比較蛋白質組學揭示茉莉酸甲酯誘導的雷公藤甲素生物合成△

張逸風，趙瑜君，蘇平，吳曉毅，夏夢，高偉*，黃璐琦*

1.中國中醫科學院 中藥資源中心 道地藥材品質保障與資源持續利用全國重點實驗室，北京 100700；2.首都醫科大學 中醫藥學院，北京 100069

雷公藤為衛矛科植物雷公藤Tripterygium wilfordiiHook.f.的全根或根的木質部，具有祛風除濕、通絡止痛的功效。其主要活性成分雷公藤甲素具有顯著的抗腫瘤、抗炎、免疫抑制等藥理活性[1-2]，可用于治療類風濕性關節炎、系統性紅斑狼瘡、肝癌、胰腺癌等[3]。然而，當前雷公藤甲素的獲取仍主要依賴于從植物中直接提取分離，其在基原植物中的質量分數僅為0.000 1%[4]。隨著新藥開發、基礎科研和臨床需求不斷增加，藥物基原植物和土地資源破壞日益加劇，急需尋求新的資源獲取途徑。

近年飛速發展的合成生物學為雷公藤甲素等中藥活性成分異源獲取帶來可能。Paddon 等[5]通過整合青蒿素生源途徑基因至大腸埃希菌底盤，使青蒿素前體青蒿酸產量達到25 g·L–1，并通過簡單的化學反應獲得青蒿素。Hong 等[6]解析了士的寧生物合成下游8 個關鍵酶參與的10 步生物合成途徑，實現了煙草從頭合成士的寧、馬錢子堿等活性成分。因此，異源合成首先需要解析完整的生物合成途徑。雷公藤甲素的生物合成首先經過甲羥戊酸（MVA）和2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸（MEP）途徑生成牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸（GGPP），后經柯巴基焦磷酸合酶TwTPS7(v2) 和次丹參酮二烯合酶TwTPS27(v2)生成二萜骨架次丹參酮二烯[7]，再由CYP82Ds、CYP71BEs 等進行骨架修飾[8-9]。盡管近年來在雷公藤甲素生物合成途徑解析方面取得了較好的進展，但其生源途徑仍未完全解析。

蛋白質是基因轉錄、翻譯和加工后的產物，其作為生命活動的主要承擔者能夠直接參與代謝過程。通過蛋白質水平的研究能夠有效反映不同生理或病理狀態下蛋白質的表達情況，相較于研究基因轉錄水平的表達其具有更直接的優勢。目前，植物蛋白質組學研究主要應用于大豆、水稻、番茄等[10-11]，在藥用植物領域應用較少。本研究應用比較蛋白質組學技術探究雷公藤甲素生物合成關鍵酶，為中藥活性成分生源途徑解析研究提供參考。

1 材料

1.1 樣品

雷公藤懸浮細胞由中國中醫科學院中藥資源中心實驗室繼代保存。

1.2 菌株和載體

大腸埃希菌Escherichia coli Trans1-T1 感受態細胞、pEASY?-Blunt Zero載體均購自北京全式金生物技術有限公司；pENTR ?/SD/D-TOPO?Vector、pENTR?/D-TOPO? Vector 均購自美國Invitrogen 公司；pK7GWIWG2D質粒為本實驗室保存。

1.3 試藥

Murashige&Skoog（MS）基本培養基（美國PhytoTechnology Laboratories 公司）；激動素（KT）、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）、吲哚-3-丁酸（IBA）、茉莉酸甲酯（MeJA）、卡那霉素、壯觀霉素均購自美國Sigma 公司；Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer（美 國New England Biolabs 公司）；KAPA SYBR?FAST Universal 2×qPCR Master Mix（美國KAPA Biosystems 公司）；瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒、RNA 純化試劑盒、FastKing RT Kit（With gDNase）均購自天根生化科技（北京）有限公司；E.Z.N.A Plasmid Maxi Kit、E.Z.N.A Plasmid Mini Kit 均購自美國Omega 公司；Gateway?LR Clonase? Ⅱ Enzyme Mix（美國Invitrogen公司）；Eastep?Super 總RNA 提取試劑盒（上海普洛麥格生物產品有限公司）；二奎啉甲酸（BCA）試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）。

