老年重癥肺炎并發ARDS患者血清miR-27a、FOXO3與疾病嚴重程度及預后的關系

金嫻,邵振華,何梅,姜俊,王志安,任蕾

老年人因宿主免疫受損、吞咽功能障礙和伴有多種基礎疾病成為肺炎高發人群,且常因肺部炎性反應得不到有效控制進展為重癥肺炎[1]。急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)是老年重癥肺炎最嚴重的并發癥之一,也是導致老年重癥肺炎患者死亡的重要因素[2]。因此及時評估老年重癥肺炎并發ARDS患者病情嚴重程度及預后至關重要。炎性反應參與ARDS發生發展[3],研究表明,微小核糖核酸(microRNA,miRNA)通過調控炎性反應在ARDS過程中發揮重要作用[4]。miR-27a是一種炎性反應相關miRNA[5],有學者通過miRNA篩選發現[6],miR-27a為重癥社區獲得性肺炎并發ARDS患者血清差異表達miRNA之一。叉頭框蛋白O3(forkhead box O3,FOXO3)是一種轉錄因子,參與細胞自噬、細胞凋亡、炎性反應、氧化應激等多種病理生理過程[7]。實驗報道[8],FOXO3在急性肺損傷/ARDS小鼠肺組織中高表達。本研究擬探討老年重癥肺炎并發ARDS患者血清miR-27a、FOXO3與疾病嚴重程度及預后的關系,以期為改善老年重癥肺炎并發ARDS患者預后提供更多參考依據,報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2022年10月—2023年9月上海市靜安區中心醫院重癥醫學科收治老年重癥肺炎并發ARDS患者108例為ARDS組,男67例,女41例,年齡60～89(73.12±6.75)歲;老年重癥肺炎未并發ARDS患者72例為非ARDS組,男44例,女28例,年齡60～88(74.17±6.90)歲;另選取醫院同期老年體檢健康志愿者60例為健康對照組,男36例,女24例;年齡60～89(73.03±7.14)歲。3組性別和年齡比較差異無統計學意義(P>0.05),具有可比性。本研究經醫院倫理委員會批準[(2022)倫審第39號],受試者或家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標準 (1)納入標準:①年齡≥60歲;②初次確診為重癥肺炎或重癥肺炎并發ARDS;③重癥肺炎符合《中國急診重癥肺炎臨床實踐專家共識》[9]診斷標準;④ARDS符合《急性呼吸窘迫綜合征:柏林新定義》[10]診斷標準;⑤臨床病歷資料完整。(2)排除標準:①合并肺結核、慢性阻塞性肺疾病(慢阻肺)、先天性肺發育不良等其他肺疾病;②腦卒中、終末期腎病等重大疾病或疾病終末期;③惡性腫瘤患者;④自身免疫性疾病;⑤哺乳期、妊娠期婦女。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 資料收集:性別、年齡、肺炎類型(社區/醫院獲得性肺炎)、吸煙史、飲酒史、基礎疾病、機械通氣時間、白細胞計數、血肌酐、血尿素氮、C反應蛋白、降鈣素原等資料。

1.3.2 血清miR-27a、FOXO3水平檢測:患者于入院時和健康對照組體檢時采集空腹肘靜脈血4 ml,置于EDTA抗凝管中30 min,離心留取上層血清,保存于-80℃冰箱中待測。按照南京諾唯贊生物科技股份有限公司提供的RNA提取試劑盒(編號 RC112-01)說明書提取總RNA,按照南京賽泓瑞生物科技有限公司提供的逆轉錄試劑盒(編號 DV807A)說明書逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板,miR-27a以U6為內參,FOXO3以GAPDH為內參,根據翌圣生物科技(上海)股份有限公司提供的實時熒光定量聚合酶鏈式反應試劑盒(編號 11203ES03)說明書進行擴增。反應體系:2×Master Mix 10 μl、上游引物0.5 μl、下游引物0.5 μl、cDNA 2.0 μl、加DEPC水至20 μl;反應條件:預變性 95℃ 30 s 1次,變性95℃ 5 s 40次,退火延伸60℃ 40 s 40次。65～95℃繪制溶解曲線,用2-ΔΔCT法表示血清miR-27a、FOXO3 mRNA水平。引物由武漢金開瑞生物工程有限公司合成,miR-27a上游引物5＇-AAGGAGCCCCACGAGAAAAA-3＇,下游引物5＇-ACCGAACTTGCATTGATTCC-3＇;U6上游引物5＇-CTCGCTTCGGCAGCACA-3＇,下游引物5＇-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3＇;FOXO3上游引物5＇-ACACTCCAGCTGGGTCCCTGA-3＇,下游引物5＇-TGTCGTGGAGTCGGCAATTC-3＇;GAPDH上游引物5＇-CTCGCTTCGGCAGCACATATA-3＇,下游引物5＇- ACGAATTTGCGTGTCATCCT-3＇。

