基于HPLC-Q-TOF MS/MS和網絡藥理學的參蓉蛹草片質量標志物研究△

于鑫暢，韓彥琪，郝艷琦，劉建庭，許浚，3，蔣慶峰，張鐵軍，

1.天津中醫藥大學，天津 301617；2.天津藥物研究院 天津市中藥質量標志物重點實驗室，天津 300462；3.天津藥物研究院 藥物成藥性評價與系統轉化全國重點實驗室，天津 300462

疲勞（fatigue）是指機體感到極度乏力，維持自愿活動出現障礙，具體體現在軀體上存在無力感、精神上感到疲倦[1]。關于疲勞的中醫理論實踐豐富，認為疲勞乃“精氣奪則虛”，屬于氣血耗傷引起的虛證[2]。疲勞在中醫古籍記載多以“虛勞”“神勞”表述，其病因可歸納為情志過激、外感至損、不良的飲食環境和生活方式等，疲勞臟腑病機則認為“肝虛、腎虛、脾虛皆令人體重煩冤”[2]。疲勞的機制復雜，學說眾多，且疲勞多并發癥造成社會負擔大[3-4]，因此抗疲勞對許多重大疾病的愈后過程及維持公眾健康具有重要意義。參蓉蛹草片由肉蓯蓉、人參、蛹蟲草3 味藥食同源的藥材組成，具有抗疲勞、提高免疫力的功效。目前，關于參蓉蛹草片的藥效物質基礎不明確、作用機制不清晰、質量標準不完善，缺乏統一規范化的質量評價標準體系，無法有效控制其藥品質量。

2016 年劉昌孝院士提出中藥質量標志物（Qmarker）的核心概念和理論[5-6]，是基于配伍環境、物質有效性、傳遞與溯源、特有性、可測性的“五原則”發現途徑進行的研究，有利于建立以Qmarker 為基礎的復方中藥質量標準及質量控制體系[7]。

有效性是Q-marker 研究的核心內容之一，網絡藥理學從生物網絡穩態的角度出發，以整體性和系統性為特點，通過數據挖掘、網絡構建、拓撲分析找到關鍵節點，進而預測已知藥物防治疾病藥效活性成分、作用靶點，以及可能參與調控的細胞信號轉導通路與作用機制[8]。本研究采用高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜法（HPLC-Q-TOF-MS/MS）明確參蓉蛹草片化學物質組，通過網絡藥理學和分子對接技術，研究其抗疲勞作用機制，預測潛在的Qmarker，為參蓉蛹草片質量標準制訂和質量控制提供基礎。

1 材料

1.1 樣品

參蓉蛹草片（批號：20211130）由天津藥物研究院中藥研發中心提供；荒漠肉蓯蓉飲片（產地：新疆于田縣，批號：20201010、20210830）由合作企業提供；人參（產地：吉林，批號：2011131）、蛹蟲草（產地：云南，批號：20210301）均購自安徽普仁中藥飲片有限公司，經天津藥物研究院張鐵軍研究員鑒定，均符合《中華人民共和國藥典》2020年版（一部）的有關規定。

1.2 試藥

對照品毛蕊花糖苷（批號：111530-201914）和三七皂苷R1（批號：110745-201820）購自中國食品藥品檢定研究院；松果菊苷（批號：M04S11D123213）、京尼平苷酸（批號：Z24A10x95926）、異毛蕊花糖苷（批號：W17J10C90785）、管花苷B（批號：D20A11S121686）、紅景天苷（批號：N1109X71936）、8-表馬錢子酸（批號：S09GB160642）、人參皂苷Rg2（批號：M07N10S102243）、人參皂苷Rg1（批號：G30N10Y104330）、人參皂苷Rd（批號：Z09A9x67397）、人參皂苷Re（批號：B04D9S76499）、人參皂苷Rb1（批號：G01011Y126429）均購自上海源葉生物科技有限公司；管花苷A（批號：MUST-19110102）、肉蓯蓉苷A（批號：MUST-20062806）購自成都曼斯特生物科技有限公司，所有對照品純度均大于90%；色譜級甲醇購自天津市康科德科技有限公司；質譜級甲酸購自美國Fisher 公司；純凈水購自廣州屈臣氏食品飲料有限公司。

1.3 儀器

ExionLC 型高效液相色譜儀（日本島津公司）；X500R QTOF 型質譜儀（美國SCIEX 公司）；BCE224I-1CCN 型電子分析天平（美國Sartorius 公司）；KQ500DE 型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.4 數據庫與軟件

