基于HPLC指紋圖譜的葶藶大棗瀉肺湯相關評價△

馬云，關永霞，王艷，嚴琴琴，周冰，申鳳霞，李倩，聶宗恒，范建偉*，趙利枝*

1.魯南制藥集團股份有限公司 經方與現代中藥融合創新全國重點實驗室，山東 臨沂 276006；2.魯南厚普制藥有限公司 中藥制藥共性技術山東省工程研究中心，山東 臨沂 276006；3.臨沂大學，山東 臨沂 276000

葶藶大棗瀉肺湯源自張仲景所著的《金匱要略》[1]，由葶藶子、大棗2 味中藥組成。方中葶藶子為主藥，行瀉肺逐水、化痰平喘之功效[2]；大棗予以佐之，和中扶正、緩和藥力，乃瀉肺而不傷脾之法[3]。葶藶大棗瀉肺湯主治痰涎壅盛、咳喘胸滿不得臥、心悸、苔膩、脈弦滑等[4]。目前，葶藶大棗瀉肺湯的相關研究更多集中在臨床應用上，其有較高的臨床應用價值。例如，葶藶大棗瀉肺湯及其加減方劑可有效改善患者心力衰竭問題，提高患者生存質量[5]；葶藶大棗瀉肺湯加味治療支氣管哮喘，顯著改善了患者肺功能水平與日間、夜間哮喘癥狀，在肺癌、心肌纖維化治療中具有獨特的效果[6-8]。目前未見葶藶大棗瀉肺湯相關質量標準研究。葶藶大棗瀉肺湯是中藥復方制劑，化學成分復雜，開展其相關質量標準研究對經典方劑的臨床推廣與合理用藥具有重要意義[9]。指紋圖譜技術的應用和推廣可實現對中藥制劑物質基礎、化學成分的整體性和復雜性的客觀評價[10]。本研究對葶藶大棗瀉肺湯的高效液相色譜法（HPLC）指紋圖譜進行研究，明確葶藶大棗瀉肺湯中的指標成分，可為其質量標準的確立提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1260 型高效液相色譜儀（Agilent 公司）；XS204/XSR204A 型十萬分之一電子天平（梅特勒-托利多公司）；KS-5200DE型數控超聲波清洗器（昆山潔力美超聲儀器有限公司）；Medifuge型高速離心機（賽默飛世爾科技有限公司）；Milli-Q 型超純水儀（默克公司）。

1.2 試藥

對照品槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷（特性量值以94.5% 計，批號：111854-201905）、蘆丁（特性量值以≥90.5%計，批號：0080-9705）、異槲皮苷（特性量值以98.62%計，批號：100083-201907）、異鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷（特性量值以99.63%計，批號：110862-201703）、槲皮素（特性量值以99.1%計，批號：100081-201610）、異鼠李素（特性量值以99.9%計，批號：110860-201611）均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈、甲醇均為色譜純；異丙醇、磷酸、甲醇均為分析純。

葶藶子、大棗飲片均由魯南厚普制藥有限公司提供，經經方與現代中藥融合創新全國重點實驗室高級研究員范建偉鑒定符合《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020年版（一部）[11]中葶藶子、大棗標準，葶藶子為十字花科植物播娘嵩Descurainia sophia（L.）Webb ex Prantl.（南葶藶子）的干燥成熟種子，產地為山東菏澤，購自臨沂柯屹藥業有限公司（批號分別為220302、220307、220311、220401、220405、220406、220412、220501、220604、220701、220915、220916、220921、220922）；大棗為鼠李科植物棗Ziziphus jujubaMill.的干燥成熟果實，產地為山西運城，購自安徽人民中藥飲片有限公司（批號分別為220501、220502、220505、220508、220601、220602、220606、220702、220703、220901、220902、220903、220904、220905）。

2 方法

2.1 溶液制備

2.1.1 供試品溶液制備 取葶藶子90 g、大棗100 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密量取純凈水1900 mL并加入上述圓底燒瓶，加熱回流1.5 h，濾過，濾液加水定容至1900 mL，混合均勻，取回流提取液適量，4000 r·min–1離心5 min（離心半徑為5 cm），濾過（0.22 μm），續濾液即為葶藶大棗瀉肺湯供試品溶液（共14批，編號為S1～S14）。

