基于指紋圖譜與化學(xué)計(jì)量學(xué)的藿香正氣軟膠囊質(zhì)量控制方法研究△

馬宿杉，蘇建，李舒琪，蘇紫藤，王常順*，劉永利*

1.河北科技大學(xué)，河北 石家莊 050000；2.河北省藥品醫(yī)療器械檢驗(yàn)研究院/河北省中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)與標(biāo)準(zhǔn)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050000；3.河北中醫(yī)學(xué)院，河北 石家莊 050000

藿香正氣軟膠囊源于宋代的《太平惠民和劑局方》，首先由宋代醫(yī)者制成散劑服用，后又將散劑制成了丸劑，其由蒼術(shù)、陳皮、厚樸（姜制）、白芷、茯苓、大腹皮、生半夏、甘草浸膏、廣藿香油和紫蘇葉油組成，具有解表化濕、理氣和中的功效[1-2]，用于外感風(fēng)寒、內(nèi)傷濕滯或夏傷暑濕所致的感冒[3]。中藥指紋圖譜是中藥譜效關(guān)系研究的基礎(chǔ)，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)中藥內(nèi)在質(zhì)量的綜合評(píng)價(jià)和整體物質(zhì)的全面控制[4]。藿香正氣軟膠囊現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為《中華人民共和國(guó)藥典》（以下簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》）2020年版（一部）[1]，要求對(duì)蒼術(shù)、陳皮、厚樸、白芷、甘草和廣藿香進(jìn)行薄層鑒別，對(duì)陳皮、厚樸進(jìn)行含量測(cè)定。該方法質(zhì)量控制項(xiàng)目較完善，但方法繁瑣。現(xiàn)有藿香正氣軟膠囊的研究主要集中在含量分析方面[5-8]，未見(jiàn)指紋圖譜相關(guān)研究報(bào)道。因此，本研究采用高效液相色譜法（HPLC）對(duì)其中10 個(gè)指標(biāo)成分進(jìn)行含量測(cè)定，建立指紋圖譜，結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法進(jìn)行全面分析，進(jìn)一步解析藿香正氣軟膠囊的質(zhì)量特性，為建立更加完善的質(zhì)量控制方法提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Ultimate 3000 型高效液相色譜儀（美國(guó)Thermo公司）；XPE26 型、XS105DU 型分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；Milli-Q 型超純水儀（美國(guó)Millipore公司）。

1.2 試藥

對(duì)照品甘草苷（批號(hào)：111610-201106，純度：93.7%）、柚皮蕓香苷（批號(hào)：112080-202201，純度：100.0%）、橙皮苷（批號(hào)：110721-201316，純度：95.3%）、新橙皮苷（批號(hào)：111857-201102，純度：99.6%）、和厚樸酚（批號(hào)：110730-201313，純度：99.1%）、厚樸酚（批號(hào)：110729-201714，純度：100.0%）、歐前胡素（批號(hào)：110826-201918，純度：99.0%）、異歐前胡素（批號(hào)：110827-202113，純度：100.0%）、蒼術(shù)素（批號(hào)：111924-201102，純度：99.5%）均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；對(duì)照品花椒毒酚（批號(hào)：2009-24-7，純度：98.0%）、白當(dāng)歸素（批號(hào)：482-25-7，純度：98.0%）、水合氧化前胡素（批號(hào)：2643-85-8，純度：98.0%）、白當(dāng)歸腦（批號(hào)：26091-79-2，純度：98.0%）、珊瑚菜素（批號(hào)：2543-94-4，純度：98.0%）均購(gòu)于上海詩(shī)丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司；對(duì)照品花椒毒素（批號(hào)：DST210407-062，純度：98.0%）、佛手柑內(nèi)酯（批號(hào)：DST210409-012，純度：98.0%）均購(gòu)于成都德思特生物技術(shù)有限公司；色譜純乙腈[批號(hào)：F22M2A201，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司]；其他試劑均為分析純；水為超純水。藿香正氣軟膠囊樣品共15 批，來(lái)自A 企業(yè)12 批（批號(hào)分別為22053111、20102211、21010911、22022811、21031611、20020411、20070111、21041611、20112111、22021711、20042211、22031912）、B企業(yè)3批（批號(hào)為2930160～2930162）。