Pubchem 數據庫（https://pubchem.Ncbi.Nlm.Nih.gov/）、SwissTargetPrediction 數據庫（http://www.Swisstargetprediction.ch/）、UniProt 數據庫（http://www.uniprot.org/）、GeneCards 數據庫（https://www.genecards.org/）、OMIM 數據庫（https://www.omim.org/）、TTD 數據庫（http://db.idrblab.net/ttd/）、Metascape 數據庫（https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1）、蛋白結構數據庫（PDB，http://www.rcsb.org/）、Bioinformatics數據庫（http://www.bioinformatics.com.cn/）、Cytoscape 3.8.0 軟 件、Schr?dinger 2020 Maestro 12.4軟件。

2 方法

2.1 對照品和供試品溶液的制備

2.1.1 對照品溶液制備 分別取松果菊苷、毛蕊花糖苷、管花苷A、肉蓯蓉苷A、三七皂苷R1、京尼平苷酸、異毛蕊花糖苷、管花苷B、紅景天苷、8-表馬錢子酸、人參皂苷Rg2、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rd、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1對照品適量，精密稱定，置于10 mL 棕色量瓶中，加甲醇溶解至刻度，制備成混合對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取參蓉蛹草片適量，研磨成細粉（過五號篩），取約7 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加50%甲醇水溶液50 mL，稱定質量，超聲處理（功率250 W，頻率30 kHz）60 min，放冷，再稱定質量，用50%甲醇補足減失的質量，0.45 μm有機膜濾過，取續濾液，即得。

2.1.3 原藥材供試品溶液的制備 分別取肉蓯蓉粉末（過四號篩）1 g、人參粉末（過四號篩）1 g 和蛹蟲草粉末（過四號篩）1 g，精密稱定，分別置具塞錐形瓶中，按2.1.2項下方法制備。

2.2 色譜條件

Inertsil? ODS-3 C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為0.1%甲酸甲醇溶液（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～10 min，5%A；10～25 min，5%～13%A；25～35 min，13%～21.5%A；35～50 min，21.5～41.5%A；50～80 min，41.5%～100%A；80～90 min，100%A）；體積流量為0.8 mL·min–1；柱溫為35 °C；進樣量為10 μL。

2.3 質譜條件

X500R QTOF型高分辨質譜儀，正、負2種模式掃描測定；電噴霧離子源（ESI）；IDA 模式；錐孔電壓為30 V，離子源溫度為600 ℃，樣品錐孔電壓為30 V，錐孔氣流速為50 L·h–1，氮氣脫氣溫度為350 ℃，脫氣流速為600 L·h–1，掃描范圍為m/z50～1500，一級電壓為10 V，二級電壓為35 V。

2.4 參蓉蛹草片化學成分的鑒定

通過HPLC-Q-TOF-MS/MS高分辨的定性能力獲取到參蓉蛹草片化學組分數據，再利用SCIEX OS軟件分析母離子及二級碎片信息、保留時間，通過對照品和已有文獻建立的數據庫信息等驗證并確定化合物信息[9-23]。

2.5 網絡藥理學目標成分的選取

目標化合物篩選主要遵循以下3 個原則：1）經過本課題組對于參蓉蛹草片的物質基礎研究并以含量優先原則篩選，化學成分的可測性是Q-marker 應用的必備條件[6]；2）“有效”是Q-marker 的核心要素，對復方有效性成分的篩選應基于藥效活性，選取各類型的代表性化合物，考慮納入具有明確的藥理作用、有臨床試驗研究、安全性評價、質量標準的可以產生預期藥效的化學成分[6]；3）血中效應成分是有效性成分質量傳遞的最終環節，是Q-marker確定的重要依據[6]。

2.6 基于網絡藥理學預測參蓉蛹草片抗疲勞作用機制

將2.5 項下選取的參蓉蛹草片的活性成分，利用Pubchem 獲悉結構，進入SwissTargetPredictio 預測靶點，進行整合。以“chronic fatigue”“fatigue”等為關鍵詞在TTD、OMIM、GeneCards數據庫中檢索疾病相關靶點。將已獲取的成分、疾病相關靶點分別保留唯一值，利用Venny 2.1.0將藥物成分作用靶點與疲勞靶點取交集處理后，得到活性成分對疲勞有相關作用的靶點。隨即將相關靶點導入String 11.5 數據庫，將獲得的蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡分析表導入Cytoscape 3.8.0使之可視化，并通過插件Network Analyzer 分析degree 值，篩選PPI 網絡中Q-marker 值大于中位數的關鍵靶蛋白。利用Metascape 數據庫對通過PPI 篩選出關鍵靶點進行基因本體功能富集分析（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析。GO 與KEGG分析均設置P<0.01（表示差異具有統計學意義）。利用Cytoscape軟件，建立起成分-靶點-通路網絡。

