丹參-莪術藥對治療癌性厭食的作用機制*

張甜，宋萌萌，賈文文，喬元勛

1 山東中醫藥大學 山東濟南 250014

2 山東省泰安市中醫醫院 山東泰安 271000

癌性厭食（cancer-related anorexia，CA）是指與癌癥或抗癌治療相關的食欲減少甚至喪失，伴或不伴體重下降[1]。CA按照病因分為原發性和繼發性兩類。原發性厭食的具體臨床機制尚不清晰。繼發性厭食多由于抑郁、便秘、疼痛和接受抗腫瘤治療等導致[2]?，F代醫學治療，尚存在一定的不良反應[3-4]，而CA是癌癥患者不容忽視的一大癥狀。

丹參性苦，微寒，歸心、肝二經，具有活血祛瘀、通經止痛、清心除煩、涼血消癰的作用。莪術辛苦溫，入肝、脾經，具有破血行氣、消積止痛之功。大量臨床研究表明丹參[5-7]、莪術[8-9]具有抗腫瘤的作用。同時丹參[10]、莪術[11-13]作為復方藥物的組成之一，具有改善進食情況的作用，但機制尚不明確。本研究旨在通過網絡藥理學和分子對接預測丹參與莪術治療CA的靶點，明確其作用機制，了解其作用原理，為進一步研究丹參—莪術治療CA提供具體的理論依據。

資料與方法

1 藥物成分獲取

以“丹參、莪術”為關鍵詞，檢索中藥系統藥理學數據庫（TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php），按照ADME參數設置化合物分子的口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（drug likeness，DL）≥0.18進行篩選，獲得丹參、莪術的化合物分子，結合文獻[14-17]對莪術的化學成分進行補充。

2 藥物基因靶點獲取

通過TCMSP數據庫對獲得的丹參、莪術的化合物進行靶點蛋白獲取，結合Uniprot數據庫（https：//www.uniprot.org/）獲取對應的基因。文獻中獲取得到的莪術成分使用PharmMapper數據庫（http：//lilab-ecust.cn/pharmmapper/index.html），設定條件為物種Human Protein、Norm Fit>0.9，篩選得出對應靶點基因。

3 藥物基因可視化分析

去重后利用cytoscape3.8.2軟件實施網絡可視化分析。

4 疾病基因靶點的獲取

以“cancer-related anorexia”為關鍵詞，分別在GeneCards數據庫（https： //www.genecards.org/）和OMIM數據庫（https： //omim.org/）中篩選，合并去重后得到CA相關的基因靶點。

5 疾病和藥物交集基因獲取

將疾病基因與藥物交集基因輸入“微生信”（http：//www.bioinformatics.com.cn/），獲取韋恩圖。

6 疾病—藥物蛋白相互作用網絡構建（PPI）及可視化分析

將疾病和藥物交集基因導出到String數據庫（https：//cn.string-db.org/），并設定物種為“Homo spanies”，將最低相互作用評分（minimum required interaction score）設置為medium confidence（0.400），并勾選隱藏游離的蛋白質。將結果導出到cytoscape3.8.2軟件進行調整。

7 GO富集分析與KEGG富集通路分析

將潛在的基因靶