基于層次分析-熵權法優選溫肺平喘湯的提取工藝△

王博，王瑞，王佳，吳作敏，于曉濤*

1.漯河市中心醫院 藥學部，河南 漯河 462000；2.河南省中藥制劑與加工中醫藥重點實驗室，河南 漯河 462000

近年來，受環境污染及疫情影響，上呼吸道感染疾病高發，抵抗力較弱的幼兒及合并慢性基礎疾病的老年人易發展為肺炎[1]。肺炎若未能及時得到控制，轉為重癥可能會出現呼吸衰竭、休克甚至全身器官衰竭，導致功能障礙等嚴重并發癥[2]。目前，由于細菌耐藥性增加、精準的抗病毒藥物較少等問題，化學藥對肺炎的治療存在一定的局限性[3]。溫肺平喘湯由《傷寒論》中“小青龍湯”加減而來，由丹參、白芍、炙甘草等12 味中藥組成，具有散寒化瘀、止咳平喘的功效[4]。方中丹參活血通痹、消癰祛瘀[5]為君藥，干姜溫肺化飲、回陽通脈[6]為臣藥，白芍和營養血[7]為佐藥，甘草補脾益氣、祛痰止咳[8]為使藥。丹參中指標性成分丹酚酸B 能夠減輕金黃色葡萄球菌肺炎幼鼠體內炎癥狀態，降低肺組織炎癥水平[9]。迷迭香酸可以有效抑制肺部炎癥的活性，對脂多糖（LPS）誘導的肺泡巨噬細胞具有極大的抗炎潛力[10]。白芍中芍藥苷可以降低組織氧化應激與炎癥水平，改善膿毒癥所致的急性肺損傷[11]。甘草中的甘草酸顯著減少肺和支氣管肺泡灌洗液中的中性粒細胞數量，有效地抑制嗜中性氣道炎癥，減輕組織病理學肺損傷[12]。甘草苷可劑量依賴性地抑制肺中性粒細胞和巨噬細胞炎癥，減輕肺上皮細胞的損傷[13]。

層次分析（AHP）-熵權法（EWM）是一種主、客觀相結合確定權重值的方法[14]，一方面根據重要程度和主觀經驗確定分析對象系數，另一面整理分析實驗數據，進行賦值，增加結果的科學性和可信度[15]。本研究以方中藥效成分芍藥苷、甘草苷、迷迭香酸、丹酚酸B、甘草酸含量和干浸膏得率為評價指標，采用正交設計優選溫肺平喘湯的提取工藝，為該方進一步的開發和利用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LC-20A 型高效液相色譜儀、AUW-120D 型十萬分之一天平（日本島津公司）；Milli-Q 型純水儀（美國密理博公司）；KQ-300E 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；5810R 型低溫高速離心機（德國Eppendorf 公司）；98-Ⅰ-CN 型智能恒溫數顯電加熱套（天津泰斯特科技有限公司）；RE-52A 型旋轉蒸發儀（上海亞榮科技有限公司）。

1.2 試藥

對照品芍藥苷（批號：110736-201842，純度：97.4%）、迷迭香酸（批號：111871-202007，純度：98.1%）、丹酚酸B（批號：111562-201716，純度：94.1%）、甘草苷（批號：111610-201607，純度：93.1%）均購自中國食品藥品檢定研究院；甘草酸（四川成都曼思特生物公司，批號：MUST-19052407，純度：99.5%），甲酸、甲醇、乙腈均為色譜純。

丹參（安徽桐花堂中藥飲片有限公司，山東，批號：20200701）；白芍（河南鴻博藥業有限公司，安徽，批號：191001）；炙甘草（北京時珍堂藥業有限公司，內蒙古，批號：20170301），以上飲片經漯河市中心醫院于曉濤副主任中藥師鑒定均為正品。

2 方法和結果

2.1 含量測定

2.1.1 色譜條件 YMC Triart C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈（A）-0.1%甲酸（B）為流動相梯度洗脫（0～10 min，10%～12%A；10～25 min，12%A；25～30 min，12%～14%A；30～35 min，14%～19%A；35～45 min，19%A；45～60 min，19%～25%A；60～70 min，25%A；70～80 min，25%～27%A；80～90 min，27%～40%A；90～100 min，40%～50%A；100～105 min，50%A；105～110 min，50%～90%A；110～120 min，90%A）；流速為1.0 mL·min–1；柱溫為25 ℃；檢測波長：230 nm（芍藥苷、甘草苷）、330 nm（迷迭香酸）、286 nm（丹酚酸B）、251 nm（甘草酸）；進樣量為10 μL。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取芍藥苷、甘草苷、迷迭香酸、丹酚酸B 和甘草酸對照品適量，加甲醇溶解，制成質量濃度分別為1.360 0、0.071 4、0.037 8、0.842 8、0.045 0 mg·mL–1的混合對照品儲備液。