2 方法與結(jié)果

2.1 指紋圖譜和含量測(cè)定條件

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫（0～15 min，10%～47%A；15～20 min，47%A；20～30 min，47%～60%A；30～40 min，60%A；40～41 min，60%～10%A；41～50 min，10%A）；流速為1.0 mL·min–1；檢測(cè)波長(zhǎng)為254、283 nm；柱溫為30 ℃。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 取各對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成甘草苷、柚皮蕓香苷、柚皮苷、橙皮苷、水合氧化前胡素、花椒毒素、白當(dāng)歸腦、歐前胡素、和厚樸酚、珊瑚菜素、異歐前胡素、厚樸酚質(zhì)量濃度為2、200、23、27、12、8、12、24、13、8、18、20 μg·mL–1的混合溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品內(nèi)容物約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率：250 W，頻率：33 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3 指紋圖譜

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取藿香正氣軟膠囊（批號(hào)：20042211），按2.2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6 次，以歐前胡素峰為參照峰（S 峰），共有峰與S 峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD 均小于1.0%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取藿香正氣軟膠囊（批號(hào)：20042211），按2.2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件，分別于0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，以歐前胡素峰為S峰，共有峰與S峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD 均小于1.0%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取藿香正氣軟膠囊（批號(hào)：20042211），按2.2.2 項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件，以歐前胡素峰為S峰，共有峰與S 峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD 均小于1.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.4 指紋圖譜的建立及相似度評(píng)價(jià) 取15 批（S1～S15）的樣品，分別按2.2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。將15 批樣品色譜圖導(dǎo)入“中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（2012版）中進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，將S1 供試品色譜圖作為參考圖譜，采用中位數(shù)法生成對(duì)比圖譜，時(shí)間窗寬度為0.1，多點(diǎn)校正后自動(dòng)匹配生成供試品疊加圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜R（圖1）。通過(guò)對(duì)15 批樣品指紋圖譜進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，圖中有22 個(gè)峰為樣品溶液色譜圖的共有色譜峰，由于17 號(hào)峰與相鄰色譜峰分離較好、峰面積較大、tR較為穩(wěn)定，因此選擇17號(hào)峰（歐前胡素峰）為參照峰（圖2）。15 批藿香正氣軟膠囊樣品的指紋圖譜相似度均大于0.8，表明其質(zhì)量較為穩(wěn)定，化學(xué)成分具有良好的一致性。

圖1 藿香正氣軟膠囊供試品疊加圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜R

圖2 藿香正氣軟膠囊特征圖譜

2.3.5 主要色譜峰的指認(rèn) 根據(jù)供試品和混合對(duì)照品的tR和紫外光譜分析結(jié)果，共指認(rèn)15 個(gè)特征指紋峰（圖2）。

2.4 多指標(biāo)成分含量測(cè)定

2.4.1 線性關(guān)系考察 取各對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成甘草苷、柚皮蕓香苷、橙皮苷、水合氧化前胡素、白當(dāng)歸腦、歐前胡素、和厚樸酚、珊瑚菜素、異歐前胡素、厚樸酚質(zhì)量濃度分別為0.3、2.0、3.0、0.2、0.2、0.5、1.0、0.2、0.4、2.0 μg·mL–1的混合溶液，搖勻，稀釋6、15、30、60、150 倍，得系列混合對(duì)照品溶液，精密吸取上述系列混合對(duì)照品溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖（圖3）。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）、峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果顯示，各組分線性關(guān)系良好（表1）。

