補體C3水平對凍融胚胎移植妊娠結局的早期預測價值

唐志霞 馬雙影 張影 盛佳佳 李娟 何晶晶 宣恒華 洪名云

安徽省婦幼保健院/安徽醫科大學附屬婦幼保健院生殖中心（合肥 230001）

隨著玻璃化冷凍技術的不斷成熟，凍融胚胎移植（frozen thawned-embryo transfer， F-ET）周期數越來越多，其可以明顯降低卵巢過度刺激綜合征（ovarian hyperstimulation syndrome， OHSS）發生和增加每個取卵周期累計妊娠率。改善胚胎質量和子宮內膜容受性的方法不斷被優化，仍然有不少患者會出現反復種植失敗（recurrent implantation failure， RIF）的情況，RIF 的發生率5%～10%［1］。在正常妊娠的過程中，作為半同種異體的胚胎不會出現被母體免疫系統排斥的現象，而是一直維持到妊娠分娩，稱之為母胎免疫耐受［2］。而補體對于適應性免疫具有免疫調節作用，其最初存在于體內是無活性的前體物質，一旦被激活后，就會產生一連串生物學效應，進而達到維持組織穩態、免疫監督和細胞完整性等作用［3］。

關于免疫因素在調控胚胎著床和妊娠維持的研究越來越多。適當激活的補體成分對維持正常的妊娠是必需的，就拿胚胎滋養層來說，一定水平的補體有利于免疫防御病原體、新血管生成和滋養細胞遷移［4-5］。與正常妊娠患者相比，復發性流產（recurrent spontaneous abortion， RSA）患者血清補體C3 水平明顯升高［6-7］，補體水平升高可預警RSA 患者即將流產［6］。補體異常激活或者水平太低可能都對妊娠結局產生不利影響，適當的補體水平才是成功妊娠的必備要素。補體C3 在RSA患者［6-7］、早孕和晚孕期［8］、系統性紅斑狼瘡［9］、抗心磷脂綜合征［10］和干燥綜合征［11］等自身免疫性疾病患者均有相關研究，然而補體C3 水平對F-ET 周期妊娠結局有無預測價值，暫無相關研究。本研究初步探討補體C3 水平對F-ET 妊娠結局的早期預測價值，希望以后能提早干預，進而改善F-ET妊娠結局。

1 資料與方法

1.1 研究對象前瞻性收集2022年6月至2023年3 月在安徽醫科大學附屬婦幼保健院生殖中心行F-ET 的不孕癥患者，納入標準：年齡≤ 43 歲、有冷凍胚胎、擬行F-ET 患者；依從性好并知情同意并簽字。排除標準：抗磷脂綜合征、系統性紅斑狼瘡、干燥綜合征、橋本氏甲狀腺炎、類風濕性關節炎、各種原發性或繼發性腎臟疾病、過敏性紫癜、未分化結締組織疾病等自身免疫性疾病、子宮內膜異位癥、子宮肌瘤及腺肌瘤以及子宮畸形等；內分泌異常；雙方染色體異常；感染和夫妻血型不合等因素，最終納入378 個周期。本研究通過生殖醫學倫理委員會審核（批件號：20220513）并獲得患者知情同意。

1.2 分組收集患者基礎資料以及移植日補體C3、C4 水平，根據妊娠結局分為兩組，選用回歸分析探討影響F-ET 臨床結局的可能因素，受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC 曲線）計算補體C3 水平預測F-ET 妊娠結局的最佳截斷值，隨后根據ROC 曲線C3 截斷值進行分組，分為兩組：A組（補體C3 ≤ 1.05）：120個周期，B 組（補體C3 > 1.05）：258 個周期，比較兩組妊娠結局，最后ROC 曲線進一步計算B 組補體C3 對F-ET 后預測自然流產的最佳截斷值。

1.3 補體C3 和C4 的檢測方法移植日收集所有患者外周靜脈血5 mL， 在 4 ℃、3 500 r/min 的條件下離心處理10 min，血清置于-80 ℃的冰箱中保存。采用免疫透射比濁法檢測血清補體C3、C4 水平，具體檢測步驟按照說明書操作。

