子宮內(nèi)膜乳酸桿菌主導的微生物群與生殖的關系

張碧云 鐘興明 王曉霞 劉曉華

1廣東省生殖醫(yī)院（廣東省生殖科學研究所）生殖免疫科（廣州 510600）；2國家衛(wèi)生健康委員會男性生殖與遺傳重點實驗室（廣州 510600）；3廣東省生殖科學研究所中心實驗室（廣州 510600）

曾經(jīng)長達一個世紀以來，人們認為陰道、宮頸等下生殖道存在微生物群，而子宮等上生殖道一直被認為是無菌的環(huán)境。而近年來隨著16S 核糖體RNA（16S rRNA）等高通量測序技術的快速發(fā)展，發(fā)現(xiàn)和識別越來越多的子宮內(nèi)膜微生物定植，這為子宮為非無菌環(huán)境提供了有力的證據(jù)［1］。由于在宮頸管、宮腔等部位及輸卵管、卵巢及腹膜液等檢測到與陰道不同的微生物群落，故而認為：微生物群在女性生殖道內(nèi)存在且連續(xù)分布，生殖道是一個非無菌環(huán)境［2］。生殖道微生物組的評估為人類生殖、妊娠的起源及維持等提供了新的微生物學視角，且隨著對這類微生物群功能的研究的深入，發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜微生物群（endometrial microbiota，EM）對維持女性妊娠及生育等生殖過程至關重要。子宮內(nèi)膜微生物群對自然生育與輔助生殖過程均產(chǎn)生影響，關于生殖道微生物群對生育、流產(chǎn)、復發(fā)性流產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion，RSA）［3］、反復種植失敗（repeated implantation of embryos failed，RIF）［4］等的影響已經(jīng)引發(fā)國內(nèi)外學者的關注，但是目前尚缺乏統(tǒng)一的觀點及數(shù)據(jù)［5-6］。本文將初步探討子宮內(nèi)膜乳酸桿菌主導的微生物群（LDM）生殖結(jié)局的關系，為人類生殖生育提供了新的微生物學視角。生殖道微生物組的評估，為人類生殖生育提供了新的微生物學視角，微生物群落評估展現(xiàn)了對改善生殖醫(yī)學和婦女健康越來越明顯的重要性。

1 子宮內(nèi)膜微生物群與慢性子宮內(nèi)膜炎

子宮內(nèi)膜微生物群是指定植于子宮內(nèi)膜的微生物及其基因組的總和。慢性子宮內(nèi)膜炎（chronic endometritis， CE）病理表現(xiàn)為子宮內(nèi)膜間質(zhì)區(qū)漿細胞浸潤，而臨床表現(xiàn)方面沒有特異性。CE 診斷的金標準是基于子宮內(nèi)膜活組織的病理檢查［7］。慢性子宮內(nèi)膜炎常見于革蘭陰性菌株感染，如大腸桿菌及陰道加德納菌，除了其內(nèi)毒素可以直接損傷人類植入前卵裂率、胚泡形成率及胚胎著床率之外，蛋白TLR4 也對胚胎植入有負面生物學效應。目前發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜中常見的致病病原體有：（1）細菌：如大腸埃希菌、糞腸球菌、鏈球菌屬、葡萄球菌；（2）變形桿菌屬；（3）肺炎克雷伯菌；（4）陰道加德納菌；（5）脲原體/支原體：生殖支原體、人型支原體、解脲脲原體；（6）棒狀桿菌；（7）銅綠假單胞菌；（8）結(jié)核分枝桿菌；（9）酵母菌等［8］。

慢性子宮內(nèi)膜炎與生殖關系密切。KIMURA等［9］研究表明，慢性子宮內(nèi)膜炎在不孕女性中的患病率為2.8%～56.8%，在反復移植失敗RIF 中發(fā)病率為14%～67.5%，在復發(fā)性流產(chǎn)RSA 中發(fā)病率為9.3%～67.6%。KITAYA 及VITAGLIANO 等［10-11］的研究也表明，RIF 的不孕癥與CE 密切相關。已知子宮內(nèi)膜微生物菌群失調(diào)還與多種婦科疾病有關，例如子宮內(nèi)膜異位癥［12］、子宮內(nèi)膜癌等［13］。隨著胚胎RIF、RSA 及不明原因不孕等問題，有效診斷及治療CE 引發(fā)的負面影響在生殖領域受到了廣泛關注。有效的抗生素治療CE 可以提高不明原因復發(fā)性妊娠丟失（RPL）患者的妊娠率和活產(chǎn)率，并增加復發(fā)性植入失敗RIF 患者的持續(xù)妊娠率［14］。

