circRAF1調節人卵巢顆粒細胞的增殖與凋亡

李文昕 盧敏君 林莉 劉月琴 朱小蘭

江蘇大學第四附屬醫院（鎮江市婦幼保健院）生殖醫學中心，中心實驗室（江蘇鎮江 212001）

女性在40 歲之前出現卵巢功能障礙，引起閉經及相關伴隨癥狀，稱為早發性卵巢功能不全（primary ovarian insufficiency， POI）［1］。據統計，POI 在一般人群中的發病率約為1%［2］。在社會層面上，一直存在著推遲生育的趨勢，但女性的卵巢儲備功能卻隨年齡增長而逐步下降［3］。通過經典的序貫激素替代療法很難恢復卵巢功能，且伴有副作用［4］。因此，挖掘POI 發病（或發生）的相關因素，發現POI 的潛在生物標志物，對高危人群進行早期預防與干預顯得尤為重要。

卵巢儲備功能減退和卵母細胞質量下降是POI 患者低妊娠率最重要的原因［5］，卵巢顆粒細胞（GCs）可以為卵母細胞成熟提供必要的營養支持和微環境［6］。在哺乳動物卵巢中，不到1%的卵泡排卵，其余99%的卵泡在排卵前會發生閉鎖［7］，而GCs 凋亡在卵泡閉鎖中起主要作用［8］。最近的研究表明，GCs 的功能障礙主要表現為細胞增殖減少、凋亡增加［9］，找到GCs 增殖及凋亡的關鍵調節因子可能為POI 的防治提供新的策略。

隨著RNA 測序的發展，越來越多的環狀RNA（circRNAs）被發現和鑒定。與以5'帽端和3'尾端終止的線性RNA 不同，circRNAs 既沒有5'至3'極性，也沒有聚腺苷酸化尾巴［10］，不易被RNase R 降解［11］且擁有更長的半衰期［12］。此外，因circRNAs具有組織特異性且高度保守，往往被認為是各種疾病的潛在生物標志物［13-14］。circRNAs 已被證實參與調節包括細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲等各種生物過程［15］。近年來對于circRNAs的研究日益增多，但circRNAs 與POI 的相關性及其調節POI 的機制還鮮見報道。因此，尋找與POI 相關的circRNAs并闡明其在POI 中的作用，有助于POI 的早期預防與干預。

本研究在POI 患者的GCs 及血清中發現了共同下調的circRAF1 并探究其生物來源。此外，本研究結果表明，circRAF1 的表達與臨床卵巢功能指標的血清水平相關，并通過干擾KGN 細胞中circRAF1 的表達證實了其在GCs 增殖和凋亡中的調節作用，為尋找POI 的新型生物學標記物提供理論基礎。

1 資料與方法

1.1 資料來源選取2022 年6 月至2023 年7 月于江蘇大學附屬第四人民醫院生殖醫學中心行體外受精和（或）卵母細胞胞漿內單精子顯微注射-胚胎移植（in vitrofertilization or intracytoplasmic sperm injection and embryo transfer，IVF/ICSI-ET）的POI 患者（POI 組）50 例；同期選取因男方和（或）輸卵管因素在本中心行IVF/ICSI-ET 的卵巢儲備功能正常的患者（NC 組）50 例作為對照，2 組年齡及BMI相比較，差異無統計學意義（P> 0.05），具有可比性。本研究中所有POI 患者均由主治及以上醫師明確診斷。收集患者的GCs 和血清樣本（月經期第2～3 天清晨空腹抽取）。經江蘇大學附屬第四人民醫院倫理委員會批準，符合倫理學要求，所有受試者均自愿參加并簽署書面知情同意書。患者基本信息見表1。

表1 本研究的患者信息Tab.1 Patients information for this study ±s

表1 本研究的患者信息Tab.1 Patients information for this study ±s

注：BMI，體質量指數；AMH，抗苗勒管激素；E2，雌二醇；FSH，卵泡刺激素；LH，促黃體生成素；AFC，竇卵泡計數

P值0.458 0.513 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001項目年齡（歲）BMI（kg/m2）AMH（ng/mL）E2（pmol/L）FSH（IU/L）LH（IU/L）AFC（個）NC組（n = 50）31.50±5.50 21.10±2.84 4.94±3.90 181.00±91.00 6.26±3.68 6.58±4.33 12.50±5.50 POI組（n = 50）33.00±5.00 21.53±2.57 0.50±0.49 80.50±67.50 32.19±7.11 22.55±11.52 5.00±4.00

