胚胎植入前遺傳學檢測在阻斷常染色體隱性多囊腎病家系多囊腎/多囊肝病變1基因新突變遺傳的應用

王凝 郝燕 陳大蔚 章志國 匡丹 張清尹奕琪 魏兆蓮 周平 曹云霞

1安徽醫科大學第一附屬醫院婦產科 （合肥 230000）；2國家衛生健康委配子及生殖道異常研究重點實驗室（合肥 230000）；3出生人口健康教育部重點實驗室 （合肥 230000）；4生殖健康與遺傳安徽省重點實驗室（合肥 230000）；5安徽省生命資源保存與人工器官工程技術研究中心 （合肥 230000）； 6安徽省轉化醫學研究院 （合肥 230000）

常染色體隱性遺傳性多囊腎病（autosomal recessive polycystic kidney disease， ARPKD）為單基因常染色體隱形遺傳病，致病基因是多囊腎/多囊肝病變1 基因（polycystic kidney and hepatic disease 1， PKHD1）或DAZ 相互作用蛋白1 樣基因（DAZ interacting zinc finger protein 1 like， DZIP1L）［1-2］。ARPKD 的發病率約為1∶10 000～1∶40 000，比常染色體顯性多囊腎病（ADPKD）更罕見且更嚴重。ARPKD 發病早且十分嚴重，30%～50%患兒于圍產期或＜ 1 歲時即因肺功能發育不全發病死亡。存活的患兒腎功能將進行性惡化，最終進展至終末期腎病（ESRD），預后很差，成年患者罕見［1，3］。ARPKD 尚無治愈性干預措施，其治療為對癥支持治療（包括長期腎替代治療），患者并發癥多、生存質量差、治療費用昂貴［4］。胚胎植入前遺傳學診斷（PGD）一直用于篩查患有已知遺傳疾病的夫婦的正常胚胎，以避免通過產前診斷終止受影響胎兒的妊娠。對于PKHD1 基因突變攜帶的父母，可通過植入前遺傳學檢測（preimplantation genetic testing， PGT）篩選正常胚胎，或產前診斷篩查患病胎兒來預防ARPKD患兒的出生。常規產前診斷只能在妊娠后進行，一旦確診即需治療性引產。而PGT可以在胚胎植入母體子宮前對胚胎進行檢測，是一種更早期的產前診斷方法，可以避免妊娠后的選擇性流產對孕婦產生的身心創傷。ARPKD 廣泛的表型和遺傳異質性使得需要考慮的基因數量不斷增加。相較于傳統的通過PCR 直接檢測突變或短串聯重復序列（short tandem repeat， STR）連鎖分析，基于二代測序（next generation sequencing， NGS）的單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism， SNP）連鎖分析具有更高的檢測效率、更低的基因脫扣率、更確定的基因型-表型相關性，可以幫助克服PKHD1 基因的復雜性和突變位點的不確定性，實現定位克隆和產前診斷。國內外運用基于NGS 技術的SNP 連鎖方法對ARPKD家系進行PGT 的報道較少，本研究在明確PKHD1基因致病突變的情況下，應用NGS 對胚胎行SNP連鎖分析，活產一健康嬰兒，阻斷單基因病在家系中的垂直傳遞，為患者家庭的優生優育提供保障。

1 資料與方法

1.1 觀察對象先證者父親（Ⅰ1）：26 歲，PKHD1基因c.10444C > T（p.R3482C），表型正常，既往體健。先證者母親（Ⅰ2）：26 歲，PKHD1 基因c.4303del（p.S1435Vfs*25）（圖1），表型正常，既往體健，G1P0A1，多囊腎胎兒（先證者Ⅱ1）引產史，攜帶父母雙方PKHD1 基因突變，其中c.4303del突變為首次報道突變。為了避免再次妊娠患兒，這對夫婦于2021 年8 月在安徽醫科大學第一附屬醫院生殖醫學中心經過遺傳咨詢后，要求接受試管嬰兒+ 單基因病檢測（PGT for monogenic gene defects， PGT-M）+ 非整倍體檢測（PGT for aneuploidies， PGT-A）。已向這對夫婦充分解釋PGT過程及相關風險，獲得其完全知情同意。本研究經安徽醫科大學第一附屬醫院生殖醫學倫理委員會批準（編號：2017002）。