1.4 F-ET 周期采用激素替代周期和自然周期方案調節子宮內膜，遵循本中心常規黃體支持方案和F-ET 的操作規范。

1.5 妊娠結局隨訪F-ET 術后30 d 陰道超聲檢查可見宮內妊娠囊或異位妊娠者為臨床妊娠；妊娠28 周之前自然終止妊娠者為自然流產。臨床妊娠率計算方法：臨床妊娠周期數除以移植周期數×100%；胚胎著床率計算方法：宮內妊娠孕囊數除以移植胚胎數×100%；流產率計算方法：妊娠28 周之前流產周期數除以臨床妊娠周期數×100%。

1.6 統計學方法所有數據采用SPSS 26.0 軟件進行統計分析。對符合正態分布的定量資料采用均數±標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本的t檢驗［12］；對不符合正態分布的計量資料采用M（P25，P75）表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗［12］；定性資料采用以%表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher 檢驗［12］。logistic 回歸單因素分析具有統計學意義（P＜ 0.05）的因素再次納入二元logistic回歸多因素分析，從而得到F-ET 臨床妊娠結局獨立的風險因素［12］。對分類變量進行以下賦值，不孕類型（原發不孕=0，繼發不孕=1）；周期類型（自然周期=0，激素替代=1）；胚胎類型（卵裂期=0，囊胚期=1）；受精類型（IVF=0， ICSI=1）。繪制受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve， ROC 曲線）并計算曲線下面積（area under the curve， AUC）［12］；以約登（Youden）指數最大值時作為最佳截斷值（cut-off）［12］。均以P＜ 0.05 為差異有統計學意義［12］。

2 結果

本研究共納入F-ET 周期數378 個周期，其中臨床妊娠周期數201 個周期，臨床妊娠率53.17%，自然流產周期數33 個周期，自然流產率16.42%。

2.1 影響F-ET 臨床結局相關因素的logistic 回歸分析以臨床妊娠結局為因變量，分別將年齡、不孕類型（原發不孕=0，繼發不孕=1）、不孕年限、體質量指數、補體C3 水平、補體C4 水平、促甲狀腺激素、CA125、空腹血糖、周期類型（自然周期=0，激素替代=1）、內膜厚度、移植胚胎數、胚胎類型（卵裂期=0，囊胚期=1）以及受精類型（IVF=0，ICSI=1）納入自變量分析，結果顯示：年齡、不孕年限、補體C3 水平和胚胎類型是F-ET 臨床妊娠結局相關預測因子（P＜ 0.05），見表1。logistic 單因素回歸分析結果具有統計學意義（P＜ 0.05）的因素再次納入二元logistic 回歸多因素分析，以臨床妊娠結局為因變量，年齡、不孕年限、補體C3 水平和胚胎類型納入自變量進行分析，結果顯示：年齡是F-ET臨床妊娠成功的危險因素（OR= 0.946，95%CI：0.898～0.996，P= 0.035）；補體C3 是F-ET 臨床妊娠成功的保護因素（OR= 83.812，95%CI：21.782～322.495，P＜ 0.001）；囊胚移植較卵裂期胚胎移植有較好的臨床妊娠結局（OR= 2.210， 95%CI：1.391～3.511，P= 0.001），這三者對F-ET 臨床妊娠結局的影響差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。見表2。

表1 影響F-ET 臨床妊娠結局相關因素的Logistic 單因素回歸分析Tab.1 Logistic single factor regression analysis of factors affecting the clinical pregnancy outcome of F-ET

表2 影響FET 臨床妊娠結局相關因素的logistic 多因素回歸分析Tab.2 Logistic multiple factor regression analysis of factors affecting the clinical pregnancy outcome of F-ET

2.2 補體C3 對F-ET 臨床妊娠結局的早期預測價值ROC 曲線結果顯示：補體C3 水平的AUC 為0.702，最佳截斷值為1.05 g/L，約登指數0.396，敏感度87.60%，特異度52.00%，見圖1。

圖1 補體C3 對F-ET 臨床妊娠結局早期預測價值的ROC曲線Fig.1 ROC curve for early prediction of clinical pregnancy outcome of F-ET using complement C3

