.4.1 活性成分對HEK293 細胞毒性的影響 根據(jù)譜效關(guān)聯(lián)分析的結(jié)果，選擇京尼平苷酸、8-表馬錢子酸、松果菊苷、毛蕊花糖苷、管花苷A、異毛蕊花糖苷6個成分進行活性驗證。肉蓯蓉6個活性成分濃度在0.781～3.125 μmol·L–1時未出現(xiàn)細胞毒性，細胞存活率均大于90%。隨著濃度增加，細胞活力受到抑制。因此，后續(xù)給藥濃度選擇0.781、1.563、3.125 μmol·L–1。

3.4.2 活性成分對H2O2誘導(dǎo)HEK293 細胞的抗氧化損傷作用 通過檢測各活性成分對細胞內(nèi)ROS 的清除作用和SOD、CAT 酶活力的調(diào)控能力來驗證其是否具有抗氧化的作用。在ROS 清除實驗中，京尼平苷酸的中、高劑量組與模型組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01，P<0.001，圖8A），8-表馬錢子酸、松果菊苷、管花苷A、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷的低、中、高劑量組與模型組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001，圖8B、圖8C），說明6個單體均有一定程度的清除ROS的作用；在SOD和CAT酶活力測定實驗中，活性成分的低、中、高劑量組的酶活力均比模型組高，說明6 個單體均能提高SOD 和CAT酶活力。

圖8 肉蓯蓉活性成分對H2O2誘導(dǎo)HEK293細胞的抗氧化損傷的影響（±s,n=6）

4 討論

本研究對乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水、0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水3個流動相進行了考察，當(dāng)選擇乙腈-0.1%甲酸水時，峰形較好、分離效果最佳、基線較平穩(wěn)，最終采用乙腈-0.1%甲酸水作為流動相。考察了在不同流速（0.2、0.3、0.4 mL·min–1）下色譜峰的分離效果，在流速為0.4 mL·min–1的條件下，各色譜峰分離度較好，出峰時間適中。考察了色譜柱在35、40、45 ℃下的分離效果，結(jié)果表明3 個柱溫條件下，指紋圖譜分離效果相近，為了便于實驗條件控制，最終將柱溫設(shè)為40 ℃。使用光電二極管陣列（DAD）檢測器在190～400 nm 范圍內(nèi)掃描肉蓯蓉3D 指紋圖譜，在237 nm 波長下呈現(xiàn)的峰信息量大，基線較平穩(wěn)，因此選擇237 nm 為檢測波長。最終確定了最佳色譜條件，建立了一種簡單、可靠的指紋圖譜方法，峰容量更大，分離效果更好。

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)通過提高機體的抗氧化能力可以有效緩解腎虛病癥[11-14]，課題組前期通過線蟲實驗發(fā)現(xiàn)肉蓯蓉可以延長線蟲壽命，提高運動能力，降低脂褐素水平，其作用機制可能是通過提高SOD、CAT 酶活力，降低ROS 水平，抵抗氧化損傷延緩衰老[15]。細胞內(nèi)的ROS 水平是反映細胞氧化損傷程度的一個重要標(biāo)志[16]，H2O2是一種膜易透性強氧化劑，可通過增加細胞內(nèi)的ROS 造成細胞氧化損傷。因此，本研究采用H2O2制備HEK293 細胞氧化損傷模型；SOD 是ROS 自由基清除酶系統(tǒng)中最關(guān)鍵的生物酶，在超氧化物歧化為氧和過氧化氫的過程中起催化劑的作用，從而減少ROS 的合成和氧化應(yīng)激[17]；CAT 是最關(guān)鍵的H2O2清除酶，也是ROS 清除酶系統(tǒng)中的主要生物酶之一[18]。基于此，本研究采用H2O2制備HEK293 細胞氧化損傷模型，分別以ROS IC50、SOD 和CAT 的含量作為藥效指標(biāo)綜合評價肉蓯蓉的抗氧化作用。

