竹鹽對便秘小鼠的影響及其機制研究

肖敏，劉達，游秋云，但漢雄，尤朋濤

1.湖北中醫藥大學藥學院，中藥資源與中藥化學省級重點實驗室（武漢 430065）；2.武漢綠時代創新科技有限公司（武漢 430012）

便秘是一種常見的胃腸功能性疾病，慢傳輸型便秘（slow transit constipation，STC）是便秘中最常見的類型[1]。便秘主要臨床表現是大便次數減少、糞便干硬、排便困難。它在各個年齡段人群中普遍存在，在老年人和女性中發病率越來越高，其病情會反復發作，難以治愈，嚴重影響了患者的生活質量[2]。STC現有治療藥物主要有緩瀉劑如開塞露和促動力劑如枸櫞酸莫沙必利，藥物治療便秘雖然短期內療效較好，但是長期使用會引起藥物依賴、胃腸動力不足等多種不良反應[3]。因此，尋找安全有效的天然活性物質在治療和緩解慢傳輸型便秘具有重要的意義。

竹鹽是原鹽經特殊加工得到的保健食用鹽。將原鹽放進竹筒封上黃泥，在特制的窯中進行煅烤，反復經過升溫、保溫、再升溫、再保溫等過程，可得到一烤竹鹽至八烤竹鹽，如果想要得到純度較高的九烤竹鹽，需要將爐溫升到1 300 ℃讓鹽粉熔化成液態，氣化蒸發掉其中的重金屬氯化物，并清理出其他雜質的懸浮物和深沉物[4]。馮霞等[5]檢測發現竹鹽的鈣、鎂、鐵、錳、磷、硫、鉀含量均高于海鹽。因此，竹鹽比一般食鹽也就多了更多的養生與保健的功效。竹鹽具有弱堿性，可以中和機體內酸性代謝產物，被譽為“自然界解毒之王”和“藥用鹽”。現已有研究結果表明，竹鹽具有潛在的抗癌作用[6]、抗炎作用[7]、抗皮膚衰老作用[8]、增強免疫作用[9]等，并提示竹鹽有助于緩解消化系統疾病[10]。Huang等[11]發現竹鹽含有的成分之一硫化氫，外源應用硫化氫在生理相關濃度下可以促進體外成熟胃起搏細胞Cajal間質細胞（interstitial cells of cajal，ICC）的增殖。ICC的增殖和存活與c-kit原癌基因（c-kit proto-oncogene protein，c-kit）和配體干細胞因子（stem cell factor，SCF）結合后激活信號通路有關[12]。Ikarasgi等[13]研究發現導瀉劑硫酸鎂可導致腸HT-29細胞水通道蛋白3（aquaporin 3，AQP3）表達增多，可能的機制是鎂離子引起腺苷酸環化酶活化，催化產生環磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP），引起蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）的活化，導致環磷腺苷效應元件結合蛋白磷酸化，促進了AQP3的表達。周永學等[14]發現血管活性腸肽（vasoactive intestinal peptide，VIP）靜脈注射能夠激活cAMP/PKA通路，促進AQP3的表達，影響便秘大鼠腸道水液代謝，進而改善便秘癥狀。此研究采用鹽酸洛哌丁胺誘導STC小鼠模型，檢測血清中胃腸激素、神經遞質、結腸中相關蛋白和基因表達水平，觀察竹鹽對便秘小鼠的影響，并基于SCF/c-kit和VIP/PKA/cAMP/AQP3通路初步探討其作用機制，以期為開發相關功能性食品提供理論基礎和科學依據。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

60只昆明SPF級小鼠，雌性，體重26～28 g（湖北省疾病預防控制中心），許可證號：SCXK（鄂）2020-0018。動物進入實驗室，適應性喂養1周后開始試驗。實驗室通氣良好，室溫25±2 ℃，相對濕度50%～70%。

九烤竹鹽（湖北省中科鹽谷科技有限公司），為粉末狀，于4 ℃冰箱備用。枸櫞酸莫沙必利片（國藥準字J20140149，蘇州住友制藥有限公司）；c-Kit抗體（批號AF6153）、VIP抗體（批號DF6627）、PKA抗體（批號AF7746）、AQP3抗體（批號AF5222）：江蘇親科生物研究中心有限公司；GAPDH抗體（批號97166T）、二抗兔抗（批號7074P2）：美國Cell Signaling Technology公司；小鼠胃泌素（gastrin，Gas）酶聯免疫分析試劑盒（批號A119258-96T）、小鼠P物質（substance-P，SP）酶聯免疫分析試劑盒（批號A105714-96T）：上海撫生實業有限公司；一氧化氮（nitric oxide，NO）檢測試劑盒（批號A012-1）：南京建成生物工程研究所；阿拉伯樹膠（批號A108975）、醫藥級別活性炭（批號A304261）、鹽酸洛哌丁胺（批號L129465）：上海阿拉丁集團有限公司；RIPA-PMSF裂解緩沖液（批號P0013B）：上海Beyotime公司。