1.4 儀器

Veriti?型96 孔梯度聚合酶鏈式反應（PCR）儀（美國Applied Biosystems 公司）；LightCycler 480 型熒光定量PCR 儀（瑞士Roche 公司）；ZHWY-200D型恒溫振蕩搖床（上海智城分析儀器制造有限公司）；MM400 型混合型研磨儀（德國Retsch 公司）；DYY-6D 型核酸電泳儀（北京市六一儀器廠）；BGgdsAUTO520 型凝膠成像分析系統（香港基因有限公司）；AC2-4S1 型生物安全柜（新加坡ESCO 科技有限公司）；5810R型低溫冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；BT25S型十萬分之一天平（德國賽多利斯公司）；S210 型pH 計（美國Mettler-Toledo 公司）；ACQUITY UPLC? Ⅰ-Class System 型超高效液相色譜（美國Waters 公司）；NanoDrop One 型核酸/蛋白質分析儀、EASY-nLC1000 型高效液相色譜（美國Thermo Scientific公司）。

2 方法

2.1 雷公藤懸浮細胞誘導與取樣

雷公藤懸浮細胞繼代培養，轉接入含0.5 mg·L–12,4-D+0.5 mg·L–1IBA+0.1 mg·L–1KT的MS液體培養基（pH 5.8），在120 r·min–1、25 ℃黑暗培養。于繼代培養12 d后，誘導組加入終濃度為50 μmol·L–1的MeJA，對照組加入等體積溶劑，混勻后繼續培養。分別于處理后0、24、48、72、240、360 h 取樣，各樣品組設置3個重復。

2.2 雷公藤甲素測定

2.2.1 雷公藤甲素提取 雷公藤懸浮細胞新鮮樣品于液氮環境下充分粉碎，冷凍干燥36 h，精密稱定樣品干燥粉末50 mg，置于2 mL 離心管中，精密加入80%甲醇1 mL，在25 ℃超聲提取60 min，功率為100 W，頻率為40 kHz，樣品取出放冷至室溫。6000×g離心10 min，上清液過0.22 μm 聚四氟乙烯（PTFE）微孔濾膜，即得供試品溶液，使用超高效液相色譜法（UPLC）分析[7]。

2.2.2 UPLC檢測條件 使用ACQUITY UPLC? Ⅰ-Class System 連接光電二極管陣列檢測器（PDA）；ACQUITY UPLC HSS T3 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動相為0.1%甲酸水溶液（A）-0.1%甲酸乙腈溶液（B），梯度洗脫（0～5 min，30%～35%B；5～8 min，35%B；8～15 min，35%～70%B；15～21 min，70%～90%B）；流速為0.4 mL·min–1，進樣量為1 μL；柱溫為40 ℃；檢測波長為200～500 nm。

2.3 代謝物分析

以Ultimate 3000 超高效液相色譜儀（含自動進樣器、柱溫箱、在線真空脫氣機、低壓四元梯度泵、PDA 檢測器）和LTD Orbitrap velos pro 質譜儀 [高分辨靜電場軌道肼質譜，電噴霧離子源（ESI）] 進行檢測。色譜條件：Agilent SB-C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，2.7 μm）；柱溫為30 ℃；樣品盤溫度為4 ℃；流動相為0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～65 min，5%～100%B）；流速為0.3 mL·min–1；進樣體積為5 μL。ESI 參數設定：正離子掃描模式；毛細管溫度為350 ℃；毛細管電壓為35 V；噴霧電壓為3.5 kV；鞘氣（N2）流速為40 psi（1 psi≈6.895 kPa）；輔助氣（N2）流速為10 psi。樣品一級質譜在全掃描模式下進行全掃描（分辨率為30 000，掃描范圍為m/z150～1500），數據采集和分析采用Xcalibur ? 2.2 軟件。使用Metaboanalyst 在線代謝組數據綜合分析平臺進行數據分析和處理，經過歸一化、去噪后，將數據轉化成標準的數據矩陣。采用多元統計分析中的偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA）對不同類型的樣品數據進行聚類分析。