2.7 分子對接驗證

第一步獲取2.5 項下目標化合物的.sdf 結構，導入Maestro 軟件，使用LigPrep 模塊，對小分子進行配體預處理，得到結果為“out-maegz”文件。第二步根據拓撲學參數獲得關鍵蛋白，受體蛋白從Protein Data Bank 數據庫中檢索獲得，利用Protein Preparation 模塊對受體蛋白進行去水、去配體、加氫、平衡電荷、補全鏈上缺失原子。受體蛋白能量最小化后得到后綴為.zip 的文件。使用Binding Site Detection、Receptor Gird Generation 模塊對配體結合空腔進行選擇。第三步是利用Ligand Docking 模塊，分別將以上處理后的配體和受體文件導入，默認功能設置，進行半柔性分子對接。

3 結果

3.1 參蓉蛹草片化學成分識別

從參蓉蛹草片中共鑒定出124 個成分，包含氨基酸類、核苷類、苯乙醇苷類、環烯醚萜類、木脂素類、人參皂苷類等類化合物。其中通過對單味藥的成分歸屬發現這些成分中除部分氨基酸、腺苷、甘露醇和糖類之外，其他成分在各個不同中藥之間并未產生交叉。其中72 個化學成分來源于肉蓯蓉；33 個成分來源于人參；5 個成分來源于蛹蟲草，共有成分14 個（表1）。基于質量傳遞與溯源的Qmarker 研究途徑，利用HPLC-Q-TOF-MS/MS 技術對單味藥材原有成分及參蓉蛹草片復方中原型成分進行分析和鑒定，明確了成分的量值傳遞及其變化規律[6]。闡明了參蓉蛹草片的物質基礎。對照品總離子流圖見圖1，參蓉蛹草片總離子流圖見圖2。

圖1 混合對照品總離子流圖

圖2 參蓉蛹草片總離子流圖

表1 參蓉蛹草片中化學成分質譜數據

以苯乙醇苷類松果菊苷（C35H46O20，785.250 9）為例，大多數苯乙醇苷類化合物在質譜中往往先發生苯丙烯酸酯苷鍵的斷裂如咖啡酰基（C9H8O4，Caf），其可發生中性與負離子兩種丟失狀態，以及糖的裂解，主要是鼠李糖（C6H12O5，RhA）、葡萄糖（C6H12O6，Glc）。在負離子模式下的質譜數據為785.249 8[M–H]–、623.217 4[M–H–Rha]–；461.167 5[M–H–Caf]–；179.035 8[M–H–Rha–Caf–2Glc]–；161.023 8[M–H–Rha–Caf–2Glc–OH]–，其保留時間與裂解規律均與對照品一致，見圖3。

以人參皂苷類人參皂苷Rb1（C54H92O23，1 107.595 6）為例，屬于人參二醇型人參皂苷，在ESI 源負離子模式下，主要發生了C-3、C-20 鍵的斷裂，從而產生去糖基化皂苷元。在負離子模式下的質譜數據為其在質譜負離子模式下的裂解規律為1 107.590 1[M–H]–；945.542 3[M–H–Glc]–；783.494 5[M–H–2Glc]–；621.443 0[M–H–3Glc]–；459.399 8[M–H–4Glc]–，見圖4。

圖4 人參皂苷Rb1質譜數據及可能的裂解途徑

3.2 目標成分的選取

按2.5 項下的目標成分選取原則結合現有文獻研究[24-33]，從已鑒定出的124 個化學成分中共選取了包括苯乙醇苷類、環烯醚萜類、人參皂苷類、核苷類在內的，總計23 個化學成分，作為參蓉蛹草片網絡藥理學的目標化合物，見表2。

表2 參蓉蛹草活性成分

3.3 基于網絡藥理學預測參蓉蛹草片抗疲勞作用機制

通過SwissTargetPrediction、TCMSP 數據庫對獲取到的23 個成分可能的靶點進行處理，刪除重復靶點，共得到520 個靶點。通過在TTD、OMIM、GeneCards數據庫中檢索疾病相關靶點，刪除重復靶點，共得到7341 個相關靶點。利用Venny 2.1.0 得到參蓉蛹草片抗疲勞的潛在靶點396個。String 11.5數據庫獲得PPI 關系圖，并篩選出degree 值>21（中位數）的195 個節點，顏色越深代表degree 值越大，PPI網絡關系，見圖5。

