淋巴樣增強結合因子1在B細胞慢性淋巴增殖性疾病中的表達

趙敏 倪平 翟惠瑩 靳小可 楊玉瓊

1蕪湖市第二人民醫院血液內科（安徽蕪湖 241000）；2皖南醫學院附屬第一醫院（弋磯山醫院）血液內科（安徽蕪湖 241000）

B 細胞慢性淋巴增殖性疾病（B cell chronic lymphoproliferative disorders， B-CLPD）是一類以成熟B 淋巴細胞單克隆增多為主要表現的淋巴瘤亞型，血常規類似白血病，病理類型以惰性淋巴瘤為主，臨床相對少見。B-CLPD 主要包括CLL、白血病期套細胞淋巴瘤（mantle cell lymphoma， MCL）、白血病期濾泡細胞淋巴瘤（folicular lymphoma， FL）、白血病期邊緣區淋巴瘤（marginal zone lymphoma，MZL）、淋巴漿細胞淋巴瘤（lymphoplasmacyticlymphom， LPL）等形態上以小淋巴細胞為主的淋巴瘤亞型。依據流式免疫分型、細胞遺傳學和分子生物學可區分大部分疾病［1］。B-CLPD以CLL常見，流式免疫分型結合CLL 積分可診斷典型病例，但仍缺乏特異性和敏感性的指標［2］。淋巴樣增強結合因子1（lymphoid enhancer-binding factor 1， LEF1）是Wnt/β-catenin 通路的轉錄因子，在調節細胞增殖和生存中發揮重要作用［3］，作為TCF/LEF 家族的成員，LEF1 在前B 淋巴細胞和T 淋巴細胞上表達，在早期淋巴細胞發育中起關鍵作用［4］。LEF1 在血液腫瘤患者中的表達研究，國內報道以急性淋巴細胞白血病為主，對B-CLPD 這類惰性淋巴瘤的研究尚未見系統報道。本研究采用免疫組織化學染色方法，研究B-CLPD 患者中LEF1 蛋白表達情況，探索其在B-CLPD 各亞型，尤其是在CLL 的診斷和鑒別診斷中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2018 年9 月至2023 年6 月因血細胞異常或淋巴結腫大就診我院的B-CLPD 患者58 例，其中CLL 20 例，MCL 12 例，FL 5 例，MZL 11 例，LPL 8 例，毛細胞白血病（hairy cell leukemia，HCL）2 例；對照組選取非惡性血液系統疾病患者的骨髓活檢標本20 例。B-CLPD 患者診斷以及亞型的診斷參照中華醫學會血液學分會、中國抗癌協會血液腫瘤專業委員會修訂的專家共識［1］；所有淋巴結病理診斷參照2017 年第4 版WHO 淋巴造血系統組織腫瘤分類標準［5］。本研究經蕪湖市第二人民醫院倫理委員會批準（批號：2022-JS-022），并獲得所有患者知情同意。58例中男44例，女14 例，年齡36～85 歲，中位年齡65（58，73）歲，B-CLPD 各亞型以及臨床基本資料見表1。對照組20 例中男10 例，女10 例，年齡35～70 歲，中位年齡為61（45，69）歲。

表1 58 例B-CLPD 患者臨床資料Tab.1 Clinical characteristic of 58 B-CLPD patients例

1.2 免疫組織化學檢測方法及結果判讀標準骨髓活檢標本經3.7%中性甲醛固定后，經3.7%硝酸甲醛溶液脫鈣、流水沖洗4 h，常規石蠟包埋，3 μm厚連續切片，常規HE 染色以及檢測CD3、CD5、CD10、CD20、CD38、CD138、CD34、CCND1、TdT、PAX-5 等抗原，按說明書檢測LEF1 抗原表達。以上抗體均購自福州邁新生物技術開發有限公司。采用EnVision 法，二氨基聯苯胺顯色。20 例對照組骨髓活檢標本，除做LEF1 染色外，同時標記CD3和PAX-5抗原，以區別正常T淋巴細胞中LEF1的表達。淋巴結或組織活檢標本經10%甲醛固定，常規石蠟包埋，切4 μm 切片，HE 染色和免疫組化染色。采用扁桃體組織作為LEF1 陽性對照，反應性增生濾泡內和濾泡間區T 淋巴細胞LEF1染色陽性。空白對照以PBS 代替一抗。LEF1 染色以≥ 10%腫瘤細胞核內出現棕黃色或棕褐色顆粒判為陽性。

1.3 常規染色體核型分析檢測方法及結果判讀標準取骨髓標本2 mL，在RPMI 1640 培養液中短期培養24 h，收獲前30 min 加秋水仙胺，收獲細胞。低滲35 min，用固定液（甲醇∶冰乙酸為3∶1）固定3 次；細胞懸液制片，制備染色體標本并采用G 顯帶吉姆薩染色后進行核型分析，核型描述根據《人類細胞遺傳學國際命名體制（ISCN2013）》。