納入標準：（1）符合POI 診斷標準［16］：女性在40 歲之前出現月經稀發/閉經> 4 個月，間隔1 個月以上檢測兩次FSH 水平> 25 U/L；（2）臨床資料保存完整者；（3）未伴有其他任何疾病。

排除標準：（1）伴有其他內分泌和（或）免疫疾病者；（2）伴有嚴重的心血管、腎臟等疾病者；（3）既往3 個月服用激素者。

1.2 方法

1.2.1 GCs 的提取在取卵期間收集直徑為16～20 mm的卵泡進行進一步分析。將樣品4 000 r/min離心4 min，去除大部分上清以獲取GCs沉淀。加入透明質酸酶（80 IU/mL）后在37 ℃、5% CO2的濕潤培養箱中孵育30 min。1 500 r/min 離心10 min 棄上清，使用含有10%胎牛血清（美國Gibco 公司）和1%青霉素-鏈霉素（美國Hyclone 公司）的DMEM/F12（美國Gibco 公司）培養基重懸GCs，并在37 ℃、5% CO2的培養箱中培養。

1.2.2 細胞的培養與轉染本研究涉及的KGN 細胞系購自中國科學院細胞庫。使用含有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的DMEM/F12培養基，在37 ℃、5% CO2的培養箱中培養。Si-circRAF1（sense：5'-GCAGGAUGAUUGAGAUUGUTT-3'，antisense：5'-ACAAUCUCAAUCAUCCUGCTT-3'）和相應的對照（si-NC）均購自中國蘇州吉瑪基因股份有限公司。按照制造商的說明，使用lipofectamine2000 試劑（美國Invitrogen 公司）進行轉染。

1.2.3 RNA提取、RNase R處理和RT-qPCR根據說明書，使用TRIzol 試劑（美國Invitrogen 公司）裂解細胞提取總RNA。在1 μg 總RNA 中加入4 U RNase R（美國Lucigen 公司），37 ℃中孵育30 min，70 ℃ 10 min 終止反應。使用HiScript II Q RT SuperMix（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）對加入或沒加入RNase R 的總RNA 進行逆轉錄得到cDNA。使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）進行RT-qPCR。GAPDH 或U6 被用來作為內源性參考。所有引物均由上海生工生物技術有限公司設計和合成。相關基因RT-qPCR 擴增引物見表2。

表2 引物名稱及序列Tab.2 Primers names and sequences

1.2.4 普通PCR 及產物鑒定根據說明書，使用基因組DNA 提取試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司］提取細胞gDNA。分別以cDNA 及gDNA為模板，設計circRAF1 的聚合引物和發散引物（引物見表2）進行PCR 擴增（反應體系50 μL）。使用1 × TAE 緩沖液（北京索萊寶科技有限公司）配制2%瓊脂糖凝膠，擴增產物在120 V 恒壓條件下電泳30 min。在凝膠成像系統下拍照，并判斷擴增片段的位置。

1.2.5 放線菌素D（act-Dactinomycin， ACTD）處理將KGN 細胞接種于6 孔板中，培養箱中孵育24 h 后加入ACTD（美國sigma 公司），分別在培養0、6、12 和24 h 后使用TRIzol 試劑提取總RNA。

1.2.6 核質分離使用細胞核與細胞漿蛋白抽提試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）分離細胞核與細胞質。收集細胞，加入200 μL 預先混入5 μL RNase Inhibitor 的試劑A，冰浴10～15 min。加入10 μL試劑B，冰浴3～5 min。4 ℃ 12 000g/min離心5 min 后，立即吸取上清至一預冷的離心管中，加入TRIzol 試劑抽提胞漿RNA。對于沉淀，吸盡上清后加入TRIzol 試劑抽提胞核RNA。

1.2.7 蛋白質提取和免疫印記（WB）使用含有1%蛋白酶抑制劑（北京索萊寶科技有限公司）的RIPA 緩沖液（北京索萊寶科技有限公司）裂解細胞，提取蛋白。測定樣品蛋白濃度，加入5 ×Lodding 緩沖液（上海碧云天生物技術有限公司），水浴煮沸5 min。蛋白裂解物用10% SDS-PAGE 凝膠分離，然后轉移到PVDF 膜（美國Millipore 公司）上。PVDF 膜在5%脫脂牛奶中室溫封閉2 h 后分別與FSHR 抗體（美國Proteintech 公司，1∶1 000）、PCNA 抗體（沈陽萬類生物科技有限公司，1∶500）、Bcl-2 抗體（沈陽萬類生物科技有限公司，1∶500）、Casp-3 抗體（沈陽萬類生物科技有限公司，1∶500）和Bax 抗體（沈陽萬類生物科技有限公司，1∶500）在4 ℃下孵育過夜，GAPDH 抗體（美國Proteintech公司，1∶10 000）作為內參。IgG 抗體（合肥白鯊生物科技有限公司，1∶10 000）在室溫下孵育2 h，用增強化學發光試劑盒（ECL；南京諾唯贊生物科技股份有限公司）曝光。