1.3.3 miR-27a與FOXO3的結合位點預測:通過TargetScan數據庫https://www.targetscan.org/vert_72/預測miR-27a與FOXO3的結合位點。

1.3.4 老年重癥肺炎并發ARDS患者病情和預后分組:老年重癥肺炎并發ARDS患者入院后,根據氧合指數(動脈血氧分壓/吸入氧濃度)分為輕度亞組(200 mmHg<氧合指數≤300 mmHg,26例)、中度亞組(100 mmHg<氧合指數≤200 mmHg,34例)、重度亞組(氧合指數≤100 mmHg,48例)。并根據老年重癥肺炎并發ARDS患者28 d預后情況分為死亡亞組33例和存活亞組75例。

2 結 果

2.1 3組血清miR-27a、FOXO3 mRNA水平比較 健康對照組、非ARDS組、ARDS組血清miR-27a水平依次降低,FOXO3 mRNA水平依次升高(P均<0.01),見表1。

表1 3組血清miR-27a、FOXO3 mRNA水平比較

2.2 血清miR-27a、FOXO3 mRNA水平在不同病情程度老年重癥肺炎并發ARDS患者中比較 輕度亞組、中度亞組、重度亞組血清miR-27a水平依次降低,FOXO3 mRNA水平依次升高(P均<0.01),見表2。

表2 血清miR-27a、FOXO3 mRNA水平在不同病情程度老年重癥肺炎并發ARDS患者中比較

2.3 血清miR-27a、FOXO3 mRNA水平與氧合指數的相關性 經TargetScan數據庫預測,miR-27a與FOXO3的3＇-非翻譯區3257～3264處存在結合位點(圖1)。Pearson相關性分析顯示,血清miR-27a與FOXO3 mRNA水平呈負相關(r=-0.736,P<0.001);Spearman相關性分析顯示,血清miR-27a水平與氧合指數呈正相關,FOXO3 mRNA水平與氧合指數呈負相關(rs=0.751、-0.785,P均<0.001)。

圖1 miR-27a與FOXO3的結合位點圖

2.4 不同預后老年重癥肺炎并發ARDS患者臨床資料比較 老年重癥肺炎并發ARDS患者108例，28 d死亡33例(30.56%)。 死亡亞組患者年齡大于存活亞組,機械通氣時間長于存活亞組,氧合指數、miR-27a低于存活亞組,C反應蛋白、FOXO3 mRNA高于存活亞組(P<0.05),2亞組其他資料比較差異無統計學意義(P>0.05),見表3。

表3 不同預后老年重癥肺炎并發ARDS患者臨床資料比較

2.5 多因素Logistic回歸分析影響老年重癥肺炎并發ARDS患者預后的因素 以老年重癥肺炎并發ARDS患者預后(死亡/存活=1/0)為因變量,以表3中P<0.05項目(年齡、機械通氣時間、氧合指數、C反應蛋白、miR-27a、FOXO3 mRNA)為自變量,建立影響老年重癥肺炎并發ARDS患者預后的多因素Logistic回歸模型。結果顯示,年齡增加、機械通氣時間延長、FOXO3 mRNA升高為影響老年重癥肺炎并發ARDS患者預后的獨立危險因素,氧合指數升高、miR-27a升高為獨立保護因素(P<0.05),見表4。