2.1.2 對照品溶液制備 取槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷、蘆丁、異槲皮苷、異鼠李素-3-Oβ-D-葡萄糖、槲皮素、異鼠李素適量，精密稱定，分別用甲醇溶解，制成質量濃度分別為0.883 8、0.741 4、0.773 2、0.416 5、1.065 1、0.197 0 mg·mL–1的溶液，作為對照品儲備液。精密量取上述對照品儲備液，稀釋成質量濃度分別為0.117 800、0.009 885、20.610 000、11.110 000、2.840 000、3.752 000 mg·mL–1的溶液，即為混合對照品溶液。

2.2 色譜條件

Agilent ZORBAX SB C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）為流動相梯度洗脫（0～5 min，95%～91%B；5～15 min，91%～89%B；15～37 min，89%～80%B；37～47 min，80%～70%B；47～53 min，70%～60%B；53～57 min，60%～95%B；57～65 min，95%B）；溶劑為甲醇；柱溫為30 ℃；進樣量為5 μL；檢測波長為254 nm。理論板數按槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷計不得低于5000，分離度>1.5。槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷、蘆丁、異槲皮苷、異鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖、槲皮素、異鼠李素的保留時間分別為13.235、34.272、35.860、41.976、50.990、56.213 min。葶藶大棗瀉肺湯HPLC圖見圖1。

圖1 葶藶大棗瀉肺湯HPLC圖

2.3 方法學考察

參照《中國藥典》2020 年版（四部）“分析方法驗證指導原則（9101）”[12]，取2.1項下的混合對照品溶液及供試品溶液，按2.2 項下色譜條件分別進行精密度、穩定性、重復性試驗。

2.3.1 精密度試驗 取葶藶大棗瀉肺湯（S1）供試品溶液，按2.2 項下色譜條件連續進樣6 次，記錄HPLC 圖，以槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD。各共有峰相對保留時間的RSD為0.53%～0.77%，相對峰面積的RSD 為1.29%～1.56%，均小于2.0%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩定性試驗 取葶藶大棗瀉肺湯（S1）供試品溶液，按2.2 項下色譜條件于0、2、4、6、8、12、24、48 h 分別進樣，記錄HPLC 圖。以槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD。各共有峰相對保留時間的RSD為0.29%～0.58%，相對峰面積的RSD 為1.33%～3.04%，均小于5.0%，表明供試品溶液在48 h內穩定性良好。

2.3.3 重復性試驗 按2.1 項下方法，取6 份供試品溶液（S1），按2.2 項下色譜條件將6 份供試品溶液分別進樣，記錄HPLC 圖。以槲皮素-3-Oβ-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD。各共有峰相對保留時間的RSD為0.31%～0.62%，相對峰面積的RSD 為1.41%～3.87%，均小于5.0%，表明該方法重復性良好。

2.4 指紋圖譜建立及相似度評價

按2.1 項下方法取不同批葶藶子、大棗，制備供試品溶液。按2.2 項下色譜條件分別進樣，記錄HPLC 圖；將圖譜導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”（2012A 版），以多點校正法進行圖譜匹配，即得葶藶大棗瀉肺湯指紋圖譜。

2.5 特征峰含量測定

參照《中國藥典》2020 年版（四部）“分析方法驗證指導原則（9101）”[12]，取2.1項下對照品溶液、供試品溶液，按2.2 項下色譜條件分別進行線性關系考察，精密度、穩定性、重復性、加樣回收率試驗。

2.5.1 精密度試驗 分別取混合對照品溶液，按2.2 項下色譜方法連續進樣6 次，記錄HPLC 圖，槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷、蘆丁、異槲皮苷、異鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖、槲皮素、異鼠李素平均峰面積RSD 分別為0.33%、0.74%、0.42%、0.68%、1.98%、1.30%，均小于2.0%，表明儀器精密度良好。

2.5.2 穩定性試驗 取葶藶大棗瀉肺湯（S1）供試品溶液，按2.1 項下方法制備供試品溶液，于0、2、4、6、8、12、24、48 h 分別按2.2 項下色譜條件進樣，記錄HPLC圖，槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷、蘆丁、異槲皮苷、異鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖、槲皮素、異鼠李素平均峰面積的RSD 分別為 0.32%、0.70%、1.41%、1.87%、1.19%、2.08%，均小于3.0%，表明供試品溶液在48 h 內穩定性良好。