1.2.8 EdU 細胞增殖實驗使用EdU 細胞增殖檢測試劑盒（廣州市銳博生物科技有限公司）檢測細胞增殖。將KGN 細胞接種于24 孔板中，按照試劑盒的說明，對EdU進行標記（紅色）；每孔加入250 μL 5 μg/mL 1× Hoechst 33342 反應液，進行細胞核染色（藍色），制片后立即用熒光顯微鏡（德國Leica公司）拍攝圖片。

1.2.9 CCK-8 細胞活力檢測使用CCK-8 試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）檢測細胞活力。將KGN細胞接種于96孔板中，每孔加入100 μL細胞培養液；24 h 后進行轉染，分別在轉染24、48、72和96 h時檢測細胞增殖。每孔加入10 μL CCK-8溶液，空白對照組（不包含細胞）添加相同體積的細胞培養液和CCK-8 溶液；培養箱內孵育1 h 后使用酶標儀測定OD450，并計算細胞存活百分比，計算公式如下：細胞存活百分比=［（實驗組OD450-空白對照組OD450）/（對照組OD450-空白對照組OD450）］×100%

1.2.10 JC-1 線粒體凋亡檢測使用JC-1 線粒體膜電位檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）檢測線粒體凋亡。將KGN 細胞接種于24 孔板中，根據說明書配制染色工作液（10 μg/mL）和染色緩沖液。每孔加入250 μL 染色工作液，在培養箱中孵育20 min，用染色緩沖液清洗細胞2 次后制片，立即用熒光顯微鏡拍攝照片。

1.2.11 TUNEL細胞凋亡檢測使用一步法TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）檢測細胞凋亡。將KGN 細胞接種于24 孔板中，用4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBS洗滌1次。用含0.3% Triton X-100 的PBS 室溫孵育5 min，PBS洗滌2 次。根據說明書配制適量的TUNEL 檢測液，每孔加入25 μL TUNEL 檢測液，37 ℃避光孵育60 min。PBS 洗滌3 次后制片，立即用熒光顯微鏡拍攝圖片。

1.3 統計學方法實驗數據代表3 個獨立實驗，所有統計分析均使用GraphPad Prism 軟件（9.0 版）進行計算并生成統計圖。兩組之間的差異使用雙側t檢驗進行分析。有統計學意義的表達如下：ns 差異無統計學意義；*P＜ 0.05；**P＜ 0.01；***P＜ 0.001；****P＜ 0.000 1。

2 結果

2.1 circRAF1 在POI 患者GCs 與血清中表達下調為了尋找與卵巢儲備功能相關的circRNAs，對GEO 數據集（GSE97193）進行了再分析，該數據包括3 例高齡（AA， ≥ 38 歲）IVF 患者和3 例年輕（≤ 30 歲）IVF 患者GCs 中circRNAs 的RNA-seq 數據。共有179 個circRNAs（包括61 個下調和117 個上調的circRNAs）在卵巢GCs 中存在差異表達（圖1A-B）。在這些下調的circRNAs 中，分析了其宿主基因的功能，發現circ_0064365 的宿主基因RAF1 參與細胞增殖與凋亡的調控。由于circ_0064365來源于RAF1，將其命名為circRAF1。隨后，提取了正常卵巢儲備患者和POI患者的GCs，并用FSHR免疫熒光染色進行鑒定（圖1C）。RT-qPCR結果顯示，circRAF1 在POI 患者的GCs 及血清中明顯下調（P＜ 0.000 1），見圖1D-E。

注：A，聚類圖；B，火山圖；C，通過FSHR 免疫熒光鑒定GCs；D-E，通過RT-qPCR 檢測NC 組（n = 50）和POI 組（n = 50）GCs 和血清中circRAF1 的表達；F，circRAF1 環化示意圖；G，瓊脂糖凝膠電泳驗證了KGN 細胞中circRAF1 的存在；H-I，ACTD 和RNase R 處理后，通過RT-qPCR 測定circRAF1 和RAF1 的表達；J-K，核質分離法和FISH 實驗檢測circRAF1 在KGN 細胞中的亞細胞定位。ns 差異無統計學意義；**P ＜ 0.01；****P ＜ 0.000 1圖1 circRAF1 在POI 患者GCs 與血清中下調Fig.1 CircRAF1 is down-regulated in GCs and serum of POI patients

