基于QbD理念的散偏湯提取工藝設計空間預測△

孫萌，劉雪純，趙玥瑛，張晴，席鋮，董爽，張馨雨，杜守穎，白潔，陸洋

北京中醫藥大學 中藥學院，北京 102488

散偏湯出自清代《辨證錄》[1]，主治偏頭痛。現代研究表明，其對血管神經型偏頭痛、急性缺血性卒中、抑郁癥等疾病具有顯著療效[2-5]。本課題組前期對散偏湯的基準樣品質量標準進行了研究[6]，本研究在基準樣品的基礎上進一步研究其顆粒劑的提取工藝。

質量源于設計（QbD）理念在21 世紀初由美國食品藥品監督管理局（FDA）最初應用到藥品質量控制領域，國際人用藥品注冊技術協調會（ICH）發布的質量指導原則Q8（R2）：藥品研發/問答[Q8（R2）: Pharmaceutical Development][7]將QbD 定義為一種系統化的開發方法，即以預定義的產品質量目標作為設計起始，以合理的科學實驗和質量風險管理為基礎，深入理解產品屬性和過程控制，其對于中藥制劑生產過程中的質量控制有一定指導意義。2010 年發布的《關于加快醫藥行業結構調整的指導意見》[8]闡明要促進現代科學技術全過程應用于中藥生產，革新中藥制劑從提取分離到生產的全過程質量控制技術，而QbD 理念的核心恰恰在于過程質量控制。在QbD 理念的基礎上，徐冰等[9]提出中藥制劑生產過程中設計空間（DS）的應用策略。中藥制劑實際生產過程存在一定的局限性：首先，實驗室生產環境下生產規模小，各項工藝參數能做到精準控制，而企業中試放大生產難以高度還原實驗室小試中的各項工藝參數，無法保證產品的質量均一性，而DS的建立能夠在合理范圍內實現彈性化過程質量控制，更適于工業生產；其次，一個合理的DS應當能夠保證空間內工藝參數的調整均不會引起質量的異常，因此參數調整更加靈活，可以根據不同產地、不同批次物料的質量特性靈活變化，使最終的產品質量屬性趨向一致；最后，DS內的操作均不視為工藝變更，中藥制劑工藝參數的微調無需再次申報，能更好地節省人力、物力，節約資源。

QbD 理念的具體思路是研究產品的關鍵質量屬性（CQAs），確定制劑的關鍵工藝參數（CPPs），借助數學模型建立聯系，保留具備容錯彈性的DS，以產品CQAs 為決策變量倒推生產過程前端各工藝單元參數，建立藥品生產過程質量控制。CPPs 與CQAs 之間關聯擬合模型的建立有多種方法，其中Box-Behnken 設計響應面法因其全面性及操作簡便性被廣泛使用，其能夠建立參數與工藝水平之間的函數關系，進而針對目標工藝水平進行工藝參數的預測和優化[10-13]。

本研究以散偏湯為例，基于QbD 理念，采用Box-Behnken 設計響應面法擬合CPPs 與CQAs 數學模型，探究其多維交互作用，基于《按古代經典名方目錄管理的中藥復方制劑藥學研究技術指導原則（試行）》要求建立散偏湯提取工藝的DS[14]，以尋求適配工業生產的散偏湯提取工藝的CPPs。

1 材料

1.1 儀器

BSA224S 型電子分析天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]；H22-X3 型九陽電陶爐（杭州九陽生活電器有限公司）；HH-6 型電熱恒溫水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司）；DZF-6051 型真空干燥器（北京利康達圣科技有限公司）；DZ47SD20 型真空冷凍干燥機（北京博醫康實驗儀器有限公司）；LC-20A 型高效液相色譜儀[島津（中國）有限公司]；UItimate 3000型高效液相色譜儀[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]。

1.2 試藥

對照品阿魏酸（批號：110773-201915，純度：99.0%）、芥子堿硫氰酸鹽（批號：111702-202006，純度：98.3%）、甘草苷（批號：111610-201908，純度：93.1%）、甘草酸銨（批號：110731-202021，純度：97.7%）均購于中國食品藥品檢定研究院；乙腈、甲醇、磷酸均為色譜純；其他試劑均為分析純。

