白木香內(nèi)生真菌的分離鑒定及誘導(dǎo)結(jié)香作用研究△

黃穎，何欣，李浩凌，孟慧，陳旭玉，魏建和，陳德力，王斌，楊云*

1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所 中草藥物質(zhì)基礎(chǔ)與資源利用教育部重點實驗室/瀕危藥材繁育國家工程實驗室，北京 100193；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所 海南分所 海南省南藥資源保護與開發(fā)重點實驗室/國家中醫(yī)藥管理局沉香可持續(xù)利用重點研究室，海南 海口 570311

白木香Aquilaria sinensis(Lour.) Gilg 又稱土沉香、牙香樹，是瑞香科（Thymelaeaceae）沉香屬（Aquilaria）珍貴藥用植物，主要分布于海南、廣東、廣西等地[1]。白木香是國產(chǎn)藥用沉香的唯一基原植物，其木質(zhì)部中所含黑色樹脂稱為沉香[2-3]。沉香具行氣止痛、溫中止嘔、納氣平喘功效，現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明其具有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗菌、抗炎、改善心肌缺血、抗腫瘤等作用[4]。白木香不會在自然狀態(tài)下結(jié)香，只有樹木受到自然損傷或人為傷害后，才會在傷口處累積樹脂，經(jīng)過數(shù)十年沉積才能形成沉香[5]。由于沉香資源再生困難且被過度開發(fā)，沉香屬和擬沉香屬的全部植物均被納入《瀕危野生動植物種國際貿(mào)易公約》（CITES）附錄Ⅱ[6]。沉香稀有且價格高昂，在市場上長期處于供不應(yīng)求的狀態(tài)，故其結(jié)香技術(shù)被廣泛關(guān)注。本課題組在2010 年發(fā)明了通體結(jié)香技術(shù)：通過植物自身的蒸騰作用將安全的結(jié)香液輸送至植物各部位，促使整株白木香樹內(nèi)部結(jié)香[7]。該技術(shù)突破了白木香樹規(guī)模化產(chǎn)沉香的技術(shù)瓶頸，但單株產(chǎn)量和品質(zhì)有待進一步提升。

許多學(xué)者認(rèn)為微生物在沉香形成過程中發(fā)揮著重要作用，已有文獻報道內(nèi)生真菌能夠有效促進白木香結(jié)香。例如，Cui 等[8]證明野生沉香中分離出的Paraconiothyrium variabile可誘導(dǎo)白木香結(jié)香，結(jié)香品質(zhì)與天然沉香相似；Chen 等[9]篩選出2株具有良好誘導(dǎo)效果的可可色二孢菌Lasiodiplodia theobromae，2 個月即可誘導(dǎo)白木香結(jié)香；Zhang等[10]發(fā)現(xiàn)，尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum可快速誘導(dǎo)生成優(yōu)質(zhì)沉香。然而，實際生產(chǎn)中仍以物理方法（如砍傷等）和化學(xué)誘導(dǎo)法為主，真菌結(jié)香方式并未廣泛應(yīng)用。為了獲得能夠高效促進白木香產(chǎn)生優(yōu)質(zhì)沉香的菌株，本研究以經(jīng)通體結(jié)香技術(shù)誘導(dǎo)的白木香為研究對象，對木質(zhì)部結(jié)香部位附近的內(nèi)生真菌進行分離和初步鑒定，并進一步研究這些真菌誘導(dǎo)白木香結(jié)香的效果，為應(yīng)用真菌綜合開發(fā)沉香資源提供參考。

1 材料

1.1 樣品

白木香木質(zhì)部樣品于2022 年5 月采自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所海南分所海口研發(fā)中心試驗田，樣品來源于3 年生白木香樹，經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所海南分所楊云研究員鑒定為白木香Aquilaria sinensis(Lour.) Gilg。憑證標(biāo)本保存于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所海南分所海南省中藥材標(biāo)本館。

1.2 儀器

SW-CJ-2D型超凈工作臺（上海滬凈醫(yī)療器械有限公司）；GR60DA 型全自動立式高壓滅菌鍋[致微（廈門）儀器有限公司]；SPX-70B 型生化培養(yǎng)箱（北京科偉永興儀器有限公司）；ZWY-2012C 型立式雙層恒溫?fù)u床（常州易晨儀器制造有限公司）；Z216MK 型臺式小型高速冷凍離心機[賀默（上海）儀器科技有限公司]；ECLIPSE80i 型生物顯微鏡（日本尼康株式會社）；HH-6型電熱恒溫水浴鍋（江蘇科技儀器有限公司）；2695/2475 型高效液相色譜儀[沃特世科技（上海）有限公司]；AL104-IC 型電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；SB25-12DTDN 型超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；DHG-9070A 型恒溫電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海恒科學(xué)儀器有限公司）。