2.2 circRAF1 在KGN 細胞中的鑒定與特征長達253 bp 的circRAF1 由RAF1 的6-7 號外顯子環化而成（圖1F）。為了驗證circRAF1的特征，使用發散引物和聚合引物進行PCR擴增，PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳。結果表明，circRAF1 在KGN 細胞中表達，且只有在cDNA 中以發散引物才能擴增出circRAF1（圖1G）。ACTD實驗顯示，circRAF1比線性RAF1擁有更長的半衰期（P＜ 0.01），見圖1H。RAF1在RNase R 消化后表達量明顯降低（P＜ 0.000 1），而circRAF1 表達量無明顯變化（P> 0.05），這表明circRAF1相比于RAF1具有更強的耐RNase R 消化的特征（圖1I）。核質分離實驗（圖1J）和FISH 實驗（圖1K）表明大部分circRAF1 位于細胞質中。

2.3 circRAF1 與卵巢儲備功能相關為了驗證circRAF1 與卵巢儲備功能的相關性，首先分析50 例POI患者中，circRAF1的表達與臨床卵巢儲備功能指標（E2、 AMH、 FSH、 LH、 AFC）的相關性，結果顯示：circRAF1 的表達與血清中基礎E2和AMH水平呈正相關（P＜ 0.001），見圖2A-B，而與血清中基礎FSH、LH 水平呈負相關（P＜ 0.001），圖2C-D。同樣地，所有血清樣本（n= 100）的相關分析顯示，circRAF1 的表達與血清中基礎E2和AMH 水平呈正相關（P＜ 0.001），見圖2E-F，而與血清中基礎FSH、LH 水平呈負相關（P＜ 0.001），圖2G-H，同時，circRAF1 的表達與AFC 呈正相關（P＜ 0.001），見圖3I。這表明circRAF1 與卵巢儲備功能相關，有望成為POI 的新型生物學標記。

注：A-D，采用Pearson 相關分析法分析血清中circRAF1 的表達與POI 患者（n = 50）血清E2、AMH、FSH、LH 濃度的相關性；E-H，采用Pearson 相關分析方法分析血清中circRAF1 的表達與所有受試者（n = 100）血清E2、AMH、FSH、LH 濃度的相關性；I，采用Pearson 相關分析方法分析血清中circRAF1 的表達與所有受試者（n = 100）AFC 的相關性圖2 circRAF1 與卵巢儲備功能相關Fig.2 Correlation between circRAF1 and ovarian reserve function

2.4 干擾circRAF1 抑制KGN 細胞的增殖為了進一步探究circRAF1 的功能，設計了針對circRAF1 的小干擾RNA（si-circRAF1），并在KGN 細胞中對circRAF1 進行干擾。與對照組相比，干擾circRAF1 后，circRAF1 的表達下調（P＜ 0.05），見圖3A，細胞增殖能力下降（P＜ 0.05），見圖3B，細胞活力降低（P＜ 0.01），見圖3C。此外，增殖相關基因FSHR、PCNA 和Bcl-2 mRNA 及其對應蛋白表達水平也顯著降低（P＜ 0.05），見圖3D-G。綜上所述，干擾circRAF1 抑制了KGN 細胞的增殖能力。

注：A，RT-qPCR 檢測si-circRAF1 的干擾效率；B，EdU 檢測細胞增殖能力；C，CCK-8 檢測細胞活力；D-F，RT-qPCR 檢測FSHR、PCNA 和Bcl-2 mRNA 的表達；G，WB 檢測FSHR、PCNA 和Bcl-2 蛋白的表達。*P ＜ 0.05；**P ＜ 0.01圖3 干擾circRAF1 抑制KGN 細胞的增殖Fig.3 Silencing circRAF1 inhibits the proliferation of KGN cells

2.5 干擾circRAF1 促進KGN 細胞凋亡線粒體膜電位的破壞是細胞凋亡早期發生的一個標志性事件，檢測了干擾circRAF1 對細胞凋亡的影響，結果顯示，干擾circRAF1 后，KGN 細胞線粒體膜電位下降（P＜ 0.05，圖5A-B），凋亡細胞數量顯著增加（P＜ 0.05，圖5C-D）。此外，凋亡相關基因Casp-3、Bax mRNA 及其對應蛋白的表達水平顯著升高（P＜ 0.05，圖5E-H），Bcl-2/Bax 下降（P＜ 0.05，圖5I）。這些結果表明，干擾circRAF1 促進KGN細胞凋亡。