2.3 補體C3 對F-ET 妊娠結局的影響根據ROC曲線補體C3 水平截斷值進行分組，分為兩組：A組（補體C3 ≤ 1.05）：120 個周期；B 組（補體C3 >1.05）：258 個周期。兩組患者的一般資料如年齡、體質量指數、補體C4 水平、促甲狀腺激素、空腹血糖、CA125、不孕年限、不孕類型、子宮內膜厚度、移植胚胎數、周期類型、受精類型以及胚胎類型相比，均差異無統計學意義（P> 0.05）。見表3。B 組的臨床妊娠率（67.05%）明顯高于A 組（23.33%），且差異有統計學意義（P＜ 0.05）。B 組的著床率（52.75%）明顯高于A 組（20.73%），差異有統計學意義（P＜ 0.05）。見表4。

表3 不同補體C3 水平組間患者的基本資料Tab.3 Basic data of patients with different levels of complement C3 ±s

表3 不同補體C3 水平組間患者的基本資料Tab.3 Basic data of patients with different levels of complement C3 ±s

組別周期數（個）年齡（歲）體質量指數（kg/m2）補體C4（g/L）促甲狀腺激素（μIU/mL）空腹血糖（mmol/l）CA125［M（P25，P75），ng/mL］不孕年限［M（P25，P75），年］不孕類型［例（%）］原發性不孕繼發性不孕子宮內膜厚度（mm）移植胚胎數（個）周期類型［例（%）］自然周期替代周期受精類型［例（%）］IVF ICSI胚胎類型［例（%）］卵裂期囊胚期A組120 33.14±4.49 22.25±3.18 0.26±0.09 2.20±0.99 5.18±0.42 9.85（6.55，15.23）2.5（1.00，4.75）B組258 32.16±4.54 22.90±2.97 0.27±0.10 2.26±1.06 5.23±0.43 11.90（7.68，16.33）2.00（1.75，4.00）t/Z/χ2值P值1.959-1.932-0.267-0.500-1.070-1.765-0.062 0.116 0.051 0.054 0.790 0.617 0.285 0.078 0.950 0.733 52（43.33）68（56.67）10.52±2.14 1.37±0.48 107（41.47）151（58.53）10.61±2.10 1.41±0.49-0.385-0.816 0.135 0.700 0.415 0.713 17（14.17）103（85.83）33（12.79）225（87.21）0.313 0.576 88（73.33）32（26.67）182（70.54）76（29.46）0.417 0.519 54（45.00）66（55.00）107（41.47）151（58.53）

表4 不同補體C3 水平組間患者妊娠結局情況Tab.4 Pregnancy outcomes of patients with different levels of complement C3 例（%）

2.4 補體C3對自然流產的早期預測價值ROC曲線結果顯示：補體C3 水平的AUC 為0.760，最佳截斷值為1.32 g/L， 約登指數0.502，敏感度69.00%，特異度81.20%，見圖2。

3 討論

胚胎成功著床是F-ET 良好妊娠結局的開端，而補體系統在調控機體的免疫系統、防御功能、胚胎著床和妊娠維持中均起著極其關鍵的作用。本研究選取logistic 回歸分析和ROC 曲線探討補體C3 對F-ET 妊娠結局的早期預測價值。研究發現年齡是F-ET 臨床妊娠成功的獨立危險因素，補體C3 水平和胚胎類型是F-ET 臨床妊娠成功的保護因素，補體C3 水平對早期預測F-ET 妊娠結局有一定的臨床意義，其中補體C3 水平超過1.32 g/L 可能會導致自然流產率升高。

眾所周知，胚胎質量是影響胚胎著床的重要因素之一，而高齡女性患者可能會有冷凍胚胎，但存在胚胎質量差；胚胎發育潛能欠佳；線粒體數量減少；非整倍體率升高；流產率升高和臨床妊娠率降低的風險。年齡是影響F-ET 妊娠結局的重要因素之一［13-14］。本研究多因素logistic 回歸分析也發現年齡是F-ET 臨床妊娠成功的危險因素（OR=0.946，95%CI：0.898～0.996，P= 0.035）。同時本研究logistic 單因素回歸分析發現：不孕年限可能是影響F-ET 妊娠結局的因素（P＜ 0.05）；但logistic多因素回歸分析發現：其并不是影響F-ET 妊娠結局的獨立危險因素（P> 0.05）。因此，本研究認為不孕年限不能單獨用來預測F-ET 妊娠結局。