1.3 試藥

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基（批號：HB0233，青島海博生物科技有限公司）；沉香四醇對照品（批號：111980-201904，純度：98.6%）、沉香對照藥材（批號：121222-201203）均購自中國食品藥品檢定研究院；真菌基因組DNA 提取試劑盒（美國Omega Biotek 公司）；2×Taq聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）Mastermix[天根生化科技（北京）有限公司]；GF254薄層色譜板（批號：HX17444229，德國Merck公司）；色譜純乙腈、甲酸（賽默飛世爾科技中國有限公司）；蒸餾水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司）；其余試劑均為分析純。

2 方法

2.1 真菌的分離和鑒定

2.1.1 分離 以通體結(jié)香技術(shù)處理的白木香為實驗材料，取木質(zhì)部樹脂部分和未結(jié)香部分，采用傳統(tǒng)組織分離法進行真菌分離。以75%乙醇和10%次氯酸鈉為消毒劑進行表面滅菌，用無菌水洗凈表面殘留消毒劑后以無菌濾紙吸干水分，用無菌手術(shù)刀將樹脂部分和未結(jié)香部分切成小塊，接種至含50 mg·L–1氨芐青霉素的PDA 培養(yǎng)基中，密封，28 ℃培養(yǎng)3～5 d，菌絲長出后采用菌絲尖端挑取法反復(fù)純化至得到單菌落。

2.1.2 鑒定

2.1.2.1 形態(tài)特征 將純化的菌株接種于PDA 平板上，28 ℃培養(yǎng)3～7 d，觀察菌落大小、顏色、菌絲長短、菌落邊緣形態(tài)等，進行初步形態(tài)學(xué)分類鑒定。

2.1.2.2 內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）序列分析 使用真菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株的總DNA。以通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）擴增真菌ITS片段。擴增體系為由模板（基因組DNA 20～50 ng·μL–1）2 μL、2×TaqPCR Mastermix 25 μL、引物（10 mol·L–1）各2 μL 和滅菌ddH2O 19 μL。擴增程序為94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共30 個循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min。PCR 擴增產(chǎn)物送至上海生工生物有限公司測序，測序結(jié)果與美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）核苷酸序列數(shù)據(jù)庫（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）進行比對，確定菌株的種屬分類。

2.2 接種與樣品前處理

純化后的真菌于PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d，將菌塊接種至馬鈴薯葡萄糖水（PDB）培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r·min–1培養(yǎng)7 d，以無菌紗布濾過得到濾液。選取3年生健康白木香，在離地30 cm 處由下至上每隔20 cm鉆1個孔，將濾液注入孔中，以無菌木條封口；注入PDB作為對照（PDB組）。每個處理重復(fù)3次。

白木香接種4 個月后剖去接種處樹皮與外層木質(zhì)部，測量每個接種處樹脂的延伸長度，用鏟刀取下整塊樹脂部分，陰干。將未結(jié)香部分剔除，剩余樹脂部分打粉后過二號篩和三號篩，備用。

2.3 薄層鑒別

稱取混合均勻的沉香樣品粉末（過二號篩）0.5 g，乙醚30 mL提取，超聲振蕩1 h，濾過，蒸干濾液，殘渣加三氯甲烷2 mL 溶解，作為供試品溶液。另取沉香對照藥材0.5 g，同法制成對照藥材溶液。吸取上述溶液各10 μL，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，在三氯甲烷-乙醚（10∶1）條件下展開，取出后晾干，置紫外燈（365 nm）下檢視。

2.4 浸出物含量測定

沉香粉碎樣品2 g，置100 mL 錐形瓶中，精密加入95%乙醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，靜置1 h。連接冷凝管，加熱回流1 h。取下錐形瓶，密塞，放冷至室溫，稱定質(zhì)量，95%乙醇補足減失的質(zhì)量。干燥濾器濾過，精密量取濾液25 mL，置干燥且恒重的蒸發(fā)皿中水浴蒸干，105 ℃干燥3 h，干燥器中冷卻30 min 后，迅速精密稱定質(zhì)量，以干燥品計算供試品中醇溶性浸出物含量。每個樣品重復(fù)3次。

2.5 特征圖譜分析和沉香四醇含量測定

按照《中國藥典》2020 年版[2]方法進行特征圖譜分析和沉香四醇含量測定。

3 結(jié)果

3.1 內(nèi)生真菌的分離與鑒定

從白木香中共分離得到48 株內(nèi)生真菌，其中31株來自樹脂部分、17 株來自未結(jié)香部分。菌株形態(tài)特征和分子生物學(xué)初步鑒定結(jié)果見表1。部分菌株的菌落及顯微照片見圖1。