圖5 參蓉蛹草片抗疲勞潛在靶點蛋白PPI網絡

3.4 GO與KEGG分析

3.4.1 GO 富集分析 GO 富集分析中共包含3 個部分，生物過程（BP）獲取到2208個條目；細胞組分（CC）獲取到148 個條目；分子功能（MF）獲取到227個條目。篩選出排名前10者，并繪制GO功能富集分析組圖，以富集到的GO 功能（BP、CC、MF）為橫坐標，以在該GO 功能上富集到的基因數目為縱坐標，結果見圖6。由此可知，生物過程主要涉及絲裂原活化蛋白激酶級聯的調節等；細胞成分主要參與構成膜筏等；分子功能主要參與磷酸轉移酶活性等，推測這可能與參蓉蛹草片抗疲勞相關。

圖6 參蓉蛹草片抗疲勞靶點的GO功能富集分析

3.4.2 KEGG 分析 KEGG 通路分析中共有214 條通路被富集到選擇富集P值排名前10 與抗疲勞發展相關的條目為縱坐標，以在該通路上富集到的基因數目為橫坐標并以氣泡大小代表基因數目，以氣泡顏色代表P值，進行可視化分析見圖7，參蓉蛹草片可能通過作用于與生物代謝相關的通路如磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號通路；與免疫功能密切相關的通路如白細胞介素（IL）-17信號通路；與神經內分泌系統相關通路如神經退行性病變-多種疾病的通路等發揮抗疲勞作用。

圖7 參蓉蛹草片抗疲勞靶點的KEGG可視化氣泡圖

3.5 化合物-靶點-通路網絡構建

通過Cytoscape 3.8.0，根據網絡拓撲學分析，建立活性成分-靶點-通路，總共產生251 個節點，1428 條邊，并以degree 值來顯示（顏色越深，degree值越高）結果見圖8。

圖8 參蓉蛹草片成分-靶點-通路網絡

通過網絡分析，參蓉蛹草片中的有效活性成分與多個靶基因有關，同時也可以發現該處方在發揮抗疲勞作用過程中與少數關鍵靶點有較強的聯系。

3.6 分子對接結果

將3.2項下23個活性成分與degree值排名前15的關鍵靶點PRKCA（degree=26）、MAPK1（degree=25）、PRKCB（degree=22）、HSP90AA1（degree=21）、IL2（degree=19）、CASP3（degree=19）、MAPK3（degree=18）、MMP2（degree=18）、MMP13（degree=18）、MMP9（degree=17）、CA9（degree=17）、ADORA2A（degree=17）、HRAS（degree=16）、PIK3CA（degree=16）、F2（degree=16）進行對接，結果以Docking Score 表示，數值越小表示結合越好（一般情況下，Docking Score≤–5時），說明所選的受體與配體可以自發結合，提示成分與各靶點有較強的結合活性，以縱坐標代表成分與靶點之間的累積結合分數的堆疊圖見圖9。通過分子對接實驗結果發現，參蓉蛹草片的23 個化學成分與15 個靶點之間均展現了良好的結合效果，苯乙醇苷類中以松果菊苷，異毛蕊花糖苷、環烯醚萜類中8-表馬錢子酸，人參皂苷類中人參皂苷Rg1、人參皂苷Rg2，核苷類中腺苷、蟲草素累積結合分數較高，提示成分與多個靶點之間有較強的結合活性，挑選代表性對接結果附對接分數見圖10。

圖9 參蓉蛹草片“配體-受體”分子對接結果堆積圖

4 討論

通過HPLC-Q-TOF-MS/MS對參蓉蛹草片化學成分分析，確定參蓉蛹草片中主要化學成分為氨基酸類、苯乙醇苷類、環烯醚萜類、木脂素類、人參皂苷類、核苷類等類成分。王小明[33]通過對荒漠肉蓯蓉體內成分分析，發現苯乙醇苷類為其主要的入血成分。陳思慧[29]研究發現，參附湯中人參入血原型成分為人參皂苷類，如人參皂苷Rg1、人參皂苷Rg2、人參皂苷Rb1、人參皂苷Re。曹靈杰[27]通過對蛹蟲草的血清藥物化學進行研究發現核苷類，如蟲草素和腺苷以原型成分被吸收入血。因此，從質量傳遞與溯源途徑分析，以上成分可以作為參蓉蛹草片的Qmarker。基于有效性途徑，根據網絡藥理學分析，參蓉蛹草片苯乙醇苷類、環烯醚萜類、人參皂苷類可能在能量代謝、氧化應激、免疫系統、神經內分泌方面發揮抗疲勞作用。