2.4 蛋白質組學分析

2.4.1 蛋白質的裂解和定量 取全部樣品，于液氮環境中研缽磨碎成粉末狀，加入5 倍體積的丙酮-三氯乙酸（9∶1），渦旋混勻，在–20 ℃靜置4 h；4 ℃、5000×g離心40 min，棄上清液；加入預冷的丙酮，洗滌3 次，通風櫥中干燥沉淀；取干燥后的粉末，分別加入SDT 裂解液 [含2%十二烷基硫酸鈉、100 mmol·L–1二硫蘇糖醇（DTT）、100 mmol·L–1三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（Tris-HCl）、pH 7.6]500 μL，渦旋振蕩徹底重懸沉淀，在100 ℃沸水煮8 min；超聲破碎提取蛋白質（功率為80 W，工作時間為10 s，間歇時間為15 s，共破碎10 次），在100 ℃煮15 min；13 000×g離心50 min，取上清液，BCA 試劑盒檢測蛋白質含量；分裝并于–80 ℃保存蛋白質樣品。

2.4.2 蛋白質過濾輔助樣品制備（FASP）酶解 每份樣品分別取200 μg，加入DTT（100 mmol·L–1），100 ℃沸水煮8 min，取出后冷卻；加入尿素緩沖液（含8 mol·L–1尿素、150 mmol·L–1Tris-HCl，pH 8.0）200 μL混勻，轉入30 kDa蛋白質超濾管，5000×g離心20 min；加入緩沖液200 μL，13 000×g離心20 min，棄濾液；加入碘乙酸銨（50 mmol·L–1碘乙酸銨溶于前述緩沖液）100 μL，600 r·min–1振蕩1 min，黑暗條件下室溫孵育30 min，13 000×g離心15 min；加入尿素緩沖液100 μL，13 000×g離心15 min，重復2 次；加入碳酸氫銨水溶液100 μL，13 000×g離心10 min，重復2次；加入胰蛋白酶緩沖液（胰蛋白酶4 μg溶于碳酸氫銨水溶液40 μL）40 μL，600 r·min–1振蕩1 min，37 ℃孵育16～18 h。換新收集管，13 000×g離心10 min，收集濾液，C18-SD Extraction Disk Cartridge脫鹽處理，280 nm下測定吸光度（A）。

2.4.3 高效液相色譜-質譜法（HPLC-MS/MS）分析 取酶解產物2 μg進行HPLC-MS/MS分析。采用納升流速HPLC 液相系統連接EASY-nLC1000 分離。色譜柱為Thermo EASY column SC200 RP-C18（100 mm×150 μm，1.8 μm），流動相A 為0.1%甲酸-乙腈水溶液（含乙腈2%），流動相B 為0.1%甲酸-乙腈水溶液（含乙腈84%）。Thermo EASY column SC001 traps（20 mm×150 μm，1.8 μm，RP-C18）上樣，經色譜柱分離，流速為0.4 μL·min–1。梯度洗脫（0～100 min，0～45%B；100～108 min，45%～100%B；108～120 min，100%B）。酶解產物經HPLC分離后，經Q-Exactive 質譜儀分析；120 min，正離子檢測，母離子掃描范圍為m/z300～1800，多肽和多肽碎片的m/z按每次全掃描后采集20 個碎片圖譜[MS2scan，高能碰撞解離（HCD）]，MS1 在m/z200 時分辨率為70 000；MS2 在m/z200 時分辨率為17 500。