川芎（四川眉山，批號：2009072）、白芍（安徽亳州，批號：200623）、白芥子（四川南充，批號：200213）、甘草（甘肅武威，批號：201804-3）、柴胡（甘肅康樂，批號：TS-4）、郁李仁（甘肅天水，批號：160944）、白芷（四川遂寧，批號：201801-4）、香附（河南開封，批號：2009080）均購自億帆醫藥股份有限公司，經北京中醫藥大學劉春生教授鑒定分別為傘形科植物川芎Ligusticum chuanxiongHort.的干燥根莖、毛茛科植物芍藥Paeonia lactifloraPall.的干燥根、十字花科植物白芥Sinapis albaL.的干燥成熟種子、豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.的干燥根和根莖、傘形科植物柴胡Bupleurum chinenseDC.的干燥根、薔薇科植物郁李Prunus japonicaThunb.的干燥成熟種子、傘形科植物杭白芷Angelica dahurica(Fisch.ex Hoffm.) Benth.et Hook.f.var.formosana(Boiss.)Shan et Yuan 的干燥根、莎草科植物莎草Cyperus rotundusL.的干燥根莖。

2 方法與結果

2.1 CPPs的建立

采用魚骨圖作為風險辨識工具，按照“機、環、人、料、法”梳理挖掘質量風險相關工藝參數，初步確定潛在的CPPs。

通過魚骨圖（圖1）工具將生產工藝中的風險相關工藝步驟梳理完畢，初步劃定潛在的關鍵工藝，通過失效模式與效應分析（FMEA），將所涉及的多種因素進行風險順序級數（RPN）的評估[15]。以前期研究經驗及工業基礎知識為依據，評估工藝參數中失效項目發生的頻率（P）、嚴重程度（S）和檢測等級（N）。P是指該失效原因在生產過程中的發生頻率，其數值越大，發生失效項目的頻率越高；S用于評估失效項目發生對于整個工藝水平的影響程度，其數值越大，代表其對工藝水平影響越大；N用于評估失效項目能夠被檢測出來的難易程度，其數值越大，該項目越難被檢測到。每個因數的取值范圍設定為1～10。

圖1 散偏湯提取工藝參數風險辨識魚骨圖

人員因素、設備因素和環境因素引起產品質量失效發生的頻率均較低，故P為2～4，而工藝因素和物料因素引起產品質量失效頻率更高，P為7～8，且物料因素高于工藝因素；人員因素、設備因素及環境因素引起產品質量失效的嚴重性不高，S為3～4，但工藝參數的改變可能導致提取效率的改變，不同產地、不同批次藥材的成分組成和含量差異可能很大，因此工藝因素和物料因素對產品質量的影響更嚴重，S為5～8；設備因素、物料因素和環境因素均處于可控范圍內，故其N較低，為2～3，人員因素和工藝因素相對更不穩定，因此N較高。按公式（1）計算RPN。

RPN<50 記為低優先級，50≤RPN<125 為中優先級，RPN≥125 為高優先級，結果見表1。人員因素、設備因素和環境因素的RPN 均處于低優先級，物料因素的RPN 處于中優先級，而工藝因素的RPN 處于高優先級。對高優先級因素進行考察，選擇提取次數、提取時間、加水倍量作為散偏湯提取工藝的CPPs，中、低優先級因素暫設為常量。

表1 散偏湯提取工藝的CPPs的RPN評估

2.2 CQAs的建立及指標檢測

依據前期確定的基準樣品標準[6]選取阿魏酸、芥子堿硫氰酸鹽、甘草苷和甘草酸含量及出膏率為CQAs。

2.2.1 基準樣品制備 按處方量稱取飲片共90 g，加入7 倍量去離子水（630 mL），浸泡0.5 h，煎煮45 min，經過300 目尼龍布濾過；濾渣繼續加水540 mL，煎煮35 min，濾過，合并濾液，放冷至室溫后調整體積至600 mL。