1.4 原位熒光雜交（In Situ fluorescence hybridization， FISH）檢測方法及結果判讀標準4 種DNA 特異性探針：RB1、ATM、P53、CSP12，分別定位于13q14、11q22.3、17p13.1、12p11.1-12q11.1，以上探針購于北京金蓓嘉生物技術公司。取新鮮骨髓或外周血標本2 mL，參照說明書，標本提取單個核細胞，低滲、固定后，再滴片、脫水、氣干等步驟完成制片。室溫下滴加配制好的探針，封片；將玻片置于原位雜交儀中，72 ℃變性5 min，42 ℃雜交16 h，然后洗脫、染色。熒光顯微鏡下（日本Olympus 公司）通過DAPI/PI/FITE 三色濾光鏡觀察雜交信號。每份標本計數至少200 個細胞，并記錄雜交信號的陽性率。正常間期細胞中RB1 為2 個綠色（2G），ATM 為2 個紅色（2R），P53 為2 個綠色（2G），CSP12為2 個紅色（2R），在異常間期細胞中RB1 為1G（13q-閾值：4.1%），ATM 為1R（11q-閾值：3.3%），P53 為1G（17p-閾值：4.5%），CSP12 為3R（+12 閾值：3.8%），以異常細胞大于上述閾值為陽性標準。

1.5 統計學方法應用SPSS 22.0 統計分析軟件，本研究中計量資料均為非正態分布，采用中位數（四分位數）表示，計數資料以%表示，采用χ2檢驗和似然比χ2檢驗；以P＜ 0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 LEF1的表達情況58例B-CLPD患者和20例對照組中LEF1 的表達差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖1、表2。

注：A，1 例CLL 患者LEF1 表達，細胞彌漫陽性；B，1 例LPL 患者，LEF1 表達陰性圖1 骨髓活檢標本LEF1 的表達情況（SP， × 400）Fig.1 The expression of LEF1 protein in 2 patients with bone marrow samples by immunohistochemistry （SP， × 400）

表2 B-CLPD 各組和對照組中LEF1 蛋白表達情況Tab.2 The expression of LEF1 in B-CLPD sub-groups and control group例

2.2 CD5+的B-CLPD 患者的LEF1 和其他蛋白表達的相關性32 例CD5+的B-CLPD（CLL20 例，MCL12 例）。LEF1 陽性組中，CD23 陽性、CD200 陽性、FMC-7 陰性、CCND1 陰性、SOX11 陰性的比例明顯高于LEF1 陰性組（P＜ 0.001），見表3。而LEF1 的表達和CD22、CD79b 的表達無相關性（P>0.05）。采用兩種CLL 積分方法計算32 例患者的積分，LEF1 陽性的患者中，積分典型例數明顯高于陰性組（P＜ 0.001），見表4。

表3 CD5 陽性患者中LEF1 表達和其他抗原表達的相關性Tab.3 The correlation between LEF1 expression and other antigen expression in CD5 positive patients例

表4 CD5 陽性患者中LEF1 表達和CLL 積分的相關性Tab.4 The correlation between LEF1 expression and CLL score in CD5 positive patients例

2.3 LEF1 的表達和CLL 患者細胞遺傳學特點的相關性20 例CLL 患者，常規進行染色體分析和FISH 檢測，其中：13q-陽性7 例；+12 陽性4 例（其中1 例為復雜染色體異常）；11q-4 例；17p-（TP53）陽性0 例。在11q-和13q-陽性患者中，LEF1 均陽性；4 例LEF1 陰性的患者，2 例+12 異常，16 例LEF1 陽性患者中，2 例+12 異常，+12 異常檢出率在LEF1陰性組中高于LEF1 陽性組，但差異無統計學意義（P> 0.05）。

3 討論

B-CLPD 是一類淋巴瘤亞型的統稱，此類淋巴瘤容易累及骨髓及外周血，表現為一系或多系血細胞異常，伴或不伴淋巴結、肝脾腫大；CLL、MCL、FL、MZL 等均在此病的范疇。因為B-CLPD 的特殊臨床表現，各亞型的鑒別主要依靠骨髓標本的流式免疫分型和組化染色；但是各亞型流式表型變異多，部分亞型之間抗原表達有重疊［6］，表型不典型的病例，仍是診斷難點。因此，篩選更多的特異性指標，作為鑒別診斷依據是必要的。

