男性不育患者精液質量與精漿微量元素水平及精漿外泌體miR-184水平的關系

陳甫 劉斌 和帥軍 趙勇 王偉周

中國人民解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學中心婦產(chǎn)科 （北京 100037）

男性不育問題在現(xiàn)代社會越來越普遍，影響眾多夫婦生育健康，了解男性不育患者精液質量及其與其他因素之間的關系，對于找到潛在治療方法和預防策略至關重要。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）標準，育齡期夫婦有正常性生活超過1 年且沒有任何避孕措施，在排除女方不孕問題情況下，由于男方原因導致女方未能懷孕稱為男性不育［1］。有研究表示［2］，微量元素雖在人體體內含量較少，但對其各種生物學功能十分重要，微量元素攝入過量、缺乏等均會在一定程度上導致人體生理異常或疾病發(fā)生。近年大量研究表明［3］，精液質量是評估男性生育能力的重要指標，精漿微量元素與精子質量聯(lián)系密切，其可通過參與男性生殖系統(tǒng)多種酶的構成與激活，促進其合成性激素，進而通過精子發(fā)生、成熟等方式影響男性生殖系統(tǒng)的生理功能。外泌體（exosome）作為新型液體活檢指標，廣泛存在于人體多種體液中，與疾病發(fā)生、發(fā)展聯(lián)系密切，可通過運輸脂質、miRNA、蛋白質等信號分子進入受體細胞，并作用于受體細胞的靶基因中，影響其功能，參與多種生理、病理過程。而生殖細胞分泌外泌體可攜帶miRNA 進入到受體細胞中，調控其基因表達，導致人體細胞功能改變以及生殖系統(tǒng)相關疾病的發(fā)生與發(fā)展［4］。生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，miR-184 靶基因富集于男性生殖系統(tǒng)的發(fā)育中，其細胞間相互作用、細胞分化等與男性生殖、精子產(chǎn)生密切相關。此外，miR-184 作為miRNA 家族主要的成員，在人體中相應轉錄本分子量通常為84 bp，而成熟的miR-184 表達于男性睪丸組織中，其在精子發(fā)生過程中發(fā)揮著關鍵的生理功能，與男性不育聯(lián)系密切［5］。但目前關于微量元素水平、miR-184 表達與男性不育關系報道較少，因此本研究通過探討男性不育患者精液質量與精漿微量元素水平及精漿外泌體中miR-184 水平的關系，為之后臨床治療該類疾病提供醫(yī)學參考，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取本院2022 年1 月至2023 年7月收治的155 例男性不育患者為不育組，另選取同期155 名體檢正常者為正常組。兩組一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義（P> 0.05），具有可比性，見表1。本次研究開始前經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準（倫理批號：2021-02 號）。

表1 兩組一般資料比較Tab.1 Comparison of general information between two groups ±s

組別不育組（n = 155）正常組（n = 155）t值P值年齡（歲）28.11±3.35 27.95±3.64 0.403 0.688體質量指數(shù)（BMI）（kg/m2）25.95±2.26 26.11±2.02 0.657 0.512體質量（kg）79.89±6.56 80.11±6.34 0.300 0.764腰圍（cm）92.16±8.56 91.89±8.76 0.274 0.784

1.2 納入標準（1）不育組符合《男性生殖遺傳學檢查專家共識》［6］中不育癥診斷標準，正常組為健康男性；（2）不育組為性生活正常，未行避孕措施1年以上無法生育，且排除女方不孕問題，因男方因素導致女方不育者；（3）兩組均簽署知情同意書。

1.3 排除標準（1）存在泌尿道手術史；（2）存在生殖感染史；（3）家族存在男性生殖功能相關疾病史；（4）研究前6 個月應用過抗心律失常、溶栓藥物、免疫抑制劑等影響本研究結果藥物；（5）合并心、肝、腎等臟器異常者；（6）認知、精神功能異常者；（7）合并射精管疾病、前列腺等影響測量精液體積的疾病。