移取水煎液200 mL 到蒸發皿中，水浴加熱，將水煎液濃縮到稠膏狀態，60 °C 真空干燥72 h，按公式（2）計算出膏率。

取前述水煎液10 mL，–20 ℃放置12 h 至完全固態，低于10 Pa 真空度下–80 ℃凍干72 h，壓蓋密封，即為散偏湯基準樣品。

2.2.2 色譜條件

2.2.2.1 阿魏酸及芥子堿硫氰酸鹽的含量測定 Waters Xselect ? HSS T3 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈（A）-0.05%磷酸水溶液（B）為流動相梯度洗脫（0～10 min，2%A；10～18 min，2%～6%A；18～45 min，6%～10%A；45～90 min，10%～15%A；90～110 min，15%～95%A）；柱溫為30 ℃；流速為1 mL·min–1；進樣量為10 μL；波長為321 nm。

2.2.2.2 甘草苷及甘草酸的含量測定 資生堂CAPCELL PAK C18MGS5 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈（A）-0.05%磷酸水溶液（B）為流動相梯度洗脫（0～8 min，19%～20%A；8～20 min，20%～33%A；20～40 min，33%～50%A；40～45 min，50%～100%A；45～49 min，100%～19%A）；柱溫為30 ℃；流速為1 mL·min–1；進樣量為10 μL；波長為237 nm[6]。

2.2.3 供試品溶液制備

2.2.3.1 基準樣品供試品溶液制備 取2.2.1 項下凍干粉，去離子水復溶，超聲（250 W，40 kHz）處理30 min，使得其快速溶解完全，置10 mL 量瓶，加入去離子水定容，10 000 r·min–1下離心10 min（離心半徑為5.79 cm），采用0.45 μm 針式濾器濾過，即得。

2.2.3.2 提取液供試品溶液制備 取處方量飲片加水浸泡30 min，回流，濾過，放冷至室溫后調整濾液體積一致，10 000 r·min–1下離心10 min（離心半徑為5.79 cm），采用0.45 μm針式濾器濾過，即得。

2.2.4 對照品溶液制備 分別精密稱取阿魏酸對照品9.50 mg、芥子堿硫氰酸鹽對照品9.85 mg于10 mL量瓶中，70%甲醇定容，得質量濃度為940.50 μg·mL–1的阿魏酸對照品母液，以70%甲醇稀釋20 倍；得到質量濃度為968.26 μg·mL–1的芥子堿硫氰酸鹽對照品母液，以70%甲醇稀釋10倍。

分別精密稱取甘草苷對照品9.69 mg、甘草酸銨對照品10.05 mg 于10 mL 量瓶中，70%乙醇定容，得質量濃度分別為902.14、1 002.21 μg·mL–1的甘草苷、甘草酸對照品母液，以70%乙醇稀釋10倍。

2.2.5 出膏率測定 將提取液轉移至蒸發皿中濃縮至適當體積后，水浴加熱濃縮為稠膏，60 ℃減壓干燥72 h，按公式（2）計算出膏率。

2.3 DS的建立

2.3.1 單因素考察 分別考察加水倍量和提取時間兩因素各水平下指標成分含量及出膏率，結果見圖2、圖3，依據單因素試驗結果，選擇5 倍加水量為低水平，20倍加水量為高水平。

圖2 不同加水倍量散偏湯各指標成分質量分數及出膏率（±s,n=2）

圖3 不同提取時間散偏湯各指標成分質量分數及出膏率（±s,n=2）

由圖3 可知，4 個指標性成分含量隨提取時間延長變化較小，其中阿魏酸含量與提取時間呈正相關，其他3 個指標性成分含量均在90 min 時達到最高。阿魏酸在濃縮、干燥過程中損失率最大，甘草酸損失率最小，考慮損失率的原因，故雖然甘草酸在150 min含量最低，但為了綜合保證提取液中各指標性成分的含量，仍選擇60 min為低水平，150 min為高水平。

2.3.2 Box-Behnken 響應面法 結合前期試驗，以CPPs 為考察因素，以CQAs[Y1（阿魏酸含量）、Y2（芥子堿硫氰酸鹽含量）、Y3（甘草苷含量）、Y4（甘草酸含量）、Y5（出膏率）]為評價指標，進行Box-Behnken 響應面單因素試驗設計，每一影響因素設置3個考察水平，見表2。