1.2 儀器與設備

酶標儀（SPARK10M，美國瑞士帝肯有限公司）；萬分之一天平（AL-204，美國特勒-托利多儀器有限公司）；qPCR儀（Step One Plus，美國Applied Biosystems公司）；蛋白電泳儀（Power Pac，美國Bio-Rad有限公司）；成像系統（NIKONDS-U3，日本尼康公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 便秘小鼠模型的建立與給藥

60只雌鼠，隨機分為空白組、模型組、低中高給藥組、陽性對照組，每組各10只。適應性喂養7 d后，空白組灌胃等量0.9%氯化鈉注射液，其余組給予鹽酸洛哌丁胺10 mg/kg造便秘模型，連續7 d后，從第8天開始，灌胃鹽酸洛哌丁胺1 h后，給藥組灌胃低中高濃度的竹鹽（0.5，1.0和1.5 g/kg），空白組和模型組灌胃等量0.9%氯化鈉注射液，陽性對照組灌胃枸櫞酸莫沙必利片2.5 mg/kg，連續干預7 d。

1.3.2 小鼠6 h排便粒數統計和小腸推進率的測量

第14天給藥后分開飼養，統計6 h的排便粒數。禁食不禁水24 h，灌胃0.2 mL的5%活性炭混懸液，灌胃后開始計時，30 min后處死收集小腸，測量長度，幽門至回盲處的距離計為腸管總長度，幽門至炭末汁前端處計為炭末推進長度，計算小腸推進率，按式（1）計算。

1.3.3 神經遞質及胃腸激素檢測

將小鼠麻醉后眼眶取血，所采血液在低溫高速離心機上以3 000 r/min的轉速，在4 ℃的條件下離心10 min后收集上清，放入-80 ℃冰箱。使用對應試劑盒檢測小鼠血清中胃泌素、P物質、一氧化氮含量，具體步驟參考試劑盒說明書。

1.3.4 便秘小鼠結腸組織的病理觀察

剪取小鼠近肛門部位長約2 cm的結腸組織，采用生理鹽水沖洗，置10%中性甲醛溶液中固定，常規石蠟切片。蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）染色后，顯微觀察結腸組織的病理學變化。

1.3.5 實時熒光定量法（real time quantitative PCR，RT-qPCR）檢測小鼠結腸組織中相關mRNA水平

取50 mg各組小鼠的結腸組織，使用預冷的磷酸鹽緩沖鹽溶液（Phosphate Buffered Saline，PBS）清洗3次，剪成細碎小塊，置于組織勻漿機中，得組織勻漿。RNA-easy裂解液提取RNA。使用紫外分光光度計檢測各組RNA濃度，按照反轉錄試劑盒說明書操作將總RNA反轉錄合成cDNA。以cDNA為模板對進行PCR擴增，引物序列如表1所示，檢測循環數（Ct值），以GAPDH與模型對照組為對照計算ΔΔCt，采用2-ΔΔCt法計算基因的相對表達量。

表1 引物序列

1.3.6 蛋白質印跡法檢測相關蛋白的表達水平

采用蛋白質印跡法檢測。將蛋白酶抑制劑與RIPA裂解液按照體積比1∶100混合均勻，備用。取各60 mg組凍存的結腸組織，加入100 μL裂解液混合物裂解，用眼科剪將組織剪碎，隨后用勻漿器對組織碎片勻漿，放置30 min，使其充分裂解。以12 000 r/min離心10 min，取上清液，以BCA法（Bicinchoninic acid，BCA）測定蛋白含量。蛋白經煮沸變性后，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后轉膜，以5%的牛血清白蛋白封閉液封閉2 h；以Tris緩沖鹽溶液加吐溫20（Tris Buffered Saline+Tween-20，TBST）洗膜3次，加入VIP、PKA、AQP3、c-kit、GAPDH一抗（稀釋度均為1∶1 000），于4 ℃孵育過夜；以TBST洗膜3次，加入二抗（稀釋度為1∶1 000），室溫孵育2 h；以TBST洗膜3次，加入enhanced chemiluminescence（ECL）顯色劑，于化學發光儀上掃描和成像。采用Image J v1.8.0軟件對條帶灰度值進行分析，以目的蛋白與內參GAPDH灰度值的比值表示目的蛋白的表達水平。