表1 藿香正氣軟膠囊中10個(gè)成分線性關(guān)系考察結(jié)果

圖3 對(duì)照品和藿香正氣軟膠囊HPLC圖

2.4.2 精密度試驗(yàn) 精密取同一混合對(duì)照品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，甘草苷、柚皮蕓香苷、橙皮苷、水合氧化前胡素、白當(dāng)歸腦、歐前胡素、和厚樸酚、珊瑚菜素、異歐前胡素、厚樸酚峰面積的RSD 分別為0.50%、0.12%、0.20%、0.96%、0.41%、0.64%、1.03%、0.68%、0.63%、0.35%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品（批號(hào)：20042211）溶液，分別于制備后0、2、4、6、8、12、24 h，按2.1 項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，甘草苷、柚皮蕓香苷、橙皮苷、水合氧化前胡素、白當(dāng)歸腦、歐前胡素、和厚樸酚、珊瑚菜素、異歐前胡素、厚樸酚峰面積的RSD 分別為0.89%、0.80%、1.50%、0.75%、0.29%、0.62%、1.87%、0.71%、0.23%、0.20%，表明供試品溶液24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 采用同一批藿香正氣軟膠囊（批號(hào)：20042211），按2.2.2 項(xiàng)下方法配制6 個(gè)樣品，按2.1 項(xiàng)下色譜條件測(cè)定其中10 個(gè)成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，甘草苷、柚皮蕓香苷、橙皮苷、水合氧化前胡素、白當(dāng)歸腦、歐前胡素、和厚樸酚、珊瑚菜素、異歐前胡素、厚樸酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD分別為0.62%、1.45%、0.60%、0.79%、1.76%、0.66%、1.46%、1.35%、1.81%、0.85%，表明方法重復(fù)性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 取同一批藿香正氣軟膠囊（批號(hào)：20042211）內(nèi)容物6 份，每份0.1 g，精密稱定，分別加入對(duì)照品溶液，計(jì)算回收率，如表2所示，方法的重復(fù)性良好。

表2 藿香正氣軟膠囊中10個(gè)成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.4.6 樣品含量測(cè)定 將15批樣品按2.2.2項(xiàng)下方法配制供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下條件進(jìn)樣，采用外標(biāo)法測(cè)定10 個(gè)成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（表3）。

表3 15批藿香正氣軟膠囊中10個(gè)成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù) mg·g–1

不同企業(yè)藿香正氣軟膠囊10 個(gè)成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的箱線圖（圖4）顯示，B 企業(yè)的甘草苷、和厚樸酚、厚樸酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)比A 企業(yè)高，其余7 個(gè)成分A 企業(yè)普遍較高，進(jìn)一步說(shuō)明不同企業(yè)的不同制備工藝對(duì)藿香正氣軟膠囊中指標(biāo)成分的含量有影響。

圖4 不同企業(yè)藿香正氣軟膠囊10個(gè)成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)的箱線圖（n=15）

2.5 化學(xué)模式識(shí)別

2.5.1 聚類(lèi)分析 采用SPSS 26.0 軟件，以共有峰峰面積為變量，對(duì)15 批樣品進(jìn)行聚類(lèi)分析，結(jié)果見(jiàn)圖5。根據(jù)樹(shù)狀圖可以看出，15 批藿香正氣軟膠囊樣品被分為2 個(gè)類(lèi)群。相同生產(chǎn)廠家的樣品聚為一類(lèi)，說(shuō)明同一企業(yè)不同批次的產(chǎn)品具有較高相似度，但不同企業(yè)的樣品存在差異。

圖5 15批藿香正氣軟膠囊的聚類(lèi)分析

2.5.2 主成分分析 將15 批樣品的共有峰峰面積數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS 26.0 軟件，判斷的依據(jù)是特征值與累積方差貢獻(xiàn)率，計(jì)算主成分的特征值與方差貢獻(xiàn)率，從而對(duì)主成分進(jìn)行提取[9]。以特征值>1 為提取標(biāo)準(zhǔn)，可得前2 個(gè)主成分的特征值分別為6.336 和1.975，方差貢獻(xiàn)率分別為63.362%和19.750%，累積方差貢獻(xiàn)率為83.112%，可以反映藿香正氣軟膠囊的綜合質(zhì)量，故選取前2 個(gè)主成分進(jìn)行評(píng)價(jià)。同時(shí)，采用SIMCA 14.1 軟件以10 個(gè)成分的含量數(shù)據(jù)構(gòu)建主成分分析模型（圖6），提取出2 個(gè)主成分的自變量擬合指數(shù)（R2X）為0.967，表明所建立的模型穩(wěn)定性較高。