表2 散偏湯提取工藝Box-Behnken響應面試驗設計因素水平

2.3.3 結果 根據Design Expert 10.0 軟件設計的試驗順序進行各組試驗，每組試驗所得CQAs 結果見表3。

表3 散偏湯提取工藝Box-Behnken響應面試驗結果

2.3.4 模型擬合及DS 建立 采用Design Expert 10.0 軟件內設程序對Y1～Y5進行擬合，得回歸方程：Y1=0.661 6–0.000 1A+0.094 8B+0.105 6C+0.044 5AB–0.030 7AC–0.040 0BC–0.035 4A2–0.055 7B2–0.041 4C2；Y2=0.969 2–0.009 0A+0.086 0B+0.108 3C+0.015 2AB– 0.009 8AC–0.101 8BC+0.044 5A2–0.085 0B2–0.072 5C2；Y3=0.368 2+0.007 1A+0.084 8B+0.099 1C；Y4=0.614 4+0.055 3A+0.153 0B+0.287 0C+0.075 5AB +0.072 5AC+0.010 0BC ；Y5=28.780 0+0.785 0A+2.280 0B+3.770 0C。ANOVA方差分析結果見表4。

表4 散偏湯提取工藝的CPPs對CQAs擬合模型的ANOVA方差分析

方差結果顯示，阿魏酸、芥子堿硫氰酸鹽、甘草酸含量及出膏率的擬合模型方差顯著，除阿魏酸外其他擬合模型失擬項不顯著，表明模型基本可靠。上述函數擬合的r超過80%，表明其能夠較可靠地說明大部分指標變化與考察因素之間的關系。調整決定系數（R2

adj）超過77%，說明模型回歸擬合度高，基本符合擬合方程。另外，甘草苷的擬合模型方差不顯著，失擬項也不顯著，說明該模型擬合程度較差。

分析結果發現，3 個考察因素對阿魏酸、芥子堿硫氰酸鹽、甘草酸含量的影響均存在交互作用，其響應面及等高線圖見圖4～圖6。

圖4 提取時間、加水倍量和提取次數對阿魏酸質量分數影響的交互作用

圖4 等高線在加水倍量方向上變化較為密集，而在提取時間方向上變化較為疏松，說明加水倍量更能夠影響阿魏酸含量變化，提取時間因素則次之；在提取次數方向上變化較為密集，而在提取時間方向上變化較為疏松，說明提取次數更能夠影響阿魏酸含量變化，提取時間因素則次之；在兩個方向上的疏密變化基本無差別，說明加水倍量對阿魏酸含量變化的影響與提取次數相近。綜上認為，按各因素對阿魏酸含量變化的影響程度從高至低為提取次數、加水倍量、提取時間。

圖5 等高線在加水倍量方向上變化較為密集，而在提取時間方向上變化較為疏松，說明加水倍量更能夠影響芥子堿硫氰酸鹽含量變化，提取時間因素則次之；在提取次數方向上變化較為密集，而在提取時間方向上變化較為疏松，說明提取次數更能夠影響芥子堿硫氰酸鹽含量變化，提取時間因素則次之；在加水倍量方向及提取次數兩方向上變化疏密程度相近，說明加水倍量與提取次數兩因素對芥子堿硫氰酸鹽含量變化的影響程度相近。綜上認為，按各因素對芥子堿硫氰酸鹽含量變化的影響程度從高至低為加水倍量、提取次數、提取時間。

圖5 提取時間、加水倍量和提取次數對芥子堿硫氰酸鹽質量分數影響的交互作用

圖6等高線在加水倍量方向上變化較為密集，而在提取時間方向上變化較為疏松，說明加水倍量更能夠影響甘草酸含量變化，提取時間因素則次之；在提取次數方向上變化較為密集，而在提取時間方向上變化較為疏松，說明提取次數更能夠影響甘草酸含量變化，提取時間因素則次之；在提取次數方向上變化較為密集，而在加水倍量方向上變化較為疏松，說明提取次數更能夠影響甘草酸含量變化，加水倍量因素則次之。綜上認為，按各因素對甘草酸含量變化的影響程度從高至低為提取次數、加水倍量、提取時間。