2.5.3 重復性試驗 取同一批葶藶子、大棗，按2.1 項下方法平行制備6 批供試品溶液，按2.1 項下方法制備供試品溶液，按2.2 項下色譜條件分別進樣，記錄HPLC 圖，各成分含量的RSD 分別為0.65%、0.99%、1.80%、1.22%、2.96%、1.55%，均小于3.0%，表明方法重復性良好。

2.5.4 加樣回收率試驗 取葶藶大棗瀉肺湯（S1）供試品溶液6 份，每份2 mL，分別準確加入含有等量各成分對照品的對照品儲備液2 mL，按2.1 項下方法制備樣品溶液，按2.2 項下色譜條件進樣，槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷、蘆丁、異槲皮苷、異鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖、槲皮素、異鼠李素加樣回收率分別為97.44%、98.09%、97.85%、100.40%、95.95%、96.88%，RSD 分別為 2.14%、2.67%、1.69%、2.33%、3.11%、2.64%；各組分的平均回收率為95%～102%，且平均回收率的RSD 均小于4.0%，表明方法準確度良好。

2.5.5 線性關系考察 以進樣質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），回歸方程見表1。槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷、蘆丁、異槲皮苷、異鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖、槲皮素、異鼠李素6 個成分在各自質量濃度范圍內呈良好的線性關系。

表1 葶藶大棗瀉肺湯中6個特征成分線性關系 μg·mL–1

取2.1 項下葶藶大棗瀉肺湯供試品溶液，按2.2項下色譜條件進行含量測定，并記錄HPLC 圖，計算成分含量。

3 結果與討論

3.1 葶藶大棗瀉肺湯指紋圖譜

葶藶大棗瀉肺湯指紋圖譜共標定共有峰27 個，其中特征峰6 個（5 號峰、18 號峰、19 號峰、21 號峰、24 號峰、27 號峰）。經分析，14 批葶藶大棗瀉肺湯圖譜相似度均大于0.9，相似度良好，表明所建立的葶藶大棗瀉肺湯指紋圖譜質量穩定，可準確標記葶藶大棗瀉肺湯的化學成分分布指紋特征（圖2）。

圖2 葶藶大棗瀉肺湯特征指紋圖譜

3.2 特征峰含量測定結果

不同批次供試品之間的槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷、蘆丁、異槲皮苷、異鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖、槲皮素、異鼠李素的含量測定結果接近且均一，進一步說明本方煎煮過程穩定，不易受環境因素影響（表2）。

表2 葶藶大棗瀉肺湯中6個特征成分質量濃度 μg·mL–1

3.3 質量控制指標成分選擇

中藥制劑化學成分相對復雜，藥效的發揮并非由單一化學成分決定，而是不同藥物之間配伍，協同作用，是多成分復合的結果。本研究參照《中國藥典》2020 年版，結合相關文獻報道[13-14]，選取葶藶子和大棗中具有代表性且與藥效相關性強的成分作為指標成分。葶藶子主要含有硫苷類、異硫氰酸和芥苷類、黃酮類、強心苷類等成分[15]，其行瀉下功能的主要為黃酮類成分。其中，槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷為《中國藥典》2020 年版葶藶子指標成分，具有祛痰、止咳、平喘的作用，兼具舒張支氣管平滑肌、促進氣管纖毛運動等多種藥理作用[16]；異槲皮苷是槲皮素的氧苷衍生素，兩者均具有平喘、降血壓、調血脂的功效[13]，異鼠李素和異鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷均具有止咳祛痰、消食化滯、活血散瘀的功效[17]。大棗中的蘆丁屬于維生素類成分，有保護毛細血管、防治高血壓的功效[18]。本研究指認了葶藶大棗瀉肺湯中皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷、蘆丁、異槲皮苷、異鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖、槲皮素、異鼠李素6個成分，6個成分藥理功效與葶藶大棗瀉肺湯瀉肺逐水、化痰平喘基本相符，能反映葶藶大棗湯的藥效物質基礎。中藥制劑的開發關鍵在于建立從藥材到飲片、中間體、制劑全鏈條的質量控制體系，嚴格把控制備過程中的質量情況、指紋圖譜及多指標成分含量測定是評價中藥制劑質量的重要手段[19-20]。

4 結論

本研究建立的葶藶大棗瀉肺湯物質基準HPLC指紋圖譜和多指標成分含量測定方法可較全面地反映其化學成分信息，且檢測方法穩定可靠、簡便可行、重復性好，可為葶藶大棗瀉肺湯物質基準完善、制劑的質量控制標準研究提供數據支持。

[利益沖突]本文不存在任何利益沖突。