結核特異性QFT-TB在結核患者不同類型標本中的檢測價值

陳騎 張雅曦 張明霞 張潔云 楊倩婷

深圳市第三人民醫院肝病研究所（廣東深圳 518112）

結核病（tuberculosis， TB）是結核分枝桿菌復合體（mycobacterium tuberculosis complex， MTB）引起的傳染性疾病。病原體主要感染肺部（肺結核），在機體免疫低下也可以感染人體其他組織器官（肺外結核），如淋巴結、腸、胸膜和骨結核等［1］。結核引起全球廣泛傳播，并嚴重威脅到公眾的健康，尤其在發展中國家，也是單一傳染源感染造成主要死亡原因［2］。盡管在結核病有大量深入研究，但在降低MTB 感染的死亡率和早期結核的診斷并未取得明顯改善。而耐多藥結核病的傳播遞增、人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）合并感染趨勢和治療時間問題顯得更加緊迫［3］。但由于病原學依據的缺乏，臨床確診困難或延遲，容易漏診或誤診而導致社區隱匿傳播，防控難度大。因此開發一種簡單、特異性、低成本、高靈敏度的病原體檢測方法對于遏制傳播和治療結核病非常重要。

γ 干擾素釋放試驗（interferon-gamma release assays， IGRAs）是以體外特異性刺激全血樣本，然后檢測培養上清中γ-干擾素分泌。目前該檢測方法作為MTB 常規臨床結核病的輔助診斷。本研究將基于IGRAs，結合臨床常規的痰抗酸涂片（acid-fast baclilli， AFB）、GeneXpert、TB-DNA 和病理學診斷的檢測方法，評價IGRAs 在臨床診斷不同類型的結核病的效能，為社區防控和臨床診療提供補充依據。

1 資料與方法

1.1 研究對象研究對象收集于2023 年1 - 7 月肺病醫學部住院活動性結核（Active tuberculosis，ATB）患者，經實驗室檢測診斷結核患者546 例，其中男434 例，女112 例，平均年齡（47±17）歲：包括細菌學［痰涂片陽性（AFB+）146 例，痰涂片陰性（AFB-）247 例）］，分子生物學陽性結核患者117 例（Xpert 69例，TB-DNA 48例），其中男81例，女36例，平均年齡（49±19）歲；病理組織學陽性患者36 例，其中男19例，女17例，平均年齡（48±15）歲。肺外結核患者72 例，其中男34 例，女38 例，平均年齡（36±15）歲。HIV 患者676例，其中男603例，女73例，平均年齡（36±12）歲。待腎移植患者319例，其中男207 例，女112 例，平均年齡（42±11）歲；自身免疫性疾病患者185 例，其中男37 例，女148 例，平均年齡（49±14）歲；結核密切接觸者1 237 例，其中男648 例，女589 例，平均年齡（39±18）歲；特殊樣本胸水276 例、腹水25 例，其中男218 例，女83 例，平均年齡（45±18）歲。同期收集健康體檢為對照組91 例，其中男26 例，女65 例，平均年齡（35±10）歲。

入組診斷標準：依據結核病專家共識《肺結核診斷和治療指南》診斷標準［4］；活動性肺結核：經病原學痰涂片陽性、分子生物學陽性、影像學和病理學符合結核病病理改變。肺外結核：影像學和病理活檢符合結核病理改變。所有研究對象年齡18～68 周歲，無免疫性疾病及合并癥等基礎疾病。健康對照：影像學排除結核感染，既往無接觸史、無服用抗結核藥物等。本研究經深圳市第三人民醫院倫理委員會審批通過（批件號：深圳三院倫審科研字［2022-110］號）。