圖1 先證者PKHD1 基因c.10444C > T（父源）和c.4303del（母源）突變Sanger 測序圖Fig.1 Sanger sequencing diagram of c.10444C > T （paternal origin） and c.4303del （maternal origin） mutations in the proband's PKHD1 gene

1.2 方法

1.2.1 構建先證者和父母雙方SNP 單體型提取引產胎兒皮膚組織和男女雙方外周血DNA，在突變位點兩側2M 區域內選擇若干信息豐富、緊密連鎖的SNP，提交給Ion AmpliSeq Designer 網站進行引物設計。經多重置換擴增（multiple displacement amplification， MDA）、多重PCR、純化、建庫、富集后，采用NGS 測序、選擇有效SNPs 來建立SNP 單倍型。

1.2.2 胚胎培養、活檢及囊胚玻璃化冷凍黃體期長方案促排卵后，采用卵胞漿內單精子注射方式進行授精，受精后繼續培養至第5 天或第6 天，待囊胚形成后在激光輔助下取大約5～10 個滋養外胚層（TE）細胞進行活檢。活檢的囊胚單管單枚玻璃化冷凍處理，編號。

1.2.3 PGT-M 與PGT-A 聯合診斷對活檢細胞進行多重置換擴增（multiple displacement amplification， MDA）、多重PCR、純化、建庫、富集后，采用Sanger 測序直接檢測PKHD1 基因突變和基于NGS的SNP 連鎖分析鑒別攜帶突變的染色體兩種方法進行PGT-M，同時進行拷貝數變異（copy number variation， CNV）分析以進行低深度的PGT-A。

1.2.4 FET 和隨訪評估使用自然周期來準備子宮內膜進行胚胎解凍移植（frozen-thawed embryo transfer， FET）。生化妊娠在移植后14 d 查血人絨毛膜促性腺激素（hCG）確定；移植后4 周行經陰道B 超查看孕囊確定宮內妊娠，移植后6～8 周經陰道B 超查看胎心排除胎停，孕18～24 周時行羊膜腔穿刺術獲得胎兒DNA 行Sanger 測序驗證PGT結果。

2 結果

2.1 先證者父母和先證者的SNP 單倍型選擇突變位點兩側2M 區域內的335 個信息豐富的SNP成功構建先證者及其父母的SNP 單倍型，區別確認了父母的正常及風險染色體。

2.2 體外受精結果獲卵數20 枚，MII 數19 枚，受精數17 枚，卵裂17 枚，其中雙原核受精數16 枚，2PN 卵裂數16 枚。

2.3 植入前遺傳學檢測將培養第5 天后第6 天得到的優質囊胚分別標記為D501、D601、D602、D603、D604 和D605，行TE 活檢。PGT 結果顯示，6 個胚胎中，D601、D603、D604、D605 未檢測到突變且為整倍體胚胎，D501 攜帶PKHD1 基因c.4303del突變（雜合子）且6 號染色體三體嵌合，D602 測序數據波動大，無法判斷。

2.4 FET 結果選擇1 枚未檢測到突變的優質整倍體胚胎進行凍融胚胎移植（D601），在第3 個月經周期行單囊胚解凍移植。移植14 d 后外周血hCG 陽性，移植40 d 后經陰道超聲見單個孕囊，大小為43 mm × 40 mm，胚芽長21.9 mm，可見心管搏動。孕18 周經羊膜腔穿刺獲得胎兒DNA，Sanger 測序未檢測到PKHD1 基因c.10444C > T 和c.4303del 突變，證實了PGT 結果。孕38+2周順產一正常男嬰，體質量3.05 kg，健康狀況良好。