2.1.3 供試品溶液的制備 稱取處方量中藥，加8倍量水加熱回流提取2 次，每次1 h，趁熱濾過，合并濾液，濃縮至250 mL，精密吸取濃縮液1 mL，13 000 r·min–1離心10 min（離心半徑為18.7 cm），取上清液，即得。按照處方分別稱取不含白芍、丹參、甘草的其他藥味，加8 倍量水提取2 次，每次1 h，濾過，濃縮至250 mL，精密吸取濃縮液1 mL，13 000 r·min–1離心10 min（離心半徑為18.7 cm），取上清液，即得陰性樣品溶液，見圖1。

圖1 溫肺平喘湯混合對照品、供試品、陰性樣品在251 nm高效液相色譜圖

2.1.4 標準曲線的繪制 精密量取2.1.2 項下混合對照品溶液0.1、0.3、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，分別置于2 mL量瓶中，加50%甲醇稀釋，得系列質量濃度工作溶液，按2.1.1 項下色譜條件測定，以峰面積為縱坐標（Y），進樣量為橫坐標（X），得回歸方程，見表1。結果表明，各成分在進樣范圍內線性關系良好。

表1 溫肺平喘湯5個成分的線性關系

2.1.5 精密度試驗 吸取上述混合對照品溶液，連續進樣6 次，測定峰面積，經計算芍藥苷、甘草苷、迷迭香酸、丹酚酸B 和甘草酸峰面積的RSD 分別為1.85%、0.94%、0.60%、0.53%、0.64%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩定性試驗 取同一供試品溶液，在制備后0、2、4、8、12、24 h 按2.1.1 項下色譜條件測定，計算芍藥苷、甘草苷、迷迭香酸、丹酚酸B 和甘草酸峰面積的RSD 分別為0.48%、2.15%、0.64%、0.11%、0.45%，表明供試品溶液在24 h 內穩定性良好。

2.1.7 重復性試驗 精密量取同一供試品溶液6份，按2.1.1 項下色譜條件測定，計算芍藥苷、甘草苷、迷迭香酸、丹酚酸B 和甘草酸含量的RSD 分別為1.22%、1.95%、0.57%、0.09%、0.42%，表明該方法重復性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗 精密量取提取液1 mL，平行6 份，加入混合對照品溶液1 mL（芍藥苷、甘草苷、迷迭香酸、丹酚酸B、甘草酸質量濃度分別為0.460 0、0.029 6、0.019 6、0.478 0、0.017 2 mg·mL–1），13 000 r·min–1離心10 min（離心半徑為18.7 cm），取上清液，按2.1.1 項下色譜條件測定，結果芍藥苷、甘草苷、迷迭香酸、丹酚酸B 和甘草酸的平均加樣回收率分別為98.22%、101.91%、103.87%、102.32%、100.47%，RSD 分別為2.25%、2.05%、1.08%、0.83%、1.33%，表明該方法回收率良好。

2.2 浸膏含量的測定

精密量取濾液10 mL，置已干燥至恒重的蒸發皿中，水浴蒸干后于105 ℃干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定質量，計算浸膏的含量。

2.3 AHP-EWM權重的計算

2.3.1 AHP 確定權重系數 通過AHP 量化6 個指標成分的權重系數，根據中藥復方君臣佐使配伍理論對各指標進行重要性排序，丹酚酸B>迷迭香酸>芍藥苷>甘草苷>甘草酸>干膏得率，以此構成成對比較的優先矩陣，并獲得各項指標的相對評分，結果見表2。根據表2 結果，AHP 法計算得到芍藥苷、甘草苷、迷迭香酸、丹酚酸B、甘草酸和干膏得率6項指標權重系數分別為0.160 2、0.100 9、0.251 6、0.380 6、0.064 2、0.042 5。一致性比例因子（CR）=一致性檢驗因子（CI）/平均隨機一致性指標（RI）=0.023 9<0.1，說明矩陣具有一致性，其相應求得的權重有效。