2.4.4 Label-free 定量及數據分析 將原始文件導入Maxquant 1.3.0.5 軟件，輸入自建的雷公藤轉錄組數據庫P16208_382410.fasta，各數據庫合并后蛋白質數目為382 410，進行非標定量分析（LFQ）。主要參數設置為主檢索ppm 6；丟失碎片2；MS/MS允許ppm 20；胰蛋白酶；固定修飾類型：脲甲基化；可變修飾：氧化反應；乙酰基；反向誘導數據模式；肽段FDR 0.01；蛋白質FDR 0.01。

2.5 生物信息學分析

生物信息學用于分析差異蛋白質的功能及定位。蛋白質序列經過美國國家生物技術信息中心（NCBI）蛋白質數據庫及雷公藤P16208_382410數據庫比對進行初步分析。基因本體（GO）數據庫（http://www.geneontology.org/page/go-database）和InterProScan數據庫用于進一步的功能注釋。京都基因與基因組百科全書（KEGG）數據庫（http://www.kegg.jp）用于標注蛋白質分布。

2.6 實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）基因表達分析

取MeJA處理后0、24、48、72、240、360 h的樣品，RNA提取方法參照試劑盒說明書，第一鏈cDNA反轉錄參照FastKing RT Kit（With gDNase）說明書。依據KAPA SYBR?FAST Universal 2×qPCR Master Mix，使用qRT-PCR 儀進行檢測。反應體系包括2×Fast qPCR Master Mix 10 μL、10 μmol·L–1正向引物（F）0.4 μL、10 μmol·L–1反向引物（R）0.4 μL、cDNA 1.0 μL，無菌水補足至20 μL。反應程序為95 ℃ 3 min；95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，40 個循環。以β-actin作為管家基因，采用2–ΔΔCt法分析結果。引物設計見表1。

表1 MeJA處理后不同時間雷公藤細胞樣品qRT-PCR分析引物

2.7 基因的體內功能研究

2.7.1 目的基因全長的克隆 根據轉錄組數據設計引物，cDNA 擴增得到目的序列全長，引物見表2，反應體系為Phusion Mix（2×）25 μL、正向引物（10 μmol·L–1）2.5 μL，反向引物（10 μmol·L–1）2.5 μL，質粒模板1 μL，加入無菌水至50 μL。使用Veriti? 96 孔PCR 儀進行反應，反應程序為98 ℃30 s；98 ℃ 10 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 15 s，35 個循環；72 ℃ 7 min。DNA 片段連接Blunt-zero 克隆載體，轉化E.coliTrans1-T1感受態細胞，經單克隆陽性PCR及測序驗證，獲得目的基因全長。

表2 雷公藤細胞中目的基因克隆引物

2.7.2 干擾表達載體的構建 根據相應基因序列，設計擴增400～500 bp特異性片段的引物，引物見表3。采用Gateway 方法構建干擾表達載體，分為入門載體構建和表達載體構建。

入門載體構建：PCR 擴增目的片段，純化產物2 μL、pENTR ? SD/D-TOPO?vector 0.5 μL、salt solution 0.5 μL 混勻，22 ℃反應2.5 h，轉化E.coli Trans1-T1 感受態細胞，以帶卡那霉素抗性的固體平板篩選，單菌落使用M13 正、反向引物（表3）進行陽性克隆驗證并測序，獲得帶有目的片段的入門載體。

表達載體構建：入門載體300 ng、表達載體pK7GWIWG2D 300 ng、TE Buffer（pH 8.0）0.6 μL、Gateway?LR Clonase Enzyme Mix 1 μL 配制反應體系，25 ℃反應4 h，轉化E.coliTrans1-T1 感受態細胞，以含100 mg·L–1壯觀霉素抗性的固體平板篩選后，單菌落使用pK7正向引物（表3）、相應序列反向引物進行陽性克隆驗證并測序，獲得帶有目的片段的干擾表達載體。使用Plasmid Maxi Kit（OMEGA）進行高濃度的質粒提取。