1.4 方法（1）精液質量參數(shù)：①標本采集：囑禁欲3～7 d，自慰法取精液置于無菌容器中，存于37 ℃溫育30 min，等待完全液化。②精液質量檢測：嚴格參考WHO《人類精液檢查與處理實驗室手冊》［7］進行操作，等待精液完全液化后，使用CASA全自動精子分析儀（西班牙MICROPTIC 公司）檢測精子密度、精子總活力（PR+NP）、前向運動精子（PR）、精子平均曲線運動速度、精子平均直線運動速度、精子平均路徑運動速度、精子頭部側向平均振幅（ALH）。（2）精漿微量元素水平檢測：精液采集2 h 內，使用離心機（SIGMA 公司，型號：3-15）以3 000 r/min 轉速，離心10 min，去除精子細胞獲得精漿，采用原子吸收分光光度儀（濰坊華盛醫(yī)療器械有限公司，型號：SK6880 型）檢測精漿中鋅（Zn）、銅（Cu）、鎂（Mg）、鈣（Ca）、鐵（Fe）、鉛（Pb）水平。（3）精漿外泌體中miR-184 相對表達量檢測：①精漿外泌體提取與鑒定：獲得精漿方式同（2），然后按照ExoQuick-TM 試劑盒（美國SBI 公司）說明書進行操作，取100 μL 加入150 μL 磷酸緩沖鹽（PBS）溶液（上海博湖生物科技有限公司，貨號：BH-6605）稀釋，然后加入63 μL ExoQuick 試劑混勻，離心分離出外泌體，最后使用透射電子顯微鏡（北京歐波同光學技術有限公司，型號：Talos F200X S/TEM）鑒定所提取的外泌體的形態(tài)、大小以及微結構。②RNA 提取、逆轉錄及熒光定量PCR 法：采用美國Thermo 公司生產(chǎn)的Trizol 試劑提取總RNA，使用One Step Prime Script miRNA c DNA 合成試劑盒行逆轉錄反應，將RNA 反轉錄成cDNA，并使用實時熒光定量PCR 法檢測精漿外泌體中的miR-184 水平，應用相對定量法來計算miR-184 的相對表達量，公式：2-ΔCt值=2-ΔCt值（miR-184）-2-ΔCt（miR-39），miR-39 為外參基因。（4）通過Spearman 秩相關分析男性不育患者精液質量與微量元素水平及外泌體中miR-184 水平的相關性。r值：0.1 ≤ 低度相關 ≤ 0.3，0.3 ＜ 中度相關≤ 0.7，0.7 ＜ 高度相關。

1.5 統(tǒng)計學方法選用SPSS 19.0 統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行處理，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，計數(shù)資料以構成比或率（%）表示，組間比較行χ2檢驗；相關性采用Spearman 秩相關分析檢驗；以P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組精液質量參數(shù)比較不育組精子濃度、精子總活力（PR+NP）、前向運動精子（PR）、精子平均曲線運動速度、精子平均直線運動速度、精子平均路徑運動速度、精子頭部側向平均振幅（ALH）顯著低于正常組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 兩組精液質量參數(shù)比較Tab.2 Comparison of semen quality parameters between two groups ±s

表2 兩組精液質量參數(shù)比較Tab.2 Comparison of semen quality parameters between two groups ±s

精液參數(shù)精子濃度（106/mL）PR+NP（%）PR（%）精子平均曲線運動速度（μm/s）精子平均直線運動速度（μm/s）精子平均路徑運動速度（μm/s）ALH（μm）不育組（n = 155）36.05±6.25 42.56±7.11 35.25±5.23 31.15±4.12 13.19±2.12 15.85±2.12 1.62±0.16正常組（n = 155）45.98±9.56 51.15±6.56 42.65±7.15 40.22±5.85 19.15±3.12 23.45±5.12 2.38±0.21 t值10.824 11.055 10.400 15.782 19.671 17.075 35.840 P值0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

2.2 兩組精漿微量元素水平及精漿外泌體中miR-184 相對表達量比較兩組Fe 水平比較差異無統(tǒng)計學意義（P> 0.05），不育組Zn、Mg、Ca 水平顯著低于正常組，Cu、Pb 水平及miR-184 相對表達量高于正常組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05），見表3。

表3 兩組精漿微量元素水平及精漿外泌體中miR-184 相對表達量比較Tab.3 Comparison of trace element levels and relative expression levels of miR-184 in seminal plasma exosomes between two groups ±s

表3 兩組精漿微量元素水平及精漿外泌體中miR-184 相對表達量比較Tab.3 Comparison of trace element levels and relative expression levels of miR-184 in seminal plasma exosomes between two groups ±s