2 子宮內(nèi)膜微生物群對生殖功能的作用機制

目前觀點認為，子宮微生物群從以下幾方面影響內(nèi)膜上皮的病理生理學功能，并影響生殖結(jié)局。

2.1 改變子宮內(nèi)膜容受性子宮內(nèi)膜容受性可能受到基因、蛋白、細胞因子等多因素調(diào)控。正常育齡女性的胚胎著床窗口期為3～6 d，在某些炎癥或解剖改變的情況下，該窗口期會變窄或移位以阻止正常著床，導致不孕或妊娠丟失。在維持正常妊娠的著床中，胚胎和子宮內(nèi)膜均承擔了相應的責任［15］。免疫細胞對胚胎著床和子宮內(nèi)膜容受性至關重要。它們發(fā)揮組織重塑和免疫調(diào)節(jié)作用，促進上皮附著能力，調(diào)節(jié)蛻膜細胞的分化，重塑子宮血管，控制和消除炎癥激活，排斥對父系遺傳異體抗原的破壞性免疫。從生物學的角度來看，子宮內(nèi)膜免疫反應發(fā)揮了一種“質(zhì)量控制”——在條件有利時促進著床，但在環(huán)境不理想時限制著床。RIF 和RSA 者可能表現(xiàn)出某些子宮免疫細胞群的數(shù)量改變或功能紊亂［16］。反復種植失敗RIF 合并有慢性子宮內(nèi)膜炎CE 的患者，血免疫球蛋白IgM、IgA 和IgG 的表達增高。慢性子宮內(nèi)膜炎情況下，定植在內(nèi)膜的微生物群與宿主免疫之間失衡，繼而產(chǎn)生相關細胞因子及免疫因子，并影響子宮內(nèi)膜容受性［17］。

2.2 改變生殖道的pH 值女性生殖道內(nèi)的pH 值呈梯度變化，陰道內(nèi)pH 值最低（平均pH 值4.42）向輸卵管（平均pH 值7.94）逐漸升高，反映了部位特異性微生物群和組織/細胞酸堿緩沖的變化。pH 值的波動對精子功能、卵母細胞成熟和胚胎發(fā)育都有重要影響，胚胎和卵母細胞內(nèi)存在pH 值的調(diào)節(jié)機制［18］。眾所周知，陰道存在“自凈作用”。陰道是一個開放的微生態(tài)環(huán)境，在正常陰道微生態(tài)中，起主導作用的是產(chǎn)過氧化氫的乳酸桿菌，陰道內(nèi)乳酸桿菌下調(diào)陰道的pH 值，產(chǎn)生過氧化氫，抑制了致病菌的增殖、黏附及定植，使入侵的微生物無法獲得足夠的營養(yǎng)，從而不能大量增殖。細菌性陰道病BV 等婦科疾病與陰道pH 值升高即和乳桿菌菌落減少有關［19-20］。由于陰道、宮頸、子宮內(nèi)膜的酸堿度對胚胎種植、著床的重要性，而生殖道的pH 值又與微生物群密切相關，故而許多學者嘗試從微生物群結(jié)構(gòu)調(diào)整局部pH 值，以提高自然妊娠或者輔助生殖妊娠著床的成功率。

2.3 影響生殖道上皮屏障的完整性健康的宮頸陰道微生物群維持宮頸上皮屏障的完整性并調(diào)節(jié)黏膜免疫系統(tǒng)。微生物群組成及微生物代謝物的變化，引起局部炎癥，損害了宮頸上皮和免疫屏障，增加對性傳播感染的易感性和相關疾病的進展［21］。生理情況下，子宮內(nèi)膜共生微生物群與內(nèi)膜上皮細胞之間，可形成抵御病原微生物的物理屏障，兩者相結(jié)合誘發(fā)各種具有抗菌活性的天然肽，這些肽可以保護細菌、病毒和真菌等病原體的定植，從而直接影響細菌群落平衡，并可能是幫助胚胎著床和維護健康環(huán)境的主要參與者，如參與上皮組織抵御各種病原體的蛋白水解酶的形成［22-23］。不同的細菌群落能夠通過黏蛋白降解、生物膜形成和抗菌素耐藥性等機制，從而導致生態(tài)失調(diào)狀態(tài)［24-25］。此外，宮腔微生物群還會誘導子宮內(nèi)膜細胞產(chǎn)生黏液，并穩(wěn)定內(nèi)膜細胞間的緊密連接及黏附聯(lián)接，并進一步強化了宮腔內(nèi)膜黏膜屏障的完整性［26-27］。

