探討坤泰膠囊治療卵巢早衰的作用機制*

于秋敏，伍娟娟

1 廣西中醫藥大學 廣西南寧 530200

2 廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院 廣西南寧 530011

卵巢早衰（ POF，premature ovarian failure ）是婦科病中常見的生殖內分泌疾病，好發于40歲以前的女性，以閉經、促卵泡生成素（FSH）≥40mIU / mL、雌激素水平降低伴或不伴有不同程度的圍絕經期癥狀為主[1]。據國外文獻報道[2]，隨著女性生活和工作壓力的逐漸升高，全球POF患病率呈逐年上升的趨勢，POF的全球發病率約0.9%～1.2%。治療POF，西醫常用激素補充療法，雖對患者的癥狀有改善作用，但停藥后易復發，且易增加女性患癌風險[3]。坤泰膠囊由古代醫家張仲景《傷寒雜病論》中的“黃連阿膠湯”加減而成；在臨床上，坤泰膠囊作為治療POF的一線中成藥運用相當廣泛[4]。

本文基于網絡藥理學方法探討坤泰膠囊治療POF的主要藥物活性成分、關鍵靶點以及相關通路，再用分子對接技術對得到的關鍵靶點與核心藥物成分進行對接研究，對關鍵靶點-核心成分兩者結合能的結果進行分析，為后續坤泰膠囊治療POF的作用機制提供臨床參考。

材料與方法

1 坤泰膠囊藥物活性成分及相關靶點的獲取

在TCMSP數據庫（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php/），以口服利用度≥30%、且滿足類藥性≥0. 18為篩選標準，檢索坤泰膠囊六味中藥的活性成分，因阿膠在該數據庫中未檢索到，則在BATMAN-TCM數據庫（http：//bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/）補充檢索。通過Uniprot數據庫（https：//www.uniprot.org/），進行蛋白質靶點名稱的標準化處理。

2 POF疾病靶點的獲取方法

在GeneCards（https：//www.genecards.org/）與OMIM（https：//omim.org/）數據庫以“premature ovarian failure”為關鍵詞，進行疾病靶點的檢索。

3 構建“藥物-活性成分-相關靶點”網絡圖

將所得的藥物及其活性成分、相關靶點，導入Cytoscape3.8.0軟件中，進行“藥物-活性成分-相關靶點”網絡圖的構建。

4 獲取藥物與疾病的交集靶點

將所得的藥物與疾病靶點蛋白數據，輸至Bioinformatics（https：//bioinformatics.com.cn/）中，得藥物與疾病的交集靶點。

5 構建“蛋白與蛋白相互作用（PPI）”網絡圖

將所得“交集靶點”，導入STRING數據庫（https：//cn.string-db.org/），得到蛋白互作結果。所得的蛋白互作結果以“tsv”格式導入Cytoscape3.8.0軟件中，構建PPI可視化網絡圖。

6 GO富集分析及KEGG通路分析

通過DAVID數據庫（https：//david.ncifcrf.gov/），對“交集靶點”，進行生物過程（BP ）、細胞組成（CC）、分子功能 （ MF）及KEGG通路的分析。取GO富集分析中BP、CC、MF前10個數據結果和KEGG通路分析前20個數據數據可視化展示。

7 核心藥物活性成分與核心靶點分子對接驗證

從PubChem數據庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中獲得藥物活性成分的2D分子結構，Chem3D軟件中優化成3D結構，作為配體；用Pymol軟件對核心靶點進行去水、去殘積等處理，作為受體。用Autodock tools與Autodock Vina對核心藥物活性成分與核心靶點進行分子對接驗證，并計算出對應的結合能值。最后，用Pymol軟件對結合能值排名前6的進行可視化展示。