2.7.3 雷公藤懸浮細胞預培養及轉化 雷公藤懸浮細胞200 mg 轉繼代到MS 固體培養基，25 ℃避光預培養7 d后使用基因槍分別將含有目的基因（TwTF1、TwTF2、CYP82AQ2、CYP71BE89和Tw2ODD）的質粒轉化懸浮細胞[12]。轉化空載體pK7GWIWG2D 及未轉化質粒的懸浮細胞（WT）作為對照組，每組設置5個重復。

2.7.4 表達載體轉化驗證、基因表達分析及雷公藤甲素含量檢測 轉化細胞繼續暗培養1 周后，提取懸浮細胞樣品總RNA 并反轉錄成cDNA。使用Kanamycin 的正反引物（表3）進行克隆，通過PCR擴增后電泳檢測是否含有1397 bp卡那霉素片段，驗證表達載體是否成功轉入懸浮細胞。檢測干擾基因表達水平，方法同2.6 項下。雷公藤甲素提取與檢測方法同2.2項下。

3 結果與分析

3.1 懸浮細胞響應MeJA誘導積累雷公藤甲素

為了觀察MeJA 對植物懸浮細胞中雷公藤甲素積累的影響，使用50 μmol·L–1MeJA 處理后，檢測0～360 h樣品中雷公藤甲素含量，同時使用未處理的懸浮細胞作為對照組。在最初的48 h 內，雷公藤甲素的含量幾乎沒有變化，對照組和MeJA 處理組間差異無統計學意義。誘導后48 h，雷公藤甲素含量逐漸增加，并且MeJA 處理組增加幅度更明顯，至240、360 h，MeJA 處理組較對照組雷公藤甲素含量分別提升了2.96、4.23 倍（圖1）。這進一步證實了MeJA 能促進雷公藤懸浮細胞中雷公藤甲素的生物合成。

圖1 MeJA誘導雷公藤懸浮細胞中雷公藤甲素質量分數積累曲線（±s,n=3）

3.2 蛋白質組學樣品篩選及數據分析

采用無標記比較蛋白質組學技術檢測雷公藤甲素相關的蛋白質受MeJA 誘導后的變化情況。在對樣品進行蛋白質組測序之前，采用高分辨率質譜法檢測雷公藤懸浮細胞中的化學成分，并采用OPLSDA 對樣品的所有峰值進行化學計量分析。經MeJA處理48、240 h的6個樣品（分別標記為MJ48-1～MJ48-3和MJ240-1～MJ240-3）差異最大。其中，69.9%的化學成分可用于明確區分2組樣品（圖2）。根據雷公藤甲素累積曲線和OPLS-DA 結果，選擇MJ48 組和MJ240組樣品進行無標記定量并比較差異蛋白質。

圖2 MeJA誘導雷公藤懸浮細胞樣品OPLS-DA

3.3 比較蛋白質組數據分析

蛋白質組數據中MJ48 和MJ240 2 組分別檢測到15 812、15 698 個特異肽段，分別注釋到2608、2562 個蛋白質（在線數據庫ID：IPX000154000）。其中，142 個蛋白質為MJ48 特有，96 個蛋白質為MJ240特有。在2組共有的2466個蛋白質中，138個蛋白質差異有統計學意義（ratio<0.5 或>2.0，P<0.05）。與MJ48相比，64個蛋白質在誘導后240 h表現為豐度增加，74個蛋白質表現為豐度降低（圖3）。