2.4 改變子宮內(nèi)膜上皮的基因組穩(wěn)定性目前的證據(jù)有力地表明，有益微生物組可以通過觸發(fā)身體的免疫反應，維持局部內(nèi)膜上皮基因組的穩(wěn)定，來攻擊各種生殖系統(tǒng)腫瘤，如：宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌及陰道癌和外陰癌。子宮內(nèi)膜微生物組成的變化，還影響宿主細胞的免疫和代謝信號，導致血管生成、細胞增殖、基因組不穩(wěn)定增加，從而可能導致婦科癌癥的發(fā)生或發(fā)展。雖然微生物基因組在婦科癌癥中的研究才開始，但已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些重要的微生物組特征關聯(lián)性疾病。如：宮頸癌伴隨大量人乳頭瘤病毒、梭桿菌感染，子宮內(nèi)膜癌中存在卟啉單胞菌、變形菌門和厚壁菌門細菌水平顯著升高。卵巢癌中有沙眼衣原體、乳桿菌和分枝桿菌的增加的報道。反之，乳桿菌可能通過轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)和其他基因組和表觀遺傳的改變，降低腫瘤的發(fā)病率［28］。

2.5 改變生殖道局部免疫炎癥信號通路宮腔微生物通過激活核因子κB（NF-κB）、磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）及有絲分裂原活化蛋白激酶（MAPK）等的信號通路，產(chǎn)生促炎因子，如白細胞介素IL-6 和IL-8、腫瘤壞死因子（TNF）等［29］。MULLA 等［30］發(fā)現(xiàn)RSA 患者中多有抗心磷脂抗體（antiphospholipid antibodies， aPL）陽性，抗磷脂綜合征APS 是RSA 的重要免疫病因，并提出以MyD88/TLR-4 通路為靶向提供抗磷脂綜合征APS 合并RSA 患者的治療。筆者的早期研究也表明，胚胎停育炎癥組患者的子宮蛻膜組織中TLR4表達高于早孕人流的對照組，而宮腔內(nèi)膜蛻變組蛻膜組織中的TLR4 表達低于早孕人流對照組。故認為：母體宮腔蛻膜組織TLR4 蛋白的平衡對早孕妊娠維持發(fā)揮了重要作用［31］。在生殖領域，控制性超促排卵及黃體支持，也可改變陰道和子宮內(nèi)膜微生物群的組成：超促排卵及黃體支持降低了子宮內(nèi)膜中的乳桿菌的相對比例，而增加了普雷沃氏菌和阿托泊菌的比率，從而影響子宮內(nèi)膜容受性及妊娠結(jié)局［32］。CE 的細菌與子宮內(nèi)膜微環(huán)境的相互作用促進了白細胞數(shù)量增加、細胞因子產(chǎn)生和生長因子的變化，從而改變子宮內(nèi)膜容受性，導致胚胎植入失敗。

3 子宮內(nèi)膜LDM 與生殖的關系

3.1 乳酸桿菌及其在女性生殖道的分布乳酸菌是一種無芽孢的桿菌，屬革蘭氏陽性菌。單個、成雙或短鏈排列。屬于細菌界、厚壁菌門、芽孢桿菌綱、乳桿菌目、乳桿菌科、乳桿菌屬。乳酸桿菌是可使葡萄糖等糖類分解為乳酸的各種細菌的總稱。一般說乳酸桿菌指的是乳酸桿菌屬。乳酸桿菌有較強的代謝碳水化合物產(chǎn)酸能力，可以合成葡聚糖和雜多糖，能使糖類發(fā)酵產(chǎn)生乳酸或其他酸類物質(zhì)，產(chǎn)生的乳酸具有調(diào)味和防腐的作用。乳酸桿菌屬廣泛分布于自然界，有些菌株是人和動物口腔、腸道及陰道的正常菌群之一，很少致病，除極偶爾引起亞急性細菌性心內(nèi)膜炎外，對人基本無害。一般認為，寄生于腸道和陰道的乳酸桿菌對機體有保護作用。 目前已經(jīng)分離出40 余種乳酸桿菌，來源于動物的陰道分泌物、動物糞便、酸菜及奶酪中，它們均同屬于乳酸桿菌屬［33］。