表4 影響老年重癥肺炎并發ARDS患者預后的多因素Logistic回歸分析

2.6 血清miR-27a、FOXO3 mRNA水平對老年重癥肺炎并發ARDS患者死亡的預測價值 繪制血清miR-27a、FOXO3 mRNA水平單獨與聯合預測老年重癥肺炎并發ARDS患者死亡的ROC曲線,結果顯示:血清miR-27a、FOXO3 mRNA水平及二者聯合預測老年重癥肺炎并發ARDS患者死亡的曲線下面積(AUC)分別為0.784、0.786、0.879,二者聯合的AUC大于血清miR-27a、FOXO3 mRNA水平單獨預測(Z=2.550、2.963,P=0.011、0.003),見表5、圖2。

表5 血清miR-27a、FOXO3 mRNA水平預測老年重癥肺炎并發ARDS患者死亡的價值

3 討 論

ARDS是一種由各種誘導因素引起的難以控制且危及生命的進行性呼吸窘迫和急性呼吸衰竭,其特點是嚴重肺部炎性反應、肺上皮和內皮細胞損傷、肺泡—毛細血管膜通透性增加、低氧血癥和非心源性肺水腫等[11]。老年重癥肺炎患者由于肺實質(細支氣管、肺間質、肺泡等)炎性反應加重,誘發失控性炎性反應,加劇肺部損傷導致ARDS[12]。老年重癥肺炎并發ARDS具有全身器官功能減退、基礎疾病多、防御功能和呼吸免疫系統低下、頑固性低氧等特點,截止目前尚無特效治療方法,治療難度大,常因并發多器官衰竭而死亡[13]。

炎性反應被認為是ARDS發生發展的核心機制,炎性反應通過破壞肺上皮和內皮細胞,增加肺泡—毛細血管膜通透性,引起大量液體滲漏而促進ARDS發生發展[3]。miRNA是一種短鏈非編碼RNA,能與靶基因特異性位點結合在轉錄后水平調控基因表達,從而參與ARDS進程[14]。miR-27a定位于人染色體19p13.12,既往研究多關注其在惡性腫瘤中的作用,近年研究發現miR-27a還參與肺炎性反應過程。王艷瓊等[15]實驗報道,miR-27a在肺炎鏈球菌誘導的人肺泡上皮細胞損傷模型中低表達,上調miR-27a能靶向抑制磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕靶蛋白信號通路,下調白介素(interleukin,IL)-6等促炎細胞因子表達,以緩解肺炎鏈球菌所致的細胞損傷,提示miR-27a參與肺炎過程。實驗報道,miR-27a過表達能靶向抑制Toll樣受體4/核因子κB(Toll-like receptor 4/nuclear factor κB,TLR4/NF-κB)信號通路,改善肺結核大鼠肺部炎性反應損傷[16]。脂多糖建立的膿毒癥小鼠模型中,抑制miR-27a能上調磷酸酯酶與張力蛋白同源物表達,抑制肺部促炎細胞因子表達,進而加重膿毒癥誘導的肺損傷[17]。提示miR-27a還對多種原因所致肺損傷具有重要的保護作用。本研究結果顯示,健康對照組、非ARDS組、ARDS組血清miR-27a水平依次降低,提示低血清miR-27a水平與老年重癥肺炎并發ARDS有關。結果還顯示,老年重癥肺炎并發ARDS患者血清miR-27a水平隨著病情加重而降低,miR-27a升高為影響老年重癥肺炎并發ARDS患者預后的獨立保護因素,這提示低血清miR-27a水平與老年重癥肺炎并發ARDS患者疾病加重和預后不良有關。其機制可能是,miR-27a能靶向抑制TLR4/髓樣分化因子88/NF-κB信號通路,減少促炎細胞因子和促血管通透性因子釋放,抑制肺部炎性反應發展和肺微血管通透性增強,減少肺上皮、肺內皮細胞凋亡,從而改善老年重癥肺炎并發ARDS患者病情和預后[18]。

