豬ESM-1 基因的結構及其遺傳特性分析

鄭美麗 ，陳少康 ，孫建華 ，李 爽 ，郭 峰 ，王曉鳳

（1.北京市畜牧總站，北京 100107；2.北京市通州區(qū)動物疫病預防控制中心，北京 101199）

內皮特異性分子1（endothelialspecf ic molecule-1，ESM-1），最初是由Lassalle等發(fā)現的。 Bechard證實了ESM-1是作為一種可溶性的蛋白多糖-硫酸軟骨素分泌至血液中，又稱為Endocan。早期文獻報道了ESM-1基因的結構與類胰島素樣生長因子結合蛋白達到32%相同和55.3%相似，尤其是該基因N端結構與IGFBP家族高度同源。而IGFBP家族作為IGF家族的構成，已經有多個成員被證明與機體的生長發(fā)育密切相關。筆者對ESM-1基因的結構以及在不同豬種中的遺傳特性進行了初步探究，以期為深入了解和研究ESM-1基因的結構和功能，將該基因作為影響豬肌肉生長發(fā)育的關鍵基因的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣本的采集

從實驗室群體樣本中選取了三個國外代表性豬種（大白、長白、杜洛克），中國野豬（東北野豬）和中國地方豬種（二花臉、上高豬、民豬、內江豬、香豬）5個代表性豬種，每個豬種選取的個數如表1，試驗樣本為肌肉組織。

表1 樣品選取個數

1.2 試驗方法

1.2.1ESM-1基因的完整mRNA序列的獲得

基于NCBI預測的ESM-1基因的CDS區(qū)序列，通過PCR和RACE試驗獲得ESM-1基因的完整mRNA序列。試驗中所用到的引物序列如表2。

表2 引物序列

1.2.2 外顯子SNPs的檢測

以克隆測序得到的ESM-1基因的mRNA序列為模板，利用軟件primer5.0設計引物如表3，引物位置編碼按照以CDS區(qū)的ATG為0，到TGA結束為552 bp，ATG之前為“-”TGA后為“+”。

表3 引物序列

2 試驗結果

2.1 豬ESM-1 基因的克隆

2.1.1 CDS區(qū)的克隆測序

根據NCBI上可查的豬ESM-1基因的預測CDS區(qū)序列，設計引物，PCR擴增，所得產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測為單一明亮條帶，如圖1。將產物回收純化并連接轉化后，測序并將所得到的無載體序列與NCBI上序列進行比對分析，獲得了豬ESM-1基因的CDS區(qū)準確序列552 bp。

圖1 豬ESM-1 基因CDS 區(qū)擴增產物

2.1.2 mRNA的克隆測序

利用RACE技術并結合試劑盒中的巢式引物獲得無載體序列的5'UTR和3'UTR序列，分別為439 bp和1 447 bp，如圖2。經克隆測序及比對分析，確定為豬ESM-1基因的5'及3'UTR區(qū)域。結合前面試驗得到的CDS區(qū)序列，經DNAMAN及ChromaPro拼接，形成全長2 437 bp的豬ESM-1基因的mRNA序列。在NCBI上將所得序列與豬的基因組信息進行了比對，序列全部符合，并且內含子邊界符合“ GT-AG”法則。

圖2 豬ESM-1 基因5'RACE（左）及 3'RACE（右）擴增產物

2.2 外顯子SNPs 的檢測

用3 中的7 對引物擴增，以NCBI上公布的豬基因組序列為野生型，經測序比對，在編碼區(qū)和外顯子發(fā)現了SNP位點，檢測到的SNP位點如表4。進一步增加樣本數量，進行群體驗證，并通過酶切PCR產物，部分瓊脂糖凝膠電泳圖如圖3，發(fā)現這幾個SNP位點在不同豬種之間沒有顯著性突變差異，其CDS區(qū)無有意義突變。具體基因型及基因頻率如表5。