表1 白木香內(nèi)生真菌的形態(tài)特征及分子生物學(xué)初步鑒定結(jié)果

48 株內(nèi)生真菌分別為鐮刀菌17 株，占35.42%；可可色二孢菌12 株，占25.00%；木霉屬13 株，占27.08%；枝孢屬2 株，占4.17%；曲霉屬2 株，占4.17%；刺盤孢菌屬1 株，占2.08%；硬孔菌1 株，占2.08%。鐮刀菌是白木香的優(yōu)勢真菌，木霉屬和可可色二孢菌次之。

3.2 真菌的結(jié)香效果

選取不同種屬的10 株內(nèi)生真菌，經(jīng)液體培養(yǎng)后濾過，取菌液進行野外結(jié)香試驗，4 個月后削去接種孔附近樹皮與外層木質(zhì)部。如表2 所示，內(nèi)生真菌促進白木香產(chǎn)生的樹脂與PDB 組比較，結(jié)香長度更長、樹脂顏色更深，說明真菌在誘導(dǎo)白木香結(jié)香方面具有一定效果。在接種孔附近，內(nèi)生真菌處理組均觀察到褐色或棕黑色樹脂與黃白色木部相間的斑紋，并呈現(xiàn)出從接種孔向上、向下延伸結(jié)香的趨勢（圖2）。

圖2 不同內(nèi)生真菌促進白木香結(jié)香4個月的效果

表2 不同內(nèi)生真菌處理的沉香樣品信息

3.3 沉香的薄層色譜

內(nèi)生真菌誘導(dǎo)所得樹脂粉末的薄層色譜鑒別結(jié)果見圖3。樣品T6、T7、T9 與《中國藥典》2020年版規(guī)定沉香藥材的熒光斑點基本一致，其他樣品與對照藥材比較，缺少部分熒光斑點。結(jié)果表明，刺盤孢菌屬、黑曲霉和漸進綠木霉處理得到的樹脂符合《中國藥典》2020 年版標(biāo)準(zhǔn)。

3.4 沉香的浸出物含量

內(nèi)生真菌誘導(dǎo)所結(jié)沉香的浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)見圖4，T1（5.76%）、T2（8.68%）、T3（11.76%）、T4（8.83%）、T5（7.79%）、T7（10.16%）、T9（11.40%）與PDB組（6.42%）比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），表明內(nèi)生真菌在促進結(jié)香方面有明顯作用。其中，T3 誘導(dǎo)4 個月所結(jié)沉香的浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，T9 和T7 次之，三者浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于10%，符合《中國藥典》2020年版標(biāo)準(zhǔn)。

3.5 沉香四醇含量測定

內(nèi)生真菌誘導(dǎo)所結(jié)沉香的沉香四醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)見圖5，T2（0.036%）、T3（0.070%）、T4（0.142%）、T5（0.078%）、T6（0.168%）、T7（0.124%）、T8（0.160%）、T9（0.141%）、T10（0.356%）與PDB組（0.020%）比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），結(jié)果表明，內(nèi)生真菌在促進沉香四醇積累方面發(fā)揮作用。其中，T10 的沉香四醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為PDB 組的17.8 倍，顯著高于對照組（P<0.000 1）。T4、T6、T7、T8、T9、T10的沉香四醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于0.1%，符合《中國藥典》2020年版標(biāo)準(zhǔn)。

圖5 內(nèi)生真菌誘導(dǎo)所結(jié)沉香的沉香四醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)（±s,n=3）

3.6 特征圖譜分析

內(nèi)生真菌誘導(dǎo)所產(chǎn)沉香特征圖譜見圖6，T4、T6～T10 和對照藥材的特征圖譜均有6 個特征峰，與《中國藥典》2020年版沉香特征圖譜的6個特征峰相對應(yīng)，符合《中國藥典》2020 年版標(biāo)準(zhǔn)。T1～T3、T5、PDB組與對照藥材比較，缺少部分特征峰。

圖6 內(nèi)生真菌誘導(dǎo)所產(chǎn)沉香的特征圖譜

4 討論

白木香在自然條件下幾乎不產(chǎn)生沉香，受到傷害后形成沉香的過程也十分緩慢。為保證沉香的可持續(xù)供應(yīng)，研究人員發(fā)明了物理傷害、化學(xué)誘導(dǎo)和真菌誘導(dǎo)等方法[11]，其中真菌誘導(dǎo)法因誘導(dǎo)時間短、效果好、安全環(huán)保受到持續(xù)關(guān)注。真菌誘導(dǎo)法多以白木香內(nèi)生真菌為材料，在白木香莖部注入菌液或填入菌絲，內(nèi)生真菌侵染木質(zhì)部促進沉香形成。內(nèi)生真菌在植物中普遍存在，在影響宿主次生代謝等方面發(fā)揮重要作用[12-13]。目前，在多種藥用植物中發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌可提高次生代謝物產(chǎn)量。孫思勝等[14]篩選出鐮孢屬真菌、擬莖點霉屬真菌Phomopsissp.、Pleosporalessp.等6 株真菌，可以在2 個月內(nèi)誘導(dǎo)降香檀產(chǎn)生黃酮類化合物和醇溶性浸出物。曾旭等[15]發(fā)現(xiàn)，赤霉屬真菌誘導(dǎo)龍血樹產(chǎn)生的血竭與血竭對照藥材的指紋圖譜相似度可達0.990，并檢測出7,4′-二羥基黃酮、龍血素A、白藜蘆醇等特征性化學(xué)成分。Chen 等[16]發(fā)現(xiàn)，硬孔菌可有效促進白木香產(chǎn)生沉香，其誘導(dǎo)的沉香精油中倍半萜類化合物相對含量為22.76%。