圖6 15批藿香正氣軟膠囊的主成分分析得分

2.5.3 正交偏最小二乘法-判別分析 采用SIMCA 14.1 分析軟件，以15 批樣品共有峰峰面積為變量，采用正交偏最小二乘法-判別分析對(duì)15 批樣品進(jìn)行研究，得到了正交偏最小二乘法-判別分析模型（圖7）。與變量重要性投影（VIP）值相結(jié)合，篩選15 批樣品的主要共有峰。以VIP 值>1 為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出6 個(gè)差異性標(biāo)志物的色譜峰，分別為6 號(hào)峰（水合氧化前胡素）、18 號(hào)峰（和厚樸酚）、20 號(hào)峰（異歐前胡素）、19 號(hào)峰（珊瑚菜素）、21 號(hào)峰（厚樸酚）和1 號(hào)峰（甘草苷），上述成分對(duì)分類(lèi)的影響較大（圖8）。

圖7 不同企業(yè)藿香正氣軟膠囊的正交偏最小二乘法-判別分析

圖8 15批藿香正氣軟膠囊10個(gè)共有峰的VIP值（±s,n=15）

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

在前期研究中，通過(guò)改變流動(dòng)相系統(tǒng)（乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水溶液等）、柱溫（28、30、32 ℃），對(duì)色譜條件進(jìn)行考察，結(jié)果顯示，當(dāng)流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸水溶液（梯度洗脫）、柱溫為30 ℃、流速為1 mL·min–1時(shí)所得色譜圖的基線平穩(wěn)、色譜峰的分離效果較好。分析《中國(guó)藥典》2020 年版中白芷、陳皮、厚樸、北蒼術(shù)、茅蒼術(shù)藥材含量測(cè)定項(xiàng)下要求發(fā)現(xiàn)，本研究中22 個(gè)成分的檢測(cè)波長(zhǎng)有較大差異，因此選擇采用梯度波長(zhǎng)（254、283 nm）整合不同tR最佳色譜信息，根據(jù)《中國(guó)藥典》2020 年版要求及前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定采用2.1 項(xiàng)下色譜條件。

3.2 耐用性考察

本研究考察了不同色譜柱[COSMOSIL 5 C18-MS-Ⅱ（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Capcell pak C18MG Ⅱ（250 mm×4.6 mm，5 μm）及SHIMADZU VP-ODSC18（250 mm×4.6 mm，5 μm）]、不同流速（0.9、1.0、1.1 mL·min–1）、不同柱溫（25、30、35 ℃）等對(duì)藿香正氣軟膠囊指紋圖譜和10 個(gè)成分含量測(cè)定結(jié)果的影響，發(fā)現(xiàn)色譜條件的變化對(duì)各成分含量測(cè)定結(jié)果影響不大，說(shuō)明本方法具有較好的耐用性。

3.3 結(jié)果分析

采用中藥指紋圖譜技術(shù)建立了15 批藿香正氣軟膠囊的HPLC 指紋圖譜，并鑒定出22 個(gè)共有峰，通過(guò)與混合對(duì)照品色譜圖進(jìn)行比對(duì)，指認(rèn)出15 個(gè)共有成分。對(duì)15 批樣品進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，結(jié)果表明，15批樣品與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜相似度都在0.8 以上，說(shuō)明了不同批樣品在化學(xué)組成上有很好的一致性。聚類(lèi)分析結(jié)果顯示，15 批藿香正氣軟膠囊樣品可分為2類(lèi)，相同生產(chǎn)企業(yè)的樣品分為一類(lèi)，主成分分析結(jié)果與其一致。采用正交偏最小二乘法-判別分析篩選得到水合氧化前胡素、和厚樸酚、異歐前胡素、珊瑚菜素、厚樸酚和甘草苷6 個(gè)差異性成分，可作為評(píng)價(jià)不同批次藿香正氣軟膠囊的差異性標(biāo)志物。

4 結(jié)論

本研究以15 批藿香正氣軟膠囊樣品為研究對(duì)象，建立指紋圖譜及多成分含量測(cè)定方法，該方法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、重復(fù)性好，能夠表征藿香正氣軟膠囊的整體質(zhì)量，可用于藿香正氣軟膠囊的質(zhì)量控制。采用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對(duì)不同批次藿香正氣軟膠囊的質(zhì)量進(jìn)行分析，篩選出不同批次藿香正氣軟膠囊質(zhì)量差異性標(biāo)志成分，本研究結(jié)果可為藿香正氣軟膠囊的進(jìn)一步研究提供參考。

[利益沖突]本文不存在任何利益沖突。