圖3 部分PCR 產物酶切后瓊脂糖凝膠電泳圖

表4 檢測到的突變信息

表5 各基因型及基因頻率（1）第一外顯子第8 位堿基突變位點

3 討論與分析

目前豬的ESM-1基因在NCBI上只有預測的CDS區(qū)序列，而在本研究中，筆者利用了RACE技術，首次得到了豬ESM-1基因的完整mRNA序列，通過比對發(fā)現，所得到的序列全部符合，進一步分析該基因的結構，可知豬ESM-1基因由三個外顯子組成，CDS區(qū)為552 bp，5'UTR和3'UTR序列，分別為439 bp和1 447 bp，如圖4。

圖4 豬ESM-1 基因mRNA 的結構示意圖

筆者針對基因的三個外顯子進一步做了遺傳多態(tài)性分析，希望為該基因的功能研究提供一定的分子基礎。單核苷酸的多態(tài)性（Single Nucleotide Polymorphisms，SNP），主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列的多態(tài)性。SNP所表現的多態(tài)性只涉及到單個堿基的變異，這種變異可由單個堿基的轉換（transition）或顛換（transversion）所引起，也可由堿基的插入或缺失所致。在基因組的DNA中，任何堿基均有可能發(fā)生變異，因此SNP既有可能在基因序列內，也有可能在基因以外的非編碼序列上。據目前研究可知，位于編碼區(qū)內的SNP（coding SNP，cSNP）比較少，因為在外顯子內，其變異率僅僅是周圍序列的1/5，但它在遺傳學方面的研究中卻具有重要意義，因此cSNP的研究更受關注。另一方面，從對生物的遺傳性狀影響上來看，cSNP又可分為2種：一種是同義cSNP（synonymous cSN），即SNP所致的編碼序列的改變并不影響其所翻譯的蛋白質的氨基酸序列，突變堿基與未突變堿基的含義相同；另一種是非同義cSNP（non-synonymous cSNP），指堿基序列的改變可使以其為藍本翻譯的蛋白質序列發(fā)生改變，從而影響了蛋白質的功能，這種改變常是導致生物性狀改變的直接原因。

雖然ESM-1基因在人和小鼠上的研究比較多，但目前針對ESM-1基因的遺傳多態(tài)性研究幾乎為空白，NCBI的數據庫中也未查到相關記錄。而筆者第一次針對豬的ESM-1基因進行了遺傳多態(tài)性分析，并在外顯子上發(fā)現了兩個堿基突變位點。筆者根據1986年中國農業(yè)科學院畜牧研究所張仲葛主持編寫的《中國豬品種志》，從中國六大地方豬（華北型、華中型、華南型、江海型、西南型、高原型）中盡量選取了代表性豬種，同時也選取東北野豬作為中國野豬的代表，大白、長白和杜洛克三種國外代表性豬種，對ESM-1基因在不同豬種中的遺傳多樣性進行了分析，試驗檢測到的兩個突變位點分別位于5'UTR和CDS區(qū)上，但對后者分析，其突變并不會導致蛋白質的改變，為同義突變，因此認為豬ESM-1基因的CDS區(qū)具有較高的保守型，最后通過對兩個SNPs位點進行群體驗證，發(fā)現兩處突變都沒有明顯的品種間差異。

4 研究進展與展望

ESM-1是作為一種可溶性的蛋白多糖-硫酸軟骨素分泌至血液中，又稱為Endocan。ESM-1由單一基因編碼，定位在人的第5號常染色體上，mRNA全長2 090 bp，共由3個外顯子組成。其中外顯子2編碼一個富含基因F（113FPFFQY I 18）結構的特殊區(qū)域，該區(qū)域可能是ESM-1基因的功能區(qū)域。最大的外顯子3編碼ESM-1蛋白C端33個氨基酸區(qū)域，該區(qū)域含有提前終止密碼子和137位Ser O糖基化位點，該位點以共價鍵的形式連接一條黏多糖單鏈，也稱GAG鏈或DS單鏈，該黏多糖單鏈與ESM-1的多種生物學功能緊密相關。目前的研究表明，ESM-1基因的mRNA能編碼兩種不同的蛋白，如圖5。一種是ESM-1，該蛋白是一種相對分子質量為50×1 000的可溶性蛋白聚糖，是一條成熟的包含165氨基酸的核心蛋白，包含一個F113和F116的苯丙氨酸富集區(qū)，以及以共價鍵的形式連接在第137絲氨酸殘基上的一條黏多糖單鏈。