1.4 統計學方法

試驗結果采用Graphpad Prism 7.00數據分析軟件，采用Studentt-test檢驗比較組間差異顯著性，以P＜0.05作為具有統計學顯著性差異的標準。

2 結果與分析

2.1 竹鹽對便秘小鼠6 h排便數和小腸推進率的影響

如表2所示，與空白組相比，模型組6 h的排便粒數顯著減少，腸推進率顯著降低，說明灌胃鹽酸洛哌丁胺成功誘導了小鼠的便秘癥狀。經過竹鹽和枸櫞酸莫沙必利干預后，6 h的排便粒數顯著增加，腸推進率顯著升高，說明竹鹽和陽性藥枸櫞酸莫沙必利對鹽酸洛哌丁胺誘導的便秘具有一定緩解作用。

表2 竹鹽對便秘小鼠6小時排便粒數和小腸推進率的影響（n=8）

2.2 竹鹽對便秘小鼠血清中Gas、SP、NO濃度的影響

神經遞質可調節胃腸道的運動功能，分為興奮性神經遞質和抑制性神經遞質。SP是興奮性遞質，收縮平滑肌，促進胃腸運動[15]；NO是抑制性遞質，分泌增多可減慢結腸蠕動，導致便秘[16]。Gas是胃腸激素，可增強結腸平滑肌的收縮，促進結腸運動[17]。研究顯示，脾腎陽虛型STC患者血清SP含量降低，NO含量增高[18]；STC大鼠血清中SP和Gas明顯減少[19]。如表3所示，試驗模型組與空白組比較，血清中Gas、SP濃度明顯降低（P＜0.01），NO濃度明顯增高（P＜0.01），說明此研究使用鹽酸洛哌丁胺誘導成功建立STC小鼠模型。與模型組比較，除了竹鹽低劑量組的腸推進率沒有明顯差異，竹鹽中高劑量組和枸櫞酸莫沙必利組的腸推進率明顯增加（P＜0.01），說明竹鹽緩解了鹽酸洛哌丁胺誘導的便秘。

表3 竹鹽對小鼠腸推進率和血清中Gas、SP、NO的影響（n=8）

2.3 竹鹽對便秘小鼠結腸組織形態的影響

如圖1所示，經HE染色發現，與空白組相比，模型組結腸黏膜出現紊亂表征，肌層變薄，杯狀細胞減少，且有炎性聚集。說明洛哌丁胺誘導的便秘對結腸黏膜組織有一定損害。竹鹽低中高劑量組和枸櫞酸莫沙必利組結腸組織黏膜排列趨向正常，肌層逐漸變厚，杯狀細胞逐漸增多，無炎性聚集。結腸中上述病理學變化在竹鹽的干預下出現不同程度改善，說明竹鹽緩解了便秘導致的黏膜損傷。

圖1 各組小鼠結腸組織形態學的病理變化（×100）

2.4 竹鹽對便秘小鼠結腸組織SCF mRNA和c-kit蛋白表達水平的影響

經蛋白免疫印跡分析發現，模型組結腸組織中的c-Kit蛋白表達較空白組明顯減少（P＜0.05），經中高劑量的竹鹽和陽性藥物枸櫞酸莫沙必利干預后，c-Kit表達逐漸增加（P＜0.05）。RT-qPCR分析發現模型組腸道組織中SCF的mRNA相對表達量較空白組減少（P＜0.05），經低、中、高劑量竹鹽和枸櫞酸莫沙必利干預后，便秘模型小鼠腸道組織中SCF mRNA的表達量都有了顯著提高（P＜0.05）。ICC是胃腸道起搏器區的起搏細胞[20]，已有研究表明，STC患者結腸ICC顯著降低[21]；槐黃丸治療后STC大鼠便秘緩解后結腸中c-kit和SCF的基因和蛋白水平顯著升高[22]。如圖2和圖3所示，此試驗發現經中、高劑量竹鹽干預后可以顯著提高便秘模型小鼠腸道組織中c-Kit蛋白的表達量和SCF mRNA的表達量，這說明竹鹽可能通過c-kit/SCF通路促進ICC增殖，進而起到改善腸道平滑肌收縮而緩解便秘癥狀的作用。