圖3 MeJA處理后不同時間的雷公藤細胞蛋白組數據及差異蛋白聚類分析

3.4 差異蛋白質功能分析

對檢測到的376 個差異蛋白質進行GO 功能分析，可依據生物過程（BP）、分子功能（MF）和細胞組分（CC）進行分類。以GO2為分類標準，三大類又可進一步分為13、5 和6 小類。在BP 的各項分布中，代謝過程和細胞過程占比較大，分別占總數的40%、29%和8%。MF 分類中占比依次為催化活動（54%）、聯結（35%）和結構分子活性（7%）。而在376 個差異蛋白質中，141 個蛋白質定位于細胞（46%）、91 個蛋白定位于細胞器（30%）、36 個蛋白質屬于高分子復合物（12%）。

對功能分類中不同表達模式的蛋白質進行進一步分析。依據MJ48 和MJ240 蛋白質豐度變化規律，以不同顏色表示不同表達模式蛋白質，繪制蛋白質表達模式圖，見圖4A。依據蛋白質表達情況，分為蛋白質豐度上調組、豐度下調組、僅MJ48表達組和僅MJ240表達組。以蛋白質豐度表達模式繪制各功能占比，見圖4B。圖4B顯示，與雷公藤甲素生物合成相關的功能以蛋白質豐度下調（紫色）和僅MJ48表達（藍色）標注的蛋白質數量占比較大，以代謝過程相關的蛋白質為例，蛋白質豐度下調或MJ48特有的蛋白質數量占該功能蛋白質總數的58%，后期需要重點關注。同時，差異蛋白質參與催化活動和代謝過程的蛋白質數量較多，表明MJ48 和MJ240 2 組間可能存在不同的代謝活動，從而影響代謝物的產生。

圖4 MeJA處理后不同時間的雷公藤細胞差異蛋白質的生物信息學分析

3.5 差異蛋白質的代謝途徑分析

KEGG通路分析結果表明，376個差異蛋白質共參與118 個代謝途徑。圖4C 根據蛋白質數量從高到低列舉了20 個與二萜生物合成途徑相關的初生及次生代謝途徑，涉及二萜、倍半萜、三萜以及萜類骨架生物合成通路。

萜類骨架生物合成途徑檢測到8 個萜類骨架蛋白質，其中，植物1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶（DXS）和3-羥基3-甲基戊二酰輔酶A 還原酶（HMGR）僅出現在MJ48 組，2-C-甲基-D-赤蘚醇-4-磷酸胱氨酰轉移酶（MCT）和牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合酶（GGPS）僅在MJ240 組。另外4 個蛋白質4-羥基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸還原酶（HDR）、3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合酶（HMGS）、4-羥基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸合酶（HDS）和1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸鹽還原異構酶（DXR）出現在下調組，蛋白質豐度分別降低至MJ48 的0.18、0.24、0.49、0.19倍。上述8 個萜類骨架蛋白質均參與萜類生物合成上游MVA 或MEP 途徑，生成萜類中間體IPP 和DMAPP用于繼續萜類的下游生物合成途徑。

3.6 差異基因轉錄表達分析

為了驗證蛋白質組數據的真實性，利用qRTPCR檢測了上述8種萜類骨架酶編碼基因在MeJA 誘導后的轉錄表達情況。表達模式可分為2 類，表達上調和表達差異無統計學意義（圖5）。大多數基因歸為上調組：TwDXR、TwDXS、TwHMGS、TwHDS、TwGGPS、TwHDR、TwMCT。其中，TwDXR、TwDXS、TwHMGS、TwHDS和TwGGPS在誘導后48 h 表達量出現單峰，TwHDR在誘導后24 h 出現單峰，TwMCT在24 和240 h 有2 個高峰。而TwHMGR表達量差異無統計學意義。Liu 等[13]經檢測發現TwHMGR的表達高峰出現在誘導后4 h，并且誘導后12 h 恢復至正常水平。這些結果與相應的蛋白質豐度高度一致，表明蛋白質組學數據質量較高，有助于探索參與雷公藤甲素生物合成的潛在蛋白質。