本研究通過建立譜效關(guān)系分析肉蓯蓉的活性成分，由于各種數(shù)學(xué)統(tǒng)計模型都存在一定缺陷，發(fā)展多種數(shù)據(jù)分析技術(shù)聯(lián)用及交叉驗證是有必要的。PCA 是一種運用降維思想的數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法，可提取出攜帶大量原始變量信息的主成分；PCC 可以描述兩變量間線性關(guān)系的密切程度、相關(guān)性大小及方向；PLS 分析集成了多元線性回歸、PCA 和典型相關(guān)分析的優(yōu)點，是一種模型擬合度好、預(yù)測能力強的數(shù)據(jù)處理方法[19]。因此，本研究首先通過PCA 對數(shù)據(jù)降維處理，提高譜效關(guān)系研究結(jié)果的科學(xué)性與準確性[20]。再選用PCC 結(jié)合PLS 篩選肉蓯蓉的抗氧化活性成分，兩種檢測方法得到的檢測結(jié)果基本一致，共篩選出9個活性成分，其中有6個成分已用對照品指認，課題組運用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對其中3 個未知成分進行表征，鑒定色譜峰C2、C3為8-表馬錢子酸異構(gòu)體，C7為紫葳新苷Ⅱ異構(gòu)體，故后續(xù)活性驗證中只考察了京尼平苷酸、8-表馬錢子酸、松果菊苷、管花苷A、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷6個成分，通過單體活性試驗，驗證了這6個成分均具有抗氧化活性。

從質(zhì)量傳遞與溯源的角度，藥物經(jīng)吸收入血后的效應(yīng)成分才是質(zhì)量傳遞體系的最終環(huán)節(jié)，也是Qmarker 確定的重要依據(jù)。Li 等[21]應(yīng)用超高效液相色譜飛行時間質(zhì)譜法（UPLC-Q-TOF-MS）探索肉蓯蓉在大鼠體內(nèi)的代謝產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)松果菊苷、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷、管花苷A 的原型及代謝產(chǎn)物。劉悅[22]研究了肉蓯蓉總苷在體內(nèi)的作用過程，在入血成分中鑒定出8-表馬錢子酸和京尼平苷酸的代謝產(chǎn)物，在肝勻漿中鑒定出8-表馬錢子酸的原型及代謝產(chǎn)物。環(huán)烯醚萜類化合物可以降低機體氧化應(yīng)激作用[23]，其中京尼平苷酸通過激活絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶/核轉(zhuǎn)錄因子E2 相關(guān)因子2/8-羥基鳥嘌呤DNA 糖苷酶修復(fù)酶（Akt/Nrf2/OGG1）途徑減輕H2O2誘導(dǎo)的HaCaT 細胞中的氧化應(yīng)激[24]。松果菊苷可以降低心肌細胞的ROS，從而提高線粒體膜電位，減少mtDNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的氧化損傷，有效抑制線粒體氧化損傷，減少體外和體內(nèi)細胞凋亡[25]。毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷對自由基帶來的氧化損傷具有強烈的保護作用，前者還可以改善D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老小鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力，抑制糖羰基化，增加谷胱甘肽過氧化物酶的活性，降低衰老相關(guān)酶胺氧化酶的活性來減少氧化應(yīng)激[26]。管花苷A具有自由基清除活性，對大鼠肝微粒體脂質(zhì)過氧化的抑制作用顯著[27-28]。現(xiàn)代研究表明，上述成分可能是肉蓯蓉抗氧化的主要活性成分，為本研究篩選的Q-marker的真實性提供了有效依據(jù)。

綜上所述，本研究采用指紋圖譜結(jié)合多種數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法構(gòu)建譜效關(guān)系，對肉蓯蓉抗氧化的Qmarker 進行預(yù)測分析，初步確認了京尼平苷酸、8-表馬錢子酸、松果菊苷、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷、管花苷A 為肉蓯蓉抗氧化的Q-marker，為肉蓯蓉質(zhì)量標(biāo)準的完善及藥效物質(zhì)的進一步闡明提供科學(xué)依據(jù)。

[利益沖突]本文不存在任何利益沖突。