FOXO3/FOXO3a是一種高度保守的轉錄因子,具有調節脂代謝、炎性反應、免疫反應、血管生成、DNA修復、細胞自噬、細胞凋亡、應激抵抗等多種作用[19]。Chen等[20]實驗報道,FOXO3在腸缺血再灌注小鼠模型中表達上調,體外敲低FOXO3能抑制炎性因子表達,進而減輕腸缺血再灌注所致的肺損傷。Zhou等[21]實驗報道,下調FOXO3能通過抑制NOD樣受體熱蛋白結構域蛋白3炎性小體活化,減輕炭黑納米顆粒誘導的大鼠肺部炎性反應。抑制FOXO3表達能改善慢阻肺大鼠肺組織IL-1β、IL-2等炎性因子表達[22]。這些研究提示FOXO3在肺部炎性反應損傷中發揮重要作用。同時研究報道,下調FOXO3能減輕膿毒癥誘導的急性肺損傷[23]。本研究結果顯示,健康對照組、非ARDS組、ARDS組血清FOXO3 mRNA水平依次升高,提示高血清FOXO3 mRNA水平與老年重癥肺炎并發ARDS有關。結果還顯示,老年重癥肺炎并發ARDS患者血清FOXO3 mRNA水平隨著病情加重而升高,為影響老年重癥肺炎并發ARDS患者預后的獨立危險因素,這提示高血清FOXO3 mRNA水平與老年重癥肺炎并發ARDS患者疾病加重和預后不良有關。其機制可能是,FOXO3能通過結合NF-κB RelA(p65)激活NF-κB信號通路,通過增加炎性細胞因子釋放,加劇肺血管、肺上皮、肺內皮等組織損傷,導致老年重癥肺炎并發ARDS患者病情加重和死亡風險增加[24]。同時FOXO3作為介導線粒體自噬調控的關鍵途徑[25]。FOXO3升高還會增強Ⅱ型肺泡細胞自噬活性,導致肺泡細胞過度自噬,誘導肺泡細胞凋亡,進而加重老年重癥肺炎并發ARDS患者病情和降低預后[26]。

本研究通過在線預測發現miR-27a與FOXO3存在結合位點,相關性分析證實在老年重癥肺炎并發ARDS患者血清中二者水平呈負相關,這提示miR-27a與FOXO3可能共同參與老年重癥肺炎并發ARDS發生發展。Shang等[27]通過雙熒光素酶報告實驗證實,miR-27a能靶向下調FOXO3,以減輕脂多糖誘導的肺泡上皮細胞炎性反應和凋亡。本研究結果還顯示,年齡、機械通氣時間和氧合指數為影響老年重癥肺炎并發ARDS患者預后的獨立因素,考慮原因如下:年齡越大的患者全身器官功能減退越嚴重,免疫力、防御力、抗應激能力更差,因此死亡風險更高;機械通氣時間延長說明患者低氧血癥更嚴重,因此死亡風險更高;氧合指數作為評估ARDS患者病情嚴重程度的指標,其指數越高提示患者病情越輕,因此死亡風險更低。最后本研究ROC曲線結果顯示,血清miR-27a、FOXO3 mRNA水平預測老年重癥肺炎并發ARDS患者死亡的AUC為0.784、0.786,二者聯合預測的AUC為0.879,較單獨預測顯著增加。這提示血清miR-27a、FOXO3 mRNA水平可能成為老年重癥肺炎并發ARDS患者預后輔助預測指標,而同時檢測能更好地判斷患者預后。但還需實驗驗證miR-27a與FOXO3參與老年重癥肺炎并發ARDS的機制,同時本結論也有待多中心研究進一步驗證。

綜上,血清miR-27a水平降低和FOXO3 mRNA水平升高與老年重癥肺炎并發ARDS患者疾病加重和預后不良有關,miR-27a與FOXO3可能共同參與老年重癥肺炎并發ARDS發生發展,二者聯合對老年重癥肺炎并發ARDS患者死亡具有較高的預測價值。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

金嫻:設計研究方案,實施研究過程,論文撰寫;邵振華、姜俊、王志安:實施研究過程,資料整理收集;何梅:提出研究思路,分析試驗數據,進行統計學分析;任蕾:課題設計,論文修改,論文審核