結果

1 坤泰膠囊藥物活性成分及相關靶點

在TCMSP與BATMAN-TCM數據庫中檢索，得到黃芩36個、茯苓15個、黃連14個、白芍13個、熟地黃2個及阿膠3個。最后將所得的藥物活性成分進行去重，共88個藥物活性成分納入研究范圍。該88個藥物活性成分共得到219個藥物相關靶點，在Uniport數據庫中對219個藥物相關靶點進行蛋白名稱的標準化處理。

2 POF疾病靶點的獲取結果

在GeneCards數據庫以“Relevance score>3.76”作為篩選標準，獲疾病靶點5081個，篩選出2543個與疾病緊密相關的靶點。OMIM數據庫所獲得的疾病靶點491個，將兩數據庫所得的靶點進行合并去重，最終得到疾病靶點2947個。

3 “藥物-活性成分-相關靶點”網絡圖

利用Cytoscape3.8.0軟件構建“藥物-活性成分-相關靶點”網絡圖，包括290個節點和959條邊，見圖1，利用軟件中“Network Analyzer”插件，進行拓撲參數分析，取度值排名前7的藥物活性成分作為坤泰膠囊的關鍵成分，見表1。

表1 關鍵藥物有效成分基本信息

圖1 “藥物-活性成分-相關靶點”網絡圖

4 藥物與疾病的交集靶點

通過Bioinformatics平臺，得到153個交集靶點，包括PTGS2、PTGS1、NOS1、PGR、NR3C2、TNF、IL6、CD14、LBP、PIK3CG等。交集靶點韋恩圖見圖2。

圖2 坤泰膠囊治療POF的共同靶點韋恩圖

5 “蛋白與蛋白相互作用（PPI）”網絡圖

經STRING數據庫得PPI網絡圖，以“tsv”格式導入Cytoscape3.8.0軟件中，進行可視化展示，用CytoNCA插件對網絡圖進行拓撲分析，篩選出均滿足數值大于介數中心性（BC）、接近中心性（CC）、度中心性（DC）、特征向量中心性（EC）中位數前10的節點為核心靶點，這些核心靶點可能是坤泰膠囊治療POF的關鍵靶點，見圖3與表2。

表2 核心靶點的拓撲分析結果

圖3 “蛋白與蛋白相互作用”網絡圖

圖4 坤泰膠囊對POF作用靶點的GO富集分析圖

圖5 坤泰膠囊對POF KEGG通路分析圖

6 GO富集分析及KEGG通路分析

GO富集分析檢索到1012個條目，分別選富集靶點排名前10的進行可視化。BP得778個條目，包括雌二醇的反應、缺氧的反應等；CC得84個條目，包括膜筏、細胞外、細胞液等；MF得150個條目，涉及酶結合、蛋白結合、相同的蛋白結合等。KEGG通路分析檢索到169條通路，選富集前20的通路進行可視化，見圖6，其主要涉及癌癥通路、IL-17信號通路、TNF信號通路等信號通路。

圖6 分子對接結果可視化

7 核心藥物活性成分與核心靶點分子對接驗證

選前5的核心藥物活性成分與前8的核心靶點進行分子對接驗證，對接的結合能信息表見表3。結合能信息表均＜-5.0 kcal/mol，體現了分子對接的配體與受體能穩定的結合，表明了坤泰膠囊的核心藥物活性成分能很好的與預測的核心靶點結合在一起。對結合能值排名前6的分子對接結果進行可視化展示，見圖6。

表3 坤泰膠囊核心活性成分與核心靶點的分子對接結果

討論

本研究通過網絡藥理學的方法對坤泰膠囊治療POF的藥物及潛在靶點進行預測，從而證實坤泰膠囊對POF起到治療作用，揭示了坤泰膠囊通過多成分、多靶點、多通路對POF的作用機制。