圖5 MeJA誘導的萜類骨架基因相對表達水平（±s,n=3）

本研究檢測到了8 個細胞色素P450（CYPs）、3個轉錄因子（TFs）和2-氧戊二酸依賴的雙加氧酶（2ODD），對其編碼基因受MeJA 誘導后轉錄水平的表達進行檢測，見圖6。依據MeJA 組和對照組表達量，表達模式分為3類。第1類7個基因MeJA誘導后表達量高于對照組，包括4 個CYPs（CYP82AQ2、CYP71BE89、TwCYP-3和TwCYP-4）、2個TFs（TwTF1和TwTF2）和Tw2ODD。第2 類MeJA 處理組表達量低于對照組，包含2個CYPs（TwCYP-5和TwCYP-6）、1 個TF（TwTF3）。剩下的2 個CYPs（TwCYP-1 和TwCYP-2）在兩組間差異無統計學意義。結合前期生物信息學分析結果，認為第1類基因為后期實驗重點研究對象。以上20個基因編碼的蛋白質在比較蛋白質組中的信息見表4、表5。

圖6 MeJA誘導的基因相對表達水平（±s,n=3）

表4 MJ48和MJ240中均表達的蛋白質信息

表5 僅MJ48或MJ240組中蛋白質信息

3.7 候選基因植物體內功能表征

為了研究基因功能，選擇了與雷公藤甲素生物合成二萜合酶基因TwTPS7v2、TwTPS9v2和TwTPS27v2表達模式（圖6C）一致的基因作為候選基因，均表現為MeJA 誘導早期基因表達上調[7]，通過植物體內功能表征觀察其對雷公藤甲素生物合成的影響。克隆獲得了長度為590 bp的TwTF1、1640 bp的TwTF2、1734 bp 的CYP82AQ2、1620 bp 的CYP71BE89和1255 bp 的Tw2ODD。使用Gateway 分別構建含目的基因特異性片段TwTF1（460 bp）、TwTF2（477 bp）、CYP82AQ2（453 bp）、CYP71BE89（491 bp）、Tw2ODD（503 bp）的RNAi 載體，基因槍介導轉化雷公藤懸浮細胞。各轉化組樣品中均檢測到1397 bp的載體片段，而未轉化質粒的對照組相應位置無條帶（圖7A），驗證了基因成功轉入到懸浮細胞中。

基因干擾后，CYP82AQ2-RNAi組、CYP71BE89-RNAi 組、Tw2ODD-RNAi 組基因表達量較WT 組和空載組有明顯抑制（P<0.05，P<0.01），抑制率分別為33.4%、28.5%和77.9%；TwTF1-RNAi 組、TwTF2-RNAi組與對照組差異無統計學意義，見圖7B。同時，各組基因干擾后雷公藤甲素的含量表現不同程度降低。WT 組、pK7GWIWG2D 組、TwTF1-RNAi 組、TwTF2-RNAi組、CYP82AQ2-RNAi組、CYP71BE89-RNAi和Tw2ODD-RNAi組雷公藤甲素質量分數分別為（42.3±2.9）、（38.6±1.9）、（32.9±3.1）、（37.5±12.8）、（24.8±4.3）、（32.1±1.4）、（12.1±3.0）μg·g–1。與WT 和pK7GWIWG2D 對照相比，CYP82AQ2-RNAi、CYP71BE89-RNAi和Tw2ODD-RNAi組中雷公藤甲素含量差異有統計學意義（P<0.01），抑制率分別為41.4%、24.1%和71.4%；TwTF1-RNAi 和TwTF2-RNAi 差異無統計學意義（圖7C）。由此說明，CYP82AQ2、CYP71BE89和Tw2ODD的 轉錄表達 下調，直接抑制了雷公藤甲素的積累，表明這3 條基因與雷公藤甲素生物合成具有直接相關性。

4 討論

雷公藤甲素是雷公藤的主要活性成分之一，其能夠與著色性干皮病B（XPB，一種TFIIH亞族）結合從而抑制ATPase的活性[14]，并促使RNAPⅡCDK7退化發揮抗腫瘤的作用[15]，隨著藥理作用的不斷發現而受到越來越多的關注[2]。針對雷公藤甲素生物合成途徑仍未知的問題，本研究借助比較蛋白質組學尋找雷公藤甲素生物合成相關的蛋白質。