圖6 提取時間、加水倍量和提取次數對甘草酸質量分數影響的交互作用

由圖4～圖6 推測提取時間與提取次數、加水倍量與提取次數產生更強的交互，對3 個成分含量影響較大。

本課題組前期研究數據顯示，提取-濃縮-干燥過程中阿魏酸損失率約為40%，芥子堿硫氰酸鹽損失率約為25%，甘草苷損失率約為20%，甘草酸損失率約為5%。依據本課題組已有的研究基礎，首先建立15 批散偏湯物質基準的指標成分含量標準范圍[6]，考慮到企業實際生產中可能出現的損失率過大的情況，故將各指標最小值設定為基準樣品中指標成分含量的平均值，最大值設定為基準樣品中的指標成分含量平均值×（損失率+1.3），則CQAs 的目標為Y1：0.303‰～0.515‰、Y2：0.603‰～0.935‰、Y3：0.233‰～0.349‰、Y4：0.336‰～0.454‰、Y5：23.72%～30.84%。以此目標范圍為條件，搜索符合目標的工藝參數范圍，將5 個單指標的DS 取交集，構建多指標綜合DS，采用Design Expert 10.0 內設程序進行Overlay Plot直觀化，結果見圖7。

圖7 不同提取次數下的散偏湯提取工藝DS

圖7中黃色部分即為符合Y1、Y2、Y3、Y4、Y5指標范圍要求的DS 的交集，通過Overlay Plot展示發現，進行3次提取時，無論考察因素如何變化，響應值均無法同時符合5個指標的范圍要求；進行2次提取時DS較為狹窄，故選擇提取1次，圖7A中符合黃色部分范圍的工藝參數交集即為散偏湯提取工藝DS，該DS內所有工藝點的試驗結果均符合CQAs目標范圍。

在所建立的DS 內選取一試驗點進行工藝驗證，驗證結果見表5。結果顯示，依照該試驗點的工藝參數進行試驗，得到每個處方中阿魏酸質量分數均值為0.450‰、芥子堿硫氰酸鹽質量分數均值為0.787‰、甘草苷質量分數均值為0.248‰、甘草酸質量分數均值為0.451‰，出膏率均值為23.83%，所得結果均符合前述CQAs的目標范圍。

表5 散偏湯提取工藝DS驗證實驗（±s,n=3）

表5 散偏湯提取工藝DS驗證實驗（±s,n=3）

注：提取時間為60 min；加水倍量為20倍。

3 討論

經典名方以中醫經典和臨床經驗為基礎，是體現中醫理論精華的重要載體，現代研究對中藥復方的藥效物質基礎研究逐漸深入，認為其中的有效成分是復方起效的基礎，而制劑工藝參數的優化又是控制成分含量的關鍵環節。傳統的質量源于檢驗（QbT）理念是通過后端設限來控制質量，具有一定的局限性，沒有從根本上解決藥品質量均一性的問題，而基于QbD 理念的質量控制著眼于藥品生產過程，將關鍵工藝單元的CPPs控制在合理范圍內，同時對工藝參數變化設置一定的彈性DS，使得質量控制過程更加靈活。

本研究采用魚骨圖結合FMEA 確定提取工藝的CPPs，以提取液中4 個指標成分含量及出膏率為CQAs，通過Box-Behnken 響應面法試驗擬合各指標的數學模型，建立DS，進行散偏湯提取工藝的預測和彈性優化，并驗證了DS工藝的可行性。

本研究基于QbD 理念，依據《按古代經典名方目錄管理的中藥復方制劑藥學研究技術指導原則（試行）》的要求和實際生產中可能出現的情況建立了DS[14]，并在空間內取點驗證，在考慮到成分損失率的基礎上均滿足前期建立的質量標準，表明該提取工藝可靠，后續實際生產中可根據企業人員、設備、環境及物料因素的變化對該DS 做出微調，進行DS的精準化、個性化劃分，可為企業中試放大生產提供一定參考價值。

[利益沖突]本文不存在任何利益沖突。