圖5 豬ESM-1 基因mRNA 的結構示意圖

ESM-1基因目前的研究主要集中人和鼠上。首先早期試驗證明該基因有助于血管內皮細胞的功能，并在內皮細胞依賴性病理過程中起一定的作用。Mark Aitkenhead等發(fā)現ESM-1基因在血管生成過程中發(fā)揮著重要的作用。一些涉及生長和血管生成的因子已經顯示對ESM-1基因的表達有影響，同時有文獻報道指出肝細胞生長因子（HGF）和血管內皮生長因子（VEGF）共同作用會導致該基因在細胞內的表達上調。有研究證明HHEX對血管的增生以及塑形都有著重大的作用，HHEX能通過減少血管內皮細胞生長因子受體（vascular endothelial growth factor receptor-1，VEGFR）如VEGFR-1、VEGFR-2等和血管生成相關的一些重要因子的表達來參與血管生成的調節(jié)，而研究者同時發(fā)現同源異形框因子（HHEX）可通過一個高度保守的HHEX反應元件直接抑制ESM-1的表達。那么，HHEX 對VEGFR-1和VEGFR-2等血管增生中重要因素的抑制作用是否與其直接抑制ESM-1的表達有關，這還有待進一步研究。

也有相關文獻指出ESM-1基因與胰島素樣生長因子相關，能夠促進細胞的生長和增殖。在文獻中Philippe Lassalle等指出，該基因的N端與類胰島素樣生長因子結合蛋白達到32%相同和55.3%相似。而IGFs生長因子在血清，細胞外液及細胞培養(yǎng)液中都與特異性的結合蛋白（Binding Proteins，BPs）結合以無活性的復合物形式存在，具有延長循環(huán)水平的IGFs半衰期和穩(wěn)定IGFs血清濃度的作用，因此進一步推測ESM-1基因對生命體的生長發(fā)育有影響。

最后ESM-1研究比較多的一方面即其與各種腫瘤的發(fā)生有關。一些腫瘤如腎、乳腺、子宮以及直腸等腫瘤組織中存在內皮細胞特異性分子（ESM-1）表達的上調，ESM-1基因在腫瘤血管生產和腫瘤生長過程中發(fā)揮著重要作用。該基因能通過腫瘤相關性的炎癥、血管增生、淋巴管增生、腫瘤細胞本身等方面對腫瘤進行調節(jié)。有文獻探究了ESM-1基因在肝癌發(fā)生中，影響腫瘤細胞的存活、遷移和遷徙。而腫瘤的產生本身就是一種細胞的異常增生現象，這也進一步證明ESM-1基因對細胞的生長具有重要的作用。Grigoriu 等的研究發(fā)現，肺癌患者血清中的ESM-1濃度，不僅與腫瘤的類型、分期和患者的預后、腫瘤的進展相關，更能在一定程度上指導肺癌的治療。同樣，Leroy 等發(fā)現腎透明細胞癌患者血清中，ESM-1的濃度可作為腎透明細胞癌患者術后治療和抗血管增生治療的一個有效監(jiān)測指標。在諸如肺癌、乳腺癌、子宮癌、腎癌、涎腺腺樣囊性癌、肝癌、腦神經膠質細胞瘤等許多人體實體腫瘤中ESM-1都高表達，同時也發(fā)現該因子的高表達與腫瘤的預后、轉移、血管增生等因素有關。ESM-1與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要因素（如慢性炎癥、腫瘤細胞本身、血管增生、淋巴管增生等）都有著重要的關聯(lián)。如果能有效地抑制ESM-1的表達，就有可能從多方面對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展進行抑制。因此，開發(fā)針對ESM-1的靶向治療藥物有可能開拓腫瘤治療的一個新篇章。

目前，對于ESM-1基因表達的研究還處于資料積累的階段，關于其對家畜尤其是豬的肌肉生長影響的研究還較少，該基因是否可以調控豬的肌肉生長發(fā)育，影響豬的生產性狀，仍需進一步研究。