“藥物-活性成分-相關靶點”網絡圖，按拓撲分析中度值參數篩選出槲皮素、β-谷固醇、山萘酚、豆甾醇、黃芩素、黃芩苷作為坤泰膠囊治療POF的核心藥物成分。槲皮素、β-谷固醇與豆甾醇均有抗衰老、抗抑郁、抗氧化等藥理活性[5-6]，均能調控 PI3K/Akt信號通路，對卵巢起到抗氧化、抗細胞衰老等作用進而減慢或抑制卵巢細胞的衰老過程，促進卵巢各級卵泡的生長發育[7-8]，使顆粒細胞繁殖，抑制細胞凋亡，保持卵巢功能的活性[9-10]，從而發揮對卵巢功能的調節作用[11-12]。研究發現，山萘酚在一定程度上能改善癌SKOV-3細胞在體外的增殖，使卵巢癌細胞凋亡，恢復卵巢的再生功能[13-14]。黃芩素與黃芩苷均屬黃酮類化合物，有抗氧化、抗抑郁、抗腫瘤等藥理作用[15]，有實驗證明，二者能提高抗氧化酶的濃度，抑制小鼠卵巢組織細胞損害的程度，從而對卵巢組織起到保護作用[16-17]。

通過PPI網絡圖進行CytoNCA拓撲分析，發現坤泰膠囊能通過TP53、AKT1、MAPK1、TNF、IL6等核心靶點對POF發揮治療作用。TP53能通過刺激ASK1信號通路使卵巢顆粒細胞增殖和凋亡，促使卵巢卵泡的產生和發育，減輕卵巢早衰的癥狀[18-19]。AKT1能激活卵巢組織內自噬細胞從而抑制卵巢的衰老，延長卵巢細胞壽命，反映了AKT1基因蛋白影響POF的進展[20]。TNF與IL6均屬炎性因子，而POF的發生常常與炎性因子密切相關[21]；刁瑞英等人通過臨床觀察發現，POF患者血清中TNF、IL6等炎性因子水平偏高，用坤泰膠囊治療POF患者，能通過調節TNF與IL6等炎癥因子來改善自身免疫紊亂，調節患者內分泌系統，起到改善卵巢中卵泡的功能[22]。

通過GO富集分析和KEGG信號通路分析，證實坤泰膠囊能通過參與多種生物過程及調控多條信號通路對POF的進展發揮作用。KEGG信號通路分析結果中PI3K-Akt、TNF及IL-17等信號通路與POF緊密聯系，PI3K-Akt信號通路參與卵巢卵母細胞的生長、原始細胞的發育及顆粒細胞增殖與分化等過程，在卵泡的生長發育與卵巢損傷的恢復起到關鍵調節作用[23-24]。實驗證明，坤泰膠囊能調節小鼠體內的激素水平，下調Fasl蛋白與上調TNF蛋的mRAN的表達，從而促使卵巢功能得到修復，起到保護卵巢的作用[25-26]。IL-17信號通路屬于炎癥通路，坤泰膠囊聯合激素貫序療法能通過IL-17信號通路及調控Th17細胞平衡，對POF起到治療作用[27-28]。由此可知，坤泰膠囊可通過多條通路途徑改善卵巢早衰患者的卵巢功能變化，從而維持卵巢的生理功能。分子對接結果表明，坤泰膠囊的核心藥物活性成分與核心靶點的平均結合能為-9.01kcal/mol，該結果證實了坤泰膠囊的藥物活性成分能與核心靶點蛋白有較強的結合能力，揭示了主要藥物活性成分對核心靶點蛋白有一定的激活或抑制作用，坤泰膠囊從而起到對POF起的治療作用。

綜上所述，坤泰膠囊治療卵巢早衰能通過相關藥物活性成分、核心靶點及相關通路對改善卵巢功能、延長卵巢細胞壽命、減輕卵巢早衰癥狀、調節體內激素水平等起到一定的作用。本文闡明了坤泰膠囊治療卵巢早衰的藥理作用機制，不足之處在于缺少實驗的驗證，但本文能為臨床研究、實驗研究以及中藥的開發提供一些新思路。