表2 溫肺平喘湯目標成對比較判斷優先矩陣

2.3.2 EWM 確定權重系數 以芍藥苷、甘草苷、迷迭香酸、丹酚酸B、甘草酸的含量和干膏得率為評價指標，建立原始評價指標矩陣Y=（yij）m×n，根據公式（1）進行標準化處理得到矩陣P=（pij）m×n[16]。根據公式（2）計算第j個評價指標的信息熵（H）j，各指標的Hj分別為0.987 6、0.960 1、0.970 9、0.979 0、0.959 2、0.991 4。根據公式（3）計算第j個指標的權重系數（W）j，各指標的Wj分別為0.081 5、0.263 2、0.191 7、0.138 2、0.268 8、0.056 6。

式中，yij表示第i次試驗時第j個評價指標的取值，pij表示第i次試驗在第j個評價指標下的概率。

2.3.3 AHP-EWM 組合確定指標綜合權重 通過AHP 得到Wj-AHP，EWM 得到Wj-EWM，根據公式（4）計算綜合權重值（Mj），結果得到芍藥苷、甘草苷、迷迭香酸、丹酚酸B、甘草酸的含量和干膏得率6個評價指標的Mj分別為0.081 5、0.165 9、0.301 2、0.328 5、0.107 8、0.015 0。AHP與EWM 所得權重系數之間的r為–0.113，兩者相關性不顯著（P=0.831>0.05），說明兩者所反映的信息不具有疊加性，Mj所反映信息更加全面[17-18]。

2.4 制備工藝正交試驗及結果

選擇加水倍量（A）、提取時間（B）和提取次數（C）為考察因素，以芍藥苷、甘草苷、迷迭香酸、丹酚酸B、甘草酸含量及干膏得率為指標進行綜合評分，按公式（5）計算綜合評分。采用L9（34）進行試驗，因素水平見表3，試驗結果見表4，方差分析見表5。結果表明三因素中對綜合評分影響大小分別為C>B>A，3 個因素對綜合評分的影響均無統計學意義。于是對各因素的3 個水平值進行兩兩比較，綜合考慮優選最佳工藝參數為A2B2C3，即8 倍加水量、加熱時間1.0 h、提取3次。

表3 溫肺平喘湯正交試驗因素水平

表4 溫肺平喘湯正交試驗設計和結果

表5 溫肺平喘湯綜合評分的方差分析

2.5 驗證實驗

按優選的工藝條件進行驗證實驗，平行3 次，結果見表6，3 次驗證實驗綜合評分分別為98.78、99.05、98.66，RSD<3%，說明優選的提取工藝穩定可行。

表6 溫肺平喘湯最優提取工藝驗證實驗結果

3 討論

本研究采用二極管陣列檢測器對芍藥苷、甘草苷、迷迭香酸、丹酚酸B、甘草酸5個成分進行紫外全波長掃描（190～400 nm），為了保證各個成分的分離度、靈敏度、豐度等較好，最終選擇芍藥苷、甘草苷230 nm、迷迭香酸330 nm、丹酚酸B 286 nm、甘草酸251 nm 為檢測波長。AHP 是一種較為主觀的層次化的分析方法，可以對多種指標進行賦權，適合中藥多成分多指標權重的計算，對決策問題進行數學化，增強了總體評價結果的可信度[19-20]。EWM是一種客觀的賦權方法，和指標的離散程度有關，根據熵值攜帶的信息和指標的變異程度計算各指標的權重系數[21-22]。AHP-EWM 確定權重系數的方法結合主客觀賦權法，更加真實可靠，符合實際要求[23]。本研究根據此種方法確定了芍藥苷、甘草苷、迷迭香酸、丹酚酸B、甘草酸和干膏得率6項指標權重系數分別為0.081 5、0.165 9、0.301 2、0.328 5、0.1078、0.015 0。

本研究選擇提取時間、加水倍量和提取次數為考察因素，通過預試驗發現丹酚酸B、迷迭香酸等化合物部分結構不穩定，隨著加熱時間的延長含量降低。采用正交試驗對該方的提取工藝進行優化，并對結果進行綜合分析。結果表明，提取次數影響最大，提取時間次之，加水倍量影響最小，最終結合實際生產的需要確定最優工藝為8 倍加水量、加熱時間1 h、提取3 次。經驗證，優化的工藝穩定可行，可為該方的后續開發提供參考。

[利益沖突]本文不存在任何利益沖突。