1.2 試劑與儀器痰涂片抗酸（AFB）染色試劑珠海貝索生物技術有限公司；QuantiFERON-TB Glod試劑盒購自凱杰生物；TB-DNA 核酸檢測試劑購自達安基因，PCR 儀器型號ABI-7500。GeneXpert 檢測試劑盒和儀器購自美國賽沛公司全自動熒光定量PCR 儀Cepheid 工作站。上述檢測嚴格按照說明書進行操作。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集對每例研究對象采用肝素鋰抗凝管采集新鮮外周血6 mL 用于QuantiFERON-TB Glod 檢測，每個樣本設陽性對照、空白對照和抗原檢測管。結核患者留取有效晨痰3～4 次樣本用于細菌學檢測。肺外結核患者活檢或手術病理送檢。結核性胸、腹水無菌杯收集新鮮樣本50 mL送檢。

1.3.2 檢測方法取新鮮全血2 mL 分別加入設陽性對照、空白對照、抗原檢測管TB1 和抗原檢測管TB2，其中檢測管預先加入結核特異性抗原ESAT-6和CFP-10，充分混勻，放置37 ℃孵育箱16～18 h，離心收集上清備用。采用ELISA 試驗檢測上清血漿中γ-干擾素因子分泌含量。結果判定：抗原檢測管-空白管 ≥ 閾值判定為陽性，表示可能結核潛伏感染或活動性結核。

1.4 統計學方法實驗數據使用GraphPad Prism V7 軟件進行統計分析，計量資料以±s表示，計數資料以例數或百分比（%）表示，采用χ2檢驗進行組間比較。以P ＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 不同疾病QFT 檢測篩查結果比較在對結核患者、結核密接者和免疫缺陷或低下易合并感染結核的患者中，通過外周血QFT-TB 檢測結果發現，肺結核患者陽性率（83.69%）最高，與健康對照之間比較差異有統計學意義（χ2= 143.360，P＜0.001）；免疫缺陷或低下患者中HIV 患者陽性率（11.84%）最低，較健康人群有明顯差異有統計學意義（χ2= 12.462，P＜ 0.001）；結核密切接觸者總體陽性率為32.41%，不同年齡段組間比較年齡較高（51～75 歲組）陽性率（52.15%）最高，較健康對照比較差異有統計學意義（χ2= 19.979，P＜ 0.001）。見表1。

表1 不同類型疾病QFT-TB 檢測結果比較Tab.1 Comparison of QFT-TB test results of different types of diseases 例（%）

2.2 結核病實驗診斷方法的效能比較在結核病實驗室診斷方法學中，細菌學抗酸涂片陽性結核患者QFT-TB 檢出符合率最高為91.09%；分子生物學診斷陽性結核患者：Xpert 陽性患者QFTTB 檢出符合率為88.73%，TB-DNA 陽性結核患者QFT-TB 檢出符合率為81.63%；病理診斷結核患者中QFT-TB 檢出符合率為72.22%。各組間比較差異有統計學意義（P＜ 0.05）。見表2。

表2 在不同診斷結核病方法學符合率比較Tab.2 Comparison of the coincidence rate of different diagnostic methods for tuberculosis例（%）

2.3 在結核性胸、腹水樣本的診斷效率肺結核肺部病灶常累及胸腔形成胸膜滲出液，胸腔積液中有大量的淋巴細胞、巨噬細胞和粒細胞。在收集的276 例胸水中QFT 的檢出率為60.50%，檢測不確定結果占29.71%。檢出率較不確定結果差異有統計學意義（P＜ 0.001）。腹腔積液中QFT 檢出率為44.00%，不確定結果為36.00%，二者比較差異無統計學意義（P> 0.05）。見表3。

表3 不同樣本類型檢測的診斷效能Tab.3 Diagnostic efficacy of different sample types例（%）

3 討論

結核分枝桿菌和艾滋病毒已經構成世界公共衛生健康安全挑戰，據統計艾滋病毒/結核病雙重感染是導致死亡率高的原因之一［5］。然而，中國屬于發展中國家結核病高發地區，人口多、流動聚集復雜，導致潛伏性結核感染基數大［6-7］。早期高效率篩檢出結核菌和傳染病的嚴密防控策略，是遏制、消除結核病傳播的關鍵，更是能降低其感染引起的死亡率［8］。