3 討論

臨床較常見的遺傳性腎病是ADPKD，患病率約1/1 000，主要由PKD1 或者PKD2 基因突變引起［5］。而本研究中為常染色體隱性多囊腎病，是由PKHD1基因突變或DZIP1L 基因突變導致的常染色體隱形遺傳病，發病率僅為1∶10 000～1∶40 000，要罕見的多。致病基因PKHD1 位于第6 號染色體6p21.1-p12，長約472 kb，編碼蛋白為4 047 個氨基酸的纖囊素（fibrocystin/polyductin， FPC）。FPC 缺陷可引起纖毛功能紊亂、腎小球囊內上皮細胞異常增殖和轉運異常，最終導致腎小管、膽管囊性擴張及纖維化［6-7］。

ARPKD 大多發病早且嚴重，胎兒期即可出現雙側腎臟增大、皮髓質分化差、微小囊腫形成、肺功能發育不全，可導致30%～50%的新生兒死亡。新生兒期存活的患兒可相繼出現電解質紊亂、代謝性酸中毒及高血壓等腎小管功能異常的癥狀，并隨年齡增長進行性惡化，最終進展至ESRD，并伴有肝纖維化進行性加重，導致門脈高壓，預后較差，成年患者罕見［3-10］。

PKHD1 具有復雜的基因型-表型相關性，其大尺寸、復雜的剪接模式和轉錄譜、廣泛的等位基因異質性、大量錯義突變和新突變以及我們對蛋白質功能的有限理解為建立PKHD1 的基因型-表型相關性帶來了挑戰。鑒于這些挑戰，基因型-表型相關性側重于突變的類型，而不是突變的特定位點［11］。幾乎所有攜帶兩個截斷突變的患者都顯示出嚴重的表型和新生兒期死亡。在新生兒期存活的患者通常至少有一個錯義突變，但是反過來，一些錯義變化可能和截斷突變一樣具有破壞性［12］。

PKHD1 基因以編碼區的點突變致病為主［13］，目前，HGMD（www.hgmd.cf.ac.uk）中報道的PKHD1突變種類已達911 種，其中約65.75%為錯義/無義突變，15.26%為小片段缺失，4.10%為小片段插入，1.20%為小片段插入缺失，3.62%為大片段缺失，0.04%為大片段插入，0.02%為復合突變，其中c.107C > T（p.Thr36Met）是最常見的突變。本研究中先證者攜帶的PKHD1 基因c.4303del（p.S1435Vfs*25）突變為首次報道，該變異為截斷突變，根據美國醫學遺傳學與基因組學學會（ACMG）指南，提示為致病突變位點，該突變的發現豐富了PKHD1基因的突變數據庫，針對該突變行PGT，亦為首次。

7 例由纖毛相關基因DZIP1L 突變導致的ARPKD患者在2017年由LU等在4個無血緣關系的家族中首次發現。DZIP1L 位于3 號染色體（3q22.1-q23），具有16 個外顯子，編碼767 個氨基酸的蛋白質，定位于纖毛過渡區，負責將基因產物轉運到睫狀軸突［2］。與PKHD1 突變相比，DZIP1L 突變是ARPKD 的罕見原因，且迄今為止描述的DZIP1L 突變患者的臨床病程總是中等的，沒有一個顯示圍產期死亡。

正常人群中PKHD1 突變雜合子攜帶率約為1/70，攜帶者夫妻每次妊娠的孩子有25%的風險患病，50%的風險攜帶致病基因。胎兒腎臟異常在妊娠中晚期才能通過超聲檢查發現［14-16］。對于ARPKD 高風險家庭，基因診斷是金標準。常規產前診斷方法通常在孕中期行羊水穿刺進行診斷，若發現胎兒為ARPKD，則孕婦會面臨治療性引產帶來的身心傷害。而PGT 在胚胎植入前進行遺傳學檢測，是一種更早期的產前診斷方法，可以避免因妊娠ARPKD 胚胎或非整倍體胚胎而導致的流產，可以阻斷PKHD1 突變基因在該家系中的垂直傳遞。因此，PGT 與傳統的產前診斷相比具有明顯的優勢［13，16］。