組別不育組（n = 155）正常組（n = 155）t值P值Zn（μmol/L）8.19±2.65 14.26±2.35 21.336 0.000 Cu（μmol/L）41.85±4.05 21.56±2.16 55.035 0.000 Mg（mmol/L）0.87±0.02 0.93±0.11 6.681 0.000 Ca（mmol/L）1.98±0.23 2.36±0.14 17.570 0.000 Fe（mmol/L）8.36±1.12 8.29±1.22 0.526 0.599 Pb（μg/mL）10.95±2.11 5.46±1.05 29.001 0.000 miR-184 1.25±0.19 0.72±0.15 27.258 0.000

2.3 男性不育患者精液質量與精漿微量元素水平的相關性男性不育患者Zn、Cu 元素水平分別與精子濃度、PR+NP、PR 呈正、負相關（P＜ 0.05），Pb 元素水平與ALH 呈負相關（P＜ 0.05），見表4。

表4 男性不育患者精液質量與精漿微量元素水平的相關性Tab.4 Correlation between semen quality and trace element levels in semen of male infertility patients r 值

2.4 男性不育患者精液質量與外泌體中miR-184相對表達量的相關性男性不育患者miR-184 相對表達量與精子濃度、PR+NP、PR、精子平均曲線運動速度呈負相關（P＜ 0.05），見表5。

表5 男性不育患者精液質量與外泌體中miR-184 相對表達量的相關性Tab.5 Correlation between semen quality and relative expression of miR-184 in exosomes of male infertility patientsr 值

3 討論

Zn、Mg、Ca 等各種微量元素以游離或結合形式存在于男性精漿中，可作為營養(yǎng)介質促進其精子成熟，與男性生殖系統(tǒng)發(fā)育、性功能以及性激素水平密切相關，其中某些元素代謝異常可引發(fā)男性不育癥［8］。既往研究證實［9］，外泌體主要由各種不同的細胞分泌，穩(wěn)定存在于人體體液中，可直接反映其細胞生理、病理改變。同時外泌體可攜帶miRNA 等特定功能性分子無障礙進入其受體細胞，進而調控受體細胞的基因表達。國內外研究報道［10］，男性精漿中含有外泌體，其所含微囊泡可保護mRNA，且miRNA 與男性不育聯(lián)系密切，因而檢測外泌體中miRNA 對男性不育分子標志物研發(fā)具有積極意義，但關于精漿外泌體中miR-184在男性不育患者表達變化特征以及價值報道頗少。因此本研究觀察男性不育患者精液質量與精漿微量元素水平及精漿外泌體中miR-184 水平的關系。

本研究結果顯示，不育組精子濃度、PR+NP、PR、精子平均曲線運動速度、精子平均直線運動速度、精子平均路徑運動速度、ALH 顯著低于正常組，提示男性不育發(fā)生后，其精子質量隨之降低，且精漿外泌體中miR-184 水平和男性不育發(fā)生聯(lián)系密切。有研究［11］指出，男性不育可能與生殖系統(tǒng)的結構或功能異常有關，如阻塞性精索靜脈曲張、輸精管堵塞、附睪炎等問題會導致男性不育患者精子無法正常到達射精液中。同時，睪丸作為男性精子產(chǎn)生地，睪丸損傷、睪丸發(fā)育異常、睪丸炎癥等異常會導致精子數(shù)量減少或質量下降。而睪酮作為主要的男性激素，其分泌異常可影響其精子質量［12］。此外，吸煙、飲酒過量、藥物濫用、暴露于有害化學物質或輻射等不良生活方式、環(huán)境因素以及染色體異常、單基因疾病等遺傳疾病也可能導致男性不育和精子質量下降［13］。又有研究指出［14-16］，miR-184 表達于男性睪丸、腦組織以及上皮組織，且睪丸中miR-184 表達水平遠遠高于腦組織，是睪丸特異性高表達的miRNA。此外，男性一般出生后，其睪丸組織中miR-184 表達隨著睪丸的發(fā)育持續(xù)升高，且miR-184 表達顯著聚集于與精子發(fā)生聯(lián)系密切的睪丸生精細胞中。因而推測精漿外泌體中miR-184 可能來源于睪丸組織中的生精細胞，男性不育患者由于精子功能發(fā)生改變以及生精細胞凋亡增加，進而導致精漿外泌體miR-184 的水平顯著高于正常男性，與本研究結果相互印證。