目前結核病的早期快速診斷技術存在一定的缺陷，抗酸涂片陽性率僅有40%左右，存在一定的漏檢率［9］；分子生物學GeneXpert 檢測易受樣本限制［10-11］；結核菌培養時間周期較長，不利于早診斷、早治療［12］。抗原檢測成分無論源于MTB 細胞壁、細胞質，還是分泌蛋白和某些代謝組分，如IGRAs、Ag85、CFP-10、LAM 檢測技術都是MTB 在人體內活動的直接證據，具有區分現癥感染和既往感染的能力［13-15］；具有不受樣本限制、即時檢測和床旁檢測的潛力［16-18］。IGRA 目前主要應用于結核潛伏感染（latent tuberculosis infection，LTBI）的診斷和活動性結核的輔助診斷。IGRA 作為世界衛生組織（world health organization， WHO）推薦的用于診斷MTB 感染的體外免疫學方法，2017 年我國肺結核診斷行業標準（WS288-2017）增加了IGRA 作為免疫學檢查的手段之一［結核分枝桿菌γ-干擾素釋放試驗及臨床應用專家意見（2021 年版）］。

本研究利用IGRAs 檢測技術QuantiFERONTB Gold（QFT-TB）方法評估在不同場景和不同人群中檢出效能的比較。本研究結果發現QFT-TB方法學在結核病、密切接觸者和健康人群篩查有較好的可靠指示性，但在免疫受損或抑制的患者中，受外周血淋巴細胞活性的影響，輔助鑒別診斷效能略顯低下。

在活動性肺結核和肺外結核陽性率，較健康對照組明顯升高，表明它們具有較高的特異性可用于輔助診斷。目前臨床上結核病的診斷金標準是細菌學的檢測［19］，本研究中發現AFB+結核患者QFT-TB 的陽性率最高（91.09%），提示QFT-TB 的診斷效能基本與細菌學檢測基本一致。另外，QFT-TB在其他檢測方法確診的結核患者，如GeneXpert、TB-DNA 和病理證實診斷為結核病患者中，符合率分別為91.09%、88.73%、81.63%和72.22%。這些結果提示，QFT-TB 在不同確診類型結核患者中有高效能的輔助診斷意義。

此外，本研究還觀察了QFT-TB 在特殊人群和樣本的檢測效能。在HIV 患者陽性率（11.84%）較健康對照（25.27%）明顯降低（P ＜0.001）。此外，腎移植患者和自身免疫性疾病患者低于健康對照（P >0.05）。這些結果表明QFT-TB 檢測效能在自身免疫性疾病或免疫狀態受到影響時，其檢測效能有所下降，提示在臨床應用中QFT-TB 的檢測需要考慮患者的免疫狀態。

目前QFT-TB 檢測常用的是血樣本，但是在其他特殊結核患者，例如結核性胸膜炎、結核性腹膜炎患者，該檢測方法在其他臨床標本中效能需要進一步驗證。本研究中發現在結核性胸、腹水樣本QFT-TB 陽性診斷率為60.50%和44.00%，提示檢測的陽性率并不是特別高。此外，QFT-TB 檢測兩種樣本不確定結果為29.71%和36.00%，這有可能是由于胸、腹水樣本的成分與血樣本不一致所造成的。在特殊體液（胸、腹水）檢測中淋巴細胞數量少和免疫活性差，從而導致結核菌多肽刺激細胞無表達，最終檢測結果出現不確定性。此外，胸、腹水樣本大部分是滲出液，樣本滲出的成分并不一致，并且隨著病情的發展其細胞構成也會發生改變。

綜上所述，本研究探討QFT-TB 方法在實際臨床應用的輔助診斷價值，其中在輔助診斷結核病和健康篩查潛伏感染分類管理價值更高。因此，在QFT-TB 陽性就診患者管理中，需通過影像學、分子生物學、細菌學等快速檢測，結合各項指標分析定制干預措施。從而，降低疾病發病率，避免社區傳染風險。

【Author contributions】CHEN Qi performed the experiments And wrote the article.ZHANG Yaxi performed the exoeriments.ZHANG Mingxia and ZHANG Jieyun revised the article.YANG Qiangting designed the study and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.

【Conflict of interest】The authors declare no conflict of interest.