等位基因脫扣（ADO）是可能導致PGT-M 誤診、可移植胚胎數目減少的重要問題［17］。ADO 是由等位基因不等擴增引起的某些等位基因未檢測到，是單細胞PCR 的固有缺陷。PKHD1 較大且ARPKD 相關變異數量眾多，直接測序漏診率很高，需要更靈敏的檢測方法降低ADO 率［18］。SNPs指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA 序列多樣性，在群體中的頻率> 1%。SNP 連鎖分析方法間接診斷胚胎基因型方法如下：通過NGS 或芯片檢測父母和胚胎的目標基因上下游1-2M 內SNPs 作為遺傳標記，在家系中構建單倍型，再通過檢測胚胎是否攜帶風險單體型來判斷胚胎是否攜帶基因突變。由于采用SNP 作為遺傳標記構建了單體型，對胚胎進行基因檢測時，可檢測位點大大增加，且NGS 具有高通量、高覆蓋率和高靈敏度的特征，所以相比于傳統的通過PCR 方法直接檢測突變或STR 連鎖分析，基于NGS 的SNP 連鎖分析具有更高的檢測效率、更低的等位基因脫扣率、更確定的基因型-表型相關性［19-21］。作為遺傳標記，SNP 與STR 相比，有以下優點：（1）SNP 是二態性的，只需+/-的分析，適于快速、規模化篩查；（2）SNP 數量更大、分布更廣泛；（3）SNP更穩定；（4）部分SNP 本身可能就是疾病遺傳機制的候選改變位點；（5）與傳統的凝膠電泳相比，SNP 芯片具有廉價、快速的優點；（6）SNP 連鎖分析可以直接對突變位點進行檢測，實現基因型和單體型的同時診斷［22-23］。本研究中通過連鎖分析方法，在突變位點兩側2M 區域內選擇335 個信息豐富、緊密連鎖的SNP 位點作為遺傳連鎖標記，成功構建先證者父母的單體型，說明該方法是安全有效的，減少了因等位基因脫扣導致的誤診［13］。有1 枚胚胎未獲明確診斷，主要考慮是活檢細胞數目偏少，導致擴增失敗。

SNP 連鎖分析的局限性在于需要完整家系來構建家系單體型來進行診斷，在無法獲取先證者DNA 的情況下，SNP 單體型方法無法奏效。在發生減數分裂重組的情況下，SNP 單體型分析也有可能存在無法診斷的情況。若患者卵巢功能較差，無法獲取足夠卵子和胚胎，患者行PGT 的成功率會大大降低。本研究中，無上述情況，可進行常規SNP 連鎖分析。在一些特殊情況下，如沒有患兒DNA 保存，可嘗試通過致病胚胎極體或單精子構建家系單體型［24］。也可以通過三代長讀測序，直接尋找患者SNP 位點，而不依賴于家系成員［25］。

綜上所述，本研究應用基于NGS 的SNP 連鎖分析技術，成功對ARPKD 家系進行了準確、高效的PGT-M，降低了等位基因脫扣導致的PGT-M 誤診率，避免了因選擇患病或非整倍體胚胎而導致的流產問題，阻斷了ARPKD 在該家系中的垂直傳遞，為未來預防ARPKD 出生缺陷的提供了參考，并且發現了PKHD1 基因的一個新突變，豐富了ARPKD 的突變數據庫。

【Author contributions】WANG Ning performed the experiments and wrote the manuscript.HAO Yan performed the experiments and helped to revise the manuscript.CHEN Dawei， ZHANG Zhiguo，KUANG Dan， ZHANG Qing and YING Yiqi helped to recruit the patients.WEI Zhaolian， ZHOU Ping and CAO Yunxia analysed the data.All authors read and approved the final manuscript as submitted.

【Conflict of interest】The authors declare no conflict of interest.