注：A-B，JC-1 檢測細胞線粒體凋亡；C-D，TUNEL 檢測細胞凋亡；E-F，RT-qPCR 檢測Casp-3 和Bax mRNA 的表達；G-H，WB 檢測Casp-3 和Bax 蛋白的表達；I，Bcl-2 與Bax 表達水平的比值。*P ＜ 0.05；**P ＜ 0.01；***P ＜ 0.001圖4 干擾circRAF1 促進KGN 細胞凋亡Fig.4 Silencing circRAF1 promotes apoptosis in KGN cells

3 討論

由于卵泡閉鎖和周期性排卵，原始卵泡數量在女性整個生命過程中逐步下降，并隨年齡的增長而加速［17］。異常的卵泡閉鎖會導致原始卵泡過早耗竭，繼而發生卵巢功能不全［18］。卵巢GCs凋亡是卵泡閉鎖的重要機制［19］。這表明促進GCs增殖，抑制GCs 凋亡可以挽救受損的卵巢結構和功能。

由于circRNAs 獨特的穩定性、多樣性和特異性，具有作為候選診斷、預后和治療靶點的潛力［20］。近年來，腎癌［21］、胃癌［22］、肝癌［23-24］、甲狀腺癌［25］等都已找出高靈敏度的circRNAs 指標作為生物標志物來輔助臨床診斷。最近的證據顯示，circRNAs 與多種卵巢疾病相關，包括多囊卵巢綜合征［26-27］、卵巢早衰［28］和上皮性卵巢癌［29］等。本研究在POI 患者GCs 及血清中發現了共同下調的circRAF1。隨后證實了circRAF1具有較長的半衰期和較高的穩定性。同時，發現circRAF1 與臨床卵巢功能指標血清水平和AFC 高度相關，這都說明circRAF1 有望成為提示POI 的新型生物標志物。

此前的研究表明，RAF1 可以介導FSH 的信號傳導，以刺激GCs 中E2的合成和分泌［30］。另有研究表明，RAF1 可以通過調節LAGE1 調控下咽癌細胞增殖與凋亡［31］。來源于RAF1 的circRAF1 可能行使著與其宿主基因相似的生物學功能。此前，已有多項研究證實circRNAs 參與卵巢功能的調節，例如：circLDLR 通過miR-1294/CYP19A1 軸調節E2的分泌［32］；circ_0118530 缺失抑制KGN 細胞增殖、遷移、氧化應激和炎性細胞因子釋放［33］；circ_0023942 通過調節CDK-4 抑制GCs 增殖［34］；敲低circ-FURIN 通過miR-195-5p/BCL2 軸抑制GCs 的增殖并誘導凋亡［35］。然而，circRAF1是否參與卵巢功能的調節目前尚未知曉，本研究對此進行了驗證。本研究將KGN 細胞作為研究對象，通過瞬時轉染si-circRAF1 構建circRAF1 低表達KGN 細胞模型。實驗發現，干擾circRAF1 抑制了KGN 細胞增殖，促進了凋亡，這表明circRAF1 在卵巢功能中發揮著重要的調節作用。

然而，本研究仍存在一定的局限性。首先，納入研究的樣本量較小，還需要更多的大規模的臨床試驗來證明circRAF1 作為未來POI 生物標志物的有效性。此外，由于時間有限，本研究未能深入探究circRAF1 下游通路及其下游因子在POI 中的作用。不過眾所周知，circRNAs 往往通過作為miRNA 的分子海綿［36］和RNA 結合蛋白［37］來執行多種功能，一些circRNAs 甚至在多種病理生理過程中充當翻譯模板［38］。后續的研究也將從以上幾個方面為切入點，進一步探究circRAF1 調節卵巢功能的可能機制。

綜上所述，本研究通過生物信息學分析和臨床驗證發現：POI 患者GCs 及血清中的circRAF1 表達水平下調，且與卵巢儲備功能下降有關。同時，體外實驗發現：干擾circRAF1 可以抑制KGN 細胞增殖，促進其凋亡。這都表明circRAF1 可能通過調控GCs 的功能影響POI 的發生發展。在后續的研究中，可以在細胞和動物水平進一步探討circRAF1 調控GCs 功能的具體分子機制，為POI 防治研究提供新的視角和思路。

【Author contributions】LI Wenxin was responsible for experimental operation， data collection and analysis， statistical analysis and paper writing； LU Minjun was responsible for data collection and analysis； LIN Li and LIU Yueqin were responsible for sample collection；ZHU Xiaolan was responsible for experimental design， research guidance， paper revision and financial support.All authors read and approved the final manuscript as submitted.

【Conflict of interest】The authors declare no conflict of interest.