本研究結果顯示，不育組Zn、Mg、Ca 水平顯著低于正常組，Cu、Pb 水平及miR-184 相對表達量高于正常組，男性不育患者Zn 元素水平與精子濃度、PR+NP、PR呈正相關，Cu元素水平與精子濃度、PR+NP、PR呈負相關，Pb元素水平與ALH呈負相關，與BARBU 等［17］研究結論相符。BEIGIHARCHEGANI等［18］研究指出，Zn 不僅是人體不可或缺的微量元素之一，還是男性精液中最關鍵的微量元素之一，在其男性生殖系統(tǒng)含量較高，能有效緩解男性精子膜脂質氧化，保持胞膜結構完整性、穩(wěn)定性。同時，Zn 元素存在于男性睪丸內的睪細胞中，參與精子生成、獲能、成熟過程以及腦垂體促性腺激素的調節(jié)，因此當男性不育患者精漿中Zn 元素缺乏時，會對其精子發(fā)生、成熟、獲能過程以及性腺內分泌功能、生殖功能造成負面影響，并導致精子功能、性腺內分泌功能及生殖功能障礙，影響其活性，降低精子質量與活性，最終造成不育［19-21］。本研究發(fā)現(xiàn)，男性不育患者精漿中Cu 元素水平明顯升高，且與其精子密度、PR+NP、PR 呈負相關，原因可能是Cu 作為許多酶的特有活性成分，水平增高不僅直接減弱男性不育患者精子活力，還會通過干擾垂體分泌功能，影響其精子活力，導致精子質量下降［22-23］。此外本研究中男性不育患者Pb 水平較高，Pb 元素水平與精子頭部側向平均振幅呈負相關，主要是由于Pb 對男性不育患者生殖系統(tǒng)具有毒性作用，含量過多會過度消耗其體內抗氧化物酶活性，進而導致男性生殖功能出現(xiàn)障礙，即使Pb 濃度較低亦會對其精子頭部側向平均振幅造成影響［24-25］。

本研究結果顯示，男性不育患者miR-184 相對表達量與精子濃度、PR+NP、PR、精子平均曲線運動速度呈負相關，提示隨著男性不育患者miR-184相對表達量的顯著升高，其精子濃度、PR+NP、PR會降低，精子平均曲線運動速度會減弱。有研究［26］表示，高表達miR-184 可干擾男性不育患者精子正常發(fā)育和成熟過程，致使精子產(chǎn)生或釋放異常，導致其精子數(shù)量減少、密度降低。同時，miR-184的高表達可能與炎癥反應和損傷修復密切相關，如男性不育患者存在炎癥反應或損傷，可導致miR-184表達增加，進而影響到精子數(shù)量和密度［27］。而又有研究［28］表示，miR-184 作為一種微小RNA，在男性不育患者細胞內起著負向調控基因表達的作用，當精漿外泌體中miR-184 的表達量增加時，其可通過抑制特定基因表達，影響精子活動力相關基因表達，從而降低精子活動率。同時，高表達的miR-184 可干擾男性不育患者精子形態(tài)和結構的正常發(fā)育，致使其精子運動能力較弱，無法有效地前進或到達目標地點，懷疑可能與精子形態(tài)異常、精子運動能力減弱、精子鞭毛缺陷等問題密切相關［29］。本研究中男性不育患者miR-184 相對表達量與精子平均曲線運動速度呈負相關，主要是由于高表達的miR-184 通過靶向調控男性不育患者精子運動能力相關基因，干擾精子能量代謝通路和細胞結構的正常發(fā)育，促使其發(fā)生精子鞭毛缺陷、線粒體功能異常等問題，并導致精子存活能力下降，游動時間縮短，進而致使精子平均曲線運動速度降低［30-31］。基于以上分析，證實微量元素水平及外泌體中miR-184 水平可能為男性不育治療提供參考，故今后治療男性不育可嘗試性指導患者攝入微量元素相關藥物及針對miR-184指標的相應藥物用于改善其精液質量。這些措施可能會對男性不育患者的治療產(chǎn)生積極影響，但具體效果還需要進一步的研究和臨床實踐來驗證。

綜上所述，男性不育患者精液質量與微量元素水平及外泌體中miR-184 水平密切相關，微量元素水平及外泌體中miR-184 水平可能為男性不育治療提供指導。此外，本研究仍存在一定局限性，如男性不育患者精液質量可能受年齡等較多因素影響，本文更多的是觀察微量元素與miR-184指標，后續(xù)研究可納入更多相關臨床指標。

【Author contributions】CHEN Fu performed the experiments and wrote the article.LIU Bin performed the experiments.HE Shuaijun and ZHAO Yong revised the article.WANG Weizhou designed the study and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.

【Conflict of interest】The authors declare no conflict of interest.