蛋白質作為基因功能的執行者，參與多種生命活動，而單純從基因和mRNA層面無法解釋其復雜的翻譯后修飾、蛋白質間相互作用等過程。因此直接從蛋白質層面研究蛋白質組學受到越來越多的關注。蛋白質組的出現使研究轉向mRNA和蛋白質豐度，研究不同的基因表達如何調節蛋白質功能[16]。由于需要一系列的過程產生和維持細胞功能，包括生成轉錄組、加工和降解mRNA、翻譯、定位、修飾和凋亡自身蛋白質，可以用蛋白質豐度反映這些過程的動態平衡。蛋白質組學為蛋白質豐度的研究提供了可能，這種蛋白質層面的研究可以說明不同方面的基因表達如何調節細胞蛋白質豐度。現有數據證實，mRNA生成之后的后轉錄、翻譯和蛋白質降解調節都是為了保證蛋白質豐度的穩定狀態[16]。本研究利用比較蛋白質組學研究重在找出有意義的差異蛋白質，因而具有更好的可實現性。

MeJA是植物中的一種重要物質，其可以擴散到植物的其他部位，影響植物的系統信號傳導，激活參與次生代謝的基因表達，增加萜類、類黃酮和生物堿的含量[17]。Miller 等[18]使用MeJA 處理云杉并持續4 d 監測萜類揮發物，發現萜類化合物在處理后45 h 顯著增加。本研究比較分析了MeJA 誘導48、240 h的雷公藤懸浮細胞蛋白質組學數據，結果表明MeJA可以促進萜類化合物的積累和基因表達，并在MeJA 誘導下的雷公藤甲素積累曲線中得到了證實（圖1）。借助生物信息學，從376個差異蛋白質中初步篩選出了20 個可能與雷公藤甲素生物合成有關的蛋白質。進一步的轉錄表達分析和植物細胞體內RNAi 結果聚焦于3 個蛋白質（1 個Tw2ODD 和2 個CYPs）。基因表達與雷公藤甲素在植物不同組織中的積累規律一致，也表明CYP71BE89、CYP82AQ2和Tw2ODD與雷公藤甲素生物合成的相關性。

CYP71BE89 屬于CYP71BE 亞家族，文獻報道雷公藤基因組中可能存在CYP71BE家族基因擴張[9]，同時，CYP71BE85 和CYP71BE86 被報道參與同構型松香烷型二萜雷公藤內酯酮的生物合成。此外，該亞家族中部分CYP 的功能在其他物種已被鑒定。CYP71BE5 作為α-愈創木烯-2-氧化酶，能氧化α-愈創木烯（倍半萜烯烴）的C-2 位生成化合物 (–)-莎草奧酮[19]。CYP71BE52在丹參中催化鐵銹醇C-2α位氧化為鼠尾草酚[20]。CYP71BE54促進 (–)-脫氧鬼臼毒素的去甲基化，形成 (–)-4′-去甲基脫氧鬼臼毒素[21]。CYP82AQ2 比CYP82 家族中的其他蛋白質更接近CYP82A 和CYP82D 亞家族，是CYP82AQ 亞家族中的第二個酶，有待進一步的探究。而Tw2ODD是本課題組此前報道的赤霉素13 位氧化酶[22]，可催化活性赤霉素相互轉化，從蛋白質互作和生理水平影響雷公藤甲素的生物合成。

因此，本研究利用蛋白質組學技術研究了受MeJA 誘導的雷公藤懸浮細胞中蛋白質的變化情況，利用萜類骨架基因驗證了數據的準確性，并揭示了后期可用于進一步基因功能表征的候選基因。

[利益沖突]本文不存在任何利益沖突。