VOMSTEIN 等［34］研究發(fā)現(xiàn)，陰道有一個高度依賴乳酸菌的微生物群。沿著女性生殖道越往上走，這些部位及生殖管道微生物群中的乳酸菌比例就越低（如宮角及輸卵管）。從陰道、宮頸，到子宮腔，乳酸桿菌的優(yōu)勢性下降和菌群多樣性的增高均會增加局部感染風險，如：外陰陰道假絲酵母菌病、細菌性陰道炎、滴蟲性陰道炎及需氧菌性陰道炎等［35］。但是，是否所有女性都存在其獨特的宮腔菌群，所檢測到的細菌是否永久亦或是短暫地存在于宮腔內(nèi)膜，宮腔內(nèi)各個菌群的共生關系如何呢，尚需要進一步探討。

3.2 子宮內(nèi)膜LDM對生殖的積極證據(jù)子宮內(nèi)膜中存在以乳酸桿菌為主的微生物群（LDM > 90%乳桿菌屬）與非乳酸菌為主的微生物群（NLDM，＜ 90%乳桿菌屬和＞ 10%其他細菌）兩類情況。關于LDM 對生殖結(jié)局的影響，多數(shù)研究對其持積極態(tài)度，認為LDM 有助于生殖結(jié)局。

熊霜［36］研究使用16S rRNA 基因V3-V4 區(qū)域進行擴增測序，發(fā)現(xiàn)厚壁菌門和變形菌門是不孕女性優(yōu)勢菌門，且不孕女性子宮內(nèi)膜微生物群主要以NLDM為主。KYONO等［37］證明雖然建立LDM 為主的子宮內(nèi)膜對妊娠結(jié)局未必有明顯的益處，但結(jié)果提示：LDM 子宮內(nèi)膜在不孕癥女性的胚胎著床、植入宮腔過程中起到了正面的積極意義。LIU等［38］的研究報道了復發(fā)性流產(chǎn)RSA 患者的上下女性生殖道的微生物群與對照組相比在α 多樣性方面沒有顯著差異，但RSA 組陰道微生物群、宮頸微生物群和宮腔灌洗液微生物群的β 多樣性顯著高于健康對照組。子宮內(nèi)膜菌群研究發(fā)現(xiàn)，變形菌門（Proteobacteria）成為RSA 患者的主要門類，而厚壁菌門（Firmicutes）則仍在對照組中起主導作用。在RSA 組中，屬于變形桿菌的不動桿菌屬取代了乳酸桿菌，成為最主要的屬。RSA 組中，LDM在子宮內(nèi)膜菌群中顯示出比例減低的趨勢［38］。PEURANP?? 等［39］研究發(fā)現(xiàn)與對照組相比，反復妊娠丟失RPL 女性子宮內(nèi)膜樣本中crispr 乳桿菌的豐度較低，在子宮內(nèi)膜和陰道樣本中，RPL 組陰道加德納菌的豐度均高于對照組。VOMSTEIN等［34］研究共納入10 個無生育史的健康對照，20 個復發(fā)性流產(chǎn)RSA患者（定義為至少連續(xù)3次流產(chǎn)），20 例反復著床失敗RIF（至少3 次胚胎移植失敗）。每個受試者在卵泡期、排卵期和黃體期進行子宮沖洗，收集子宮沖洗液。比較復發(fā)性流產(chǎn)（RSA）和反復種植失敗（RIF）組、對照組在月經(jīng)周期每個采樣時間點的微生物群分類。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對照組在排卵期前后物種豐富度和均勻度顯著下降，微生物群分布更均勻。在門水平RIF 患者在月經(jīng)周期，特別是在排卵期和黃體期，厚壁菌門數(shù)量減少。子宮內(nèi)膜的LDM 豐度在健康對照組中較RSA 及RIF組中明顯減少。故認為：RSA 及RIF 這兩個患者群體與對照組相比，LDM 的優(yōu)勢較低。宮腔菌群微環(huán)境變化，是容易導致妊娠失敗的原因或結(jié)果［34］。MORENO 等［40］研究發(fā)現(xiàn)行試管嬰兒（IVF-ET）患者中NLDM 組的胚胎著床率、妊娠率、持續(xù)妊娠率和活產(chǎn)率均較LDM 組顯著降低，流產(chǎn)率升高但差異無統(tǒng)計學意義，尤其是當NLDM 組中加德納菌屬和鏈球菌屬比例較高時，這一負面影響更為明顯。ZOU 等［41］研究發(fā)現(xiàn)，125 例反復種植失敗RIF 患者檢出子宮內(nèi)膜致病菌，以鏈球菌、葡萄球菌、奈瑟菌、克雷伯菌最為常見，占致病組的88.70%。這些宮內(nèi)膜致病菌，與非乳酸菌為主的微生物群（NLDM）相關。