圖2 SCF mRNA在結腸組織中的表達水平（n=3）

圖3 c-kit蛋白在結腸組織中的表達水平

2.5 竹鹽對便秘小鼠結腸組織cAMP mRNA和VIP、PKA、AQP3蛋白表達水平的影響

RT-qPCR分析發現模型組腸道組織中cAMP的mRNA相對表達量較空白組極顯著減少（P＜0.01），經低、中、高劑量的竹鹽和枸櫞酸莫沙必利干預后，便秘模型小鼠腸道組織中cAMP的mRNA的表達量都有了顯著提高（P＜0.05或P＜0.01），如圖4所示。經WB檢測發現，與空白組相比，模型組結腸中VIP、PKA、AQP3蛋白表達明顯減少（P＜0.05），竹鹽低劑量組較模型組VIP、PKA、AQP3蛋白表達無顯著性差異，竹鹽中高劑量組和枸櫞酸莫沙必利組VIP、PKA、AQP3蛋白表達水平與模型組相比明顯升高（P＜0.05或P＜0.01），如圖5所示。VIP是一種由上端小腸內分泌細胞分泌的胃腸激素，可緩解平滑肌緊張、保護胃腸道黏膜、調節腸道吸收。Tomita[23]和King等[24]研究顯示STC患者的直腸黏膜和黏膜下組織SP活性明顯降低，結腸VIP水平明顯降低。有研究表明，VIP含量的降低，可能會引起結腸出現過度的階段性蠕動，減弱結腸的有效推動[25]。AQP3主要分布于從口腔到胃以及從結腸到肛門段的消化道黏膜上皮，參與胃腸道水分運輸的調節[26]。Zhi等[27]研究顯示慢傳輸便秘模型大鼠近端結腸AQP3表達下降。Itoh等[28]研究發現VIP可通過影響腸上皮細胞中水通道蛋白3的表達來調節腸道水代謝，細胞內的cAMP與PKA結合，調節細胞功能，發揮相應的生理作用。周永學等[29]提出了VIP/cAMP/PKA/AQP3水液代謝通路。Cong等[30]發現便秘大鼠腸道水代謝的機制與VIP/cAMP/PKA/AQP3信號通路有關。此研究中高劑量的竹鹽對STC小鼠進行干預后，VIP、PKA、AQP3的蛋白表達和cAMP的mRNA表達較模型組都有了顯著增高。說明竹鹽抗便秘作用可能與VIP/cAMP/PKA/AQP3信號通路有關。

圖4 cAMP mRNA在結腸組織中的表達水平（n=3）

圖5 VIP、PKA、AQP3蛋白在結腸組織中的表達水平

3 結論

此次研究結果顯示：與模型組相比，竹鹽中高劑量組和枸櫞酸莫沙必利組中STC小鼠結腸組織肌層逐漸變厚，杯狀細胞增多，緩解了便秘導致的黏膜損傷；與模型組相比，中高劑量竹鹽和枸櫞酸干預后明顯增加了STC小鼠腸推進率和血清中Gas和SP含量，減少了NO含量，促進了結腸組織中c-kit、VIP、PKA、AQP3蛋白表達水平和SCF、cAMP的mRNA的相對表達，均有顯著性差異（P＜0.05或P＜0.01）。竹鹽對鹽酸洛哌丁胺誘導的STC小鼠具有通便作用，可能通過調節SCF/c-kit和VIP/cAMP/PKA/AQP3信號通路達到緩解便秘效果，該研究為開發相關功能性食品提供理論基礎和科學依據。

鄧志敢等[31]發現隨著竹鹽煅烤次數的增加，有益礦物元素鈣、鎂、磷、鉀、鐵含量在竹鹽內不斷富集。而所用竹鹽經過九次煅烤，含有大量礦物質，其中包括鎂離子和硫化物，由此推測竹鹽基于VIP/cAMP/PKA/AQP3通路的抗便秘作用可能與其含有大量鎂離子有關，基于SCF/c-kit通路對便秘的緩解作用可能與其含有硫化物有關。竹鹽中是否存在其他助于緩解便秘的成分還有待于進一步分析。

綜上所述，九烤竹鹽可能通過激活SCF/c-kit通路和VIP/cAMP/PKA/AQP3信號通路改善STC模型小鼠的便秘癥狀和腸道功能。該研究結果為開發竹鹽相關功能性食品提供理論基礎和科學依據。