機體維持正常生命活動的能量物質是三磷酸腺苷（ATP）和糖原，在肌肉工作時，會消耗糖原產生ATP，ATP 被分解供生命活動所需的能量，當機體經過一段時間的運動強度，肝糖原和肌糖原用于肝臟和骨骼肌功能異常，會導致外周疲勞，引起傳導阻滯[34-35]，肉蓯蓉中的松果菊苷、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷等苯乙醇苷類會作用于蛋白激酶Cα（PRKCA）、絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）等蛋白靶點影響PI3K-Akt 信號通路，影響葡萄糖攝取，進而影響糖酵解[10]。張莎莎[36]發現不同濃度蟲草素給藥小鼠運動疲勞組均能提高肝糖原和肌糖原水平。線粒體鈣離子作為調節細胞內能量轉換的主要離子，是重要的調控因子[37]，肉蓯蓉中的松果菊苷通過影響Ca2+通道，有利于橫紋肌進行興奮收縮耦聯。因此，參蓉蛹草片中苯乙醇苷類、蟲草素可能作為潛在的Q-marker。

免疫系統失調是病理性疲勞[38-39]患者體內存在的異常生物過程之一，這是由于患者存在炎癥和自身免疫癥狀[40-41]，有研究表明17 種細胞因子與疲勞嚴重程度相關，其中的13 種是促炎癥細胞因子[42]。肉蓯蓉中的毛蕊花糖苷、肉蓯蓉苷A 等苯乙醇苷類激活IL-17 通路中基質金屬蛋白酶（MMP）2、MMP13、MMP9 蛋白靶點，影響IL-17 信號通路開啟宿主防御機制，對細胞外病原體免疫。因此，參蓉蛹草片中苯乙醇苷類可能作為潛在的Q-marker。

對氧化應激與急性運動的研究表明，在人體骨骼肌氧需求量的急劇變化時，氧敏感途徑會被激活，線粒體內發生氧化磷酸化形成超氧化物等活性氧簇，從而影響線粒體功能，導致能量合成供應不足、運動能力下降，從而誘發機體疲勞發生，可能會通過增加毛細血管生長來適應[43]。人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Re 等人參皂苷類均可以作用于血管內皮生長因子（VEGFA）[44]，松果菊苷、肉蓯蓉苷A等苯乙醇苷類可作用于PRKCA等影響缺氧誘導因子（HIF-1）信號通路發揮作用，用于適應骨骼肌氧需求量的急劇變化[44]。因此，參蓉蛹草片中苯乙醇苷類、人參皂苷類可能作為潛在的Q-marker。

中樞性疲勞主要與神經調控相關[45]，慢性疲勞綜合征患者體內存在異常生物學過程之一是中樞神經系統和神經內分泌調節的細微變化[46]。有研究表明多巴胺（DA）是哺乳動物大腦中一種慢速神經遞質，控制著包含運動活動在內的多種功能，會促進中型棘狀神經元（MSNs）的興奮性參與調節紋狀體運動控制功能[47]。肉蓯蓉中的松果菊苷、管花苷A等苯乙醇苷類可以通過作用于腺苷受體A2A（ADORA2A）影響神經內分泌系統有關通路，研究表明ADORA2A與多巴胺D2受體存在直接的拮抗關系[48]，也有報道稱兩者形成功能性異聚體受體復合物[49]。因此，參蓉蛹草片中苯乙醇苷類可能作為潛在的Q-marker。

綜上，本研究通過網絡藥理學、分子對接對參蓉蛹草片中的23 個化學成分進行靶點及通路的分析，并基于成分的特有性、可測性途徑進一步預測參蓉蛹草片的Q-marker。苯乙醇苷類、人參皂苷類為參蓉蛹草片代表性化合物并初步預測為參蓉蛹草片的Q-marker，結合課題組后期對參蓉蛹草片指紋圖譜研究，多指標含量測定研究進一步預測參蓉蛹草片中松果菊苷、8-表馬錢子酸，人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1及人參皂苷Re為參蓉蛹草片的Q-marker。初步闡釋了參蓉蛹草片通過多成分、多靶點、多通路發揮抗疲勞的藥理作用機制，可為參蓉蛹草片的深入研究和質量控制提供參考。

[利益沖突]本文不存在任何利益沖突。