LEF1 基因序列上含有高度保守的高遷移率基團DNA 結合域，并在Wnt/β-catenin 信號傳導中的發揮核轉錄因子作用［7］。LEF1 在乳腺癌、大腸癌等多種惡性腫瘤中異常表達［8］；在血液系統惡性腫瘤的動物模型中，LEF1 的過度表達可誘導生成急性髓系白血病［9］，LEF1 外顯子2 和外顯子3 發生點突變（K86E、P106L）后，激活c-myc 和cyclin D1 的表達，導致白血病細胞持續增殖［10］。LEF1 在T 細胞和B 細胞分化和增殖中是必需的，因此正常的前B 和T 淋巴細胞表面均有LEF1 的表達，在正常成熟的B 淋巴細胞表面，LEF1 不表達；在各種B 淋巴增殖性疾病患者中，LEF1 主要在急性淋巴細胞白血病（acute lymphocyte leukemia， ALL）［11］和CLL［12］、大細胞轉化型淋巴瘤、一部分霍奇金淋巴瘤中表達［13］，而在DLBCL、MCL 等類型中為陰性［14］。

MENTER 等［15］報道298 例小B 細胞淋巴瘤，CLL 患者LEF1 的陽性率為92%；而其他類型的小B 細胞淋巴瘤，LEF1 陰性。RANGAN 等［16］也報道129 例 CLL 患者，LEF1 陽性率為 98%，33 例MCL中僅2 例陽性；142 例MZL 和50 例LPL 均陰性。本研究檢測58 例B-CLPD 患者LEF1 表達情況，在20 例CLL患者中，陽性率為80%，而在其他B-CLPD亞型中，LEF1 個別陽性，和文獻報道一致。CD200是近年來發現診斷CLL 的一個新標志，在CD5 陽性的B-CLPD 的患者中，CLL 患者CD200 陽性，而MCL 患者陰性；在其他CD5 陰性B-CLPD 患者中，CD200也普遍為陰性或低水平表達［17］。本研究17 例LEF1 陽性的患者中，16 例患者CD200 陽性，LEF1表達和CD200 的表達有明顯相關性；而LEF1 和CCND1、SOX11 等MCL 的指標呈負相關。采用2種CLL 積分方法［2，18］對CD5 陽性的患者進行評分，LEF1 的陽性率在CLL 積分典型的患者也明顯升高。LEF1 作為一個診斷CLL 的標志，具有較高的敏感性和特異性。

LEF1 在不同病種之間表達強弱存在差異。陳雪等［12］報道LEF1 在ALL 中普遍為中等至強陽性表達，中位值為90%，而在CLL 中表達的中位值為45%。REA等［19］發現在霍奇金淋巴瘤各亞型中，LEF1 在經典型霍奇金淋巴瘤表達多為強陽性，且陽性細胞較多；而在結節淋巴細胞為主型中，僅表現為陽性，陽性細胞數多＜ 50%。SOLIMAN 等［20］采用流式細胞術分析CLL 患者的LEF1 的熒光強度，CLL 積分不典型的患者，LEF1 的熒光強度低于積分典型者（211vs.786）。CLL 積分低于4 分的CD5+B-CLPD 患者，排除MCL 后，其淋巴瘤亞型診斷是臨床的難點，而LEF1 是一個很好的輔助診斷指標。本研究中，4 例骨髓標本LEF1 陰性的CLL患者中，2 例為淋巴結病理診斷，其中1 例CLL 流式積分為3 分。LEF1 作為一個診斷CLL 的特異性指標，在CLL 的診斷中有較高的特異性，而病理診斷雖然為“金標準”但存在主觀判斷的因素，因此，對于淋巴結病理和相關組化矛盾的病例，還需進一步驗證二者的相關性。在非CLL 的B-CLPD 患者，LEF1 陽性也有個別報道［21］。

LEF1 作為CLL 的診斷指標之一，其在預后方面的意義尚不確定。+12 是CLL 預后中等的一個細胞遺傳學指標，發生率約占CLL 患者的1/3［22］。文獻報道，LEF1 陰性的CLL 患者，+12 號染色體異常比例高于陽性組［20］。本研究中，4 例LEF1 陰性的患者，2 例+12 異常，發生率高于LEF1 陽性組以及其他染色體異常組，和文獻報道相符。但病例數少，后續還需擴大樣本量進一步驗證。同時，LEF1 陰性的這部分CLL 患者在細胞遺傳學、分子生物學以及對藥物治療反應上存在何種特點目前尚無大樣本的研究，值得進一步探索。

綜上所述，LEF1 在慢性淋巴細胞白血病患者的診斷和鑒別診斷中，有較好的靈敏性和特異性，是B-CLPD 鑒別診斷的良好補充。

【Author contributions】ZHAO Min performed the experiments and wrote the article.ZHAI Huiying and JIN Xiaoke performed the experiments.NI Ping revised the article.YANG Yuqiong designed the study and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.

【Conflict of interest】The authors declare no conflict of interest.