復發(fā)性流產(chǎn)的病因復雜，臨床特征具有高度的異質(zhì)性，涉及生殖免疫學、生殖醫(yī)學、生殖遺傳學、風濕免疫學、婦產(chǎn)科學和檢驗醫(yī)學等多學科范疇［42］。關于下生殖道菌群結(jié)構(gòu)與復發(fā)性流產(chǎn)的關系，目前尚無定論。而以上研究均表明，LDM 型子宮內(nèi)膜在降低RSA 或反復妊娠丟失（PRL）及RIF發(fā)病方面顯示出了積極意義。反之，NLDM 型子宮內(nèi)膜則產(chǎn)生了流產(chǎn)、RSA 或RIF 等負面的影響。

3.3 子宮內(nèi)膜LDM 對生殖積極作用的可能機制

3.3.1 LDM 維持母胎免疫平衡當宮腔內(nèi)膜的致病微生物導致共生微生物群結(jié)構(gòu)、數(shù)量紊亂，以及內(nèi)膜的抗菌屏障損傷、免疫細胞比例失調(diào)，且促炎因子釋放增加導致代謝產(chǎn)物紊亂，并影響胚胎的著床［43］。母胎界面免疫耐受的本質(zhì)是胚胎滋養(yǎng)層細胞、蛻膜基質(zhì)細胞和蛻膜免疫細胞共同參與母-胎對話的過程，促進母胎界面免疫微環(huán)境的轉(zhuǎn)化及適應性免疫的建立，如滋養(yǎng)層細胞浸潤、螺旋動脈重塑和胚胎免疫耐受建立等。母胎界面免疫微環(huán)境異常會造成母胎免疫耐受穩(wěn)態(tài)失衡，可能是導致RSA 的重要原因［44］。子宮內(nèi)膜中免疫細胞的數(shù)量和功能異常，必然影響胚胎植入的過程及影響妊娠維持。子宮內(nèi)膜微生物失調(diào)導致的免疫穩(wěn)態(tài)失調(diào)可能產(chǎn)生慢性炎癥，而乳酸桿菌則維持了此免疫平衡的過程［45］。反之，慢性子宮內(nèi)膜炎患者子宮內(nèi)膜菌群并非以乳酸桿菌為主，其母胎界面中蛻膜T 細胞呈Th1 和Th17 細胞偏倚，導致了慢性子宮內(nèi)膜炎者的臨床受孕率大大下降［46］。

3.3.2 LDM 加強抗菌屏障LDM 在宮腔內(nèi)膜可維持完整、穩(wěn)定的上皮抗菌屏障，并保護子宮內(nèi)膜免受機會致病微生物的感染、定植及入侵。LDM可提高子宮內(nèi)膜上皮細胞的胞間連接，是黏膜屏障發(fā)揮功能的基礎。乳酸桿菌通過提高緊密連接蛋白的表達，來增強上皮細胞的屏障功能。乳酸桿菌還通過這種占位效應，來減少致病微生物群入侵的機會，從而維護黏膜的完整性［47］。

3.3.3 LDM 增加了子宮內(nèi)膜容受性子宮內(nèi)膜的容受性受到子宮內(nèi)膜厚度、血流狀態(tài)、子宮解剖結(jié)構(gòu)及母體全身疾病及母體生殖道微生物群結(jié)構(gòu)的影響。子宮內(nèi)膜中乳酸桿菌的數(shù)量在子宮內(nèi)膜容受性中發(fā)揮重要作用，LDM 可增加育齡女性子宮內(nèi)膜的容受性。而隨著年齡的增長，LDM 乳酸菌優(yōu)勢菌群在宮腔減少，子宮內(nèi)膜容受性下降導致的不孕及流產(chǎn)也增加了［48］。

綜上所述，子宮內(nèi)膜LDM 對生育產(chǎn)生了的積極意義，可以維持母胎界面有效平衡，為降低流產(chǎn)、RSA 及RIF 等發(fā)揮積極的作用。但是目前有關子宮內(nèi)膜微生物群與生殖結(jié)局的相關性尚未達成共識，尚需要進一步的研究探索。

【Author contributions】ZHONG Xingming helped to provide information.WANG Xiaoxia and LIU Xiaohua helped to look up the information.ZHANG Biyun searched for information， wrote and revised the first draft， and finalized the draft.All authors read and approved the final manuscript submitted.

【Conflict of interest】The authors declare no conflict of interest.