本研究對白木香木質(zhì)部內(nèi)生真菌進行分離、鑒定，得到48 株菌落形態(tài)有差異的真菌，樹脂部分分離的菌株多于未結(jié)香部分，與王磊等[17]的研究結(jié)果相似。選取不同種屬的10 株內(nèi)生真菌進行野外結(jié)香試驗，4 個月后采集樹脂部分，按《中國藥典》2020 年版沉香項下薄層鑒別、浸出物含量測定、沉香四醇含量測定和特征圖譜要求進行綜合分析，結(jié)果表明，真菌在結(jié)香過程中起到明顯的作用。其中，黑曲霉和漸進綠木霉能產(chǎn)生較高品質(zhì)沉香，檢測結(jié)果均符合《中國藥典》2020 年版標(biāo)準(zhǔn)。王東光等[18]對20 株白木香內(nèi)生真菌進行結(jié)香效果評價，發(fā)現(xiàn)其中7 株結(jié)香10 個月產(chǎn)沉香的浸出物含量符合《中國藥典》2020年版要求，本研究中部分菌株誘導(dǎo)4個月即可達要求。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，不同菌株誘導(dǎo)所得沉香的浸出物和沉香四醇含量、薄層色譜斑點和特征圖譜有差異。導(dǎo)致這一現(xiàn)象的原因可能是誘導(dǎo)時間短，部分菌株促進效果未能完全體現(xiàn)；也可能是不同真菌的誘導(dǎo)效果不同，推測不同菌株在白木香結(jié)香過程中所起的作用不同，作用機制存在差異。

沉香主要成分為倍半萜類和色酮類化合物。部分學(xué)者認(rèn)為，內(nèi)生真菌可調(diào)節(jié)沉香樹內(nèi)茉莉酸、水楊酸等植物激素水平，誘導(dǎo)倍半萜合酶基因表達，從而促進倍半萜類和色酮類化合物合成[19-20]；也有學(xué)者認(rèn)為，在真菌體內(nèi)酶的作用下，白木香木質(zhì)部中薄壁細(xì)胞貯存的淀粉粒轉(zhuǎn)化為可溶性糖，經(jīng)一系列生物轉(zhuǎn)化，最終形成香脂，經(jīng)多年沉積形成沉香[21]。黑曲霉是曲霉屬真菌中常見的絲狀真菌，可分泌纖維素酶、羥化酶和還原酶等多種酶，具有轉(zhuǎn)化倍半萜類、黃酮類等化合物的能力[22-24]。漸進綠木霉是木霉屬真菌，木霉是多種酶類的重要來源，具有誘導(dǎo)植物防御反應(yīng)的能力[25]。黑曲霉及漸進綠木霉誘導(dǎo)沉香形成的機制可能與酶促進生物轉(zhuǎn)化或激發(fā)植物產(chǎn)生防御反應(yīng)有關(guān)，還需進一步開展菌液代謝物成分、接種后白木香植物激素、酶類及沉香特征性成分的含量變化研究，以揭示真菌促進白木香產(chǎn)生沉香的作用機制。

本研究報道黑曲霉和漸進綠木霉可促進白木香在短時間內(nèi)產(chǎn)生符合《中國藥典》2020 年版要求的沉香。在取樣后繼續(xù)觀察，發(fā)現(xiàn)接種孔洞附近沉香仍持續(xù)增多，有四周擴散的趨勢，可見黑曲霉和漸進綠木霉有持續(xù)生產(chǎn)沉香的潛力，具有良好的應(yīng)用前景，為短時間內(nèi)可持續(xù)生產(chǎn)沉香藥材提供菌種資源，有望在沉香生產(chǎn)上得到推廣應(yīng)用。為保證實際生產(chǎn)的產(chǎn)量和品質(zhì)，下一步可優(yōu)化黑曲霉和漸進綠木霉的培養(yǎng)條件和接種方式，進行中試放大研究，為規(guī)模化應(yīng)用提供支撐。

[利益沖突]本文不存在任何利益沖突。