由于囊胚期胚胎是在體外繼續培養最終篩選形成的發育潛能更高的胚胎，因此，行囊胚期胚胎ET 可以改善妊娠結局，提高臨床妊娠率和胚胎著床率［15-18］。本研究也發現囊胚移植較卵裂期胚胎移植有較好的臨床妊娠結局（OR= 2.210，95%CI：1.391～3.511，P= 0.001），與陳曼等［19］的研究結論一致。基于這樣的結果，持續優化本中心的移植策略，優先選擇ET 囊胚期胚胎提高臨床妊娠率，讓更多的患者盡快達到生育的目的。

具有一定酶活性的補體系統廣泛分布在妊娠母胎界面、血液以及各種組織中。在維持妊娠的過程中，功能正常的補體系統發揮著舉足輕重的作用［20-22］。本研究發現補體C3 水平是F-ET 臨床妊娠的保護因素（OR= 83.812，95%CI：21.782～322.495，P＜ 0.001），其對F-ET 患者妊娠結局的AUC 為0.702， cut-off 值為1.05 g/L，此時其預測不孕癥患者接受F-ET 后獲得臨床妊娠的靈敏度為87.60%、特異度為52.00%。說明補體C3 水平對早期預測F-ET 妊娠結局有一定的臨床意義。同時本研究還發現：當排除年齡、不孕年限和胚胎類型等影響F-ET 妊娠結局的干擾因素之后，移植日補體C3 水平> 1.05 g/L 后F-ET 臨床妊娠率和著床率明顯高于移植日補體C3 ≤ 1.05 g/L（P＜ 0.05）。這一點也再次驗證了既往的研究，一定程度的補體C3 水平激活有利于胚胎著床。

補體C3 在人體內的含量是第一位，補體C4次之，在補體系統激活過程中補體C3 起著非常關鍵的作用。在生理條件下，一旦補體被激活，首先裂解出許多可以趨化炎癥細胞和增強白細胞吞噬功能的補體片段，提高機體防御能力，從而維持正常妊娠，但是如果母胎界面上補體過度激活會導致胎兒死亡。異常激活的補體會產生一連串的免疫性損傷，從而影響胚胎著床以及導致妊娠丟失。與正常孕婦相比，稽留流產患者體內補體水平明顯升高，補體C3 升高使得炎癥細胞大量匯集到胚胎組織，從而發生稽留流產［23］。有研究［24］認為補體C3 升高與靜脈血栓形成相關，而靜脈血栓的形成又會影響母胎界面的血流灌注，與RSA 和RIF密切相關。基于這樣的研究基礎，我們推測補體C3 水平對F-ET 后自然流產具有一定的早期預測價值。本研究ROC 曲線結果顯示：補體C3 水平預測自然流產的AUC為0.760，最佳截斷值為1.32 g/L，約登指數0.502，敏感度69.00%，特異度81.20%。F-ET 后胚胎成功著床以及妊娠的維持均需要一定水平的補體C3 水平，當補體C3 水平過高可能會增加自然流產的風險，從而也證實我們的推測。

綜上所述，補體激活程度在機體可控范圍內，一定程度的補體水平將有利于F-ET 后胚胎著床；如果體內補體過度激活，可能會導致妊娠失敗。本研究采用logistic 回歸分析探討影響F-ET 臨床妊娠結局相關因素，通過ROC 曲線得出了補體C3水平預測臨床妊娠結局以及自然流產的最佳截斷值，對臨床應用有一定的指導價值。在不遠的將來，在F-ET 周期調控補體C3 的水平有望為改善患者妊娠結局提供治療思路。然而，本研究未分析活產率，存在一定的局限性，后期將以活產率作為因變量進一步證實，同時希望進一步設計預處理方案的對照研究進一步證實。

【Author contributions】TANG Zhixia performed the experiments and wrote the article.MA Shuangying， ZHAGN Ying and SHEGN Jiajia analyzed the data.LI Juan， HE Jingjing and XUAN Henghua collected samples and prepared tables.HONG Mingyun reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.

【Conflict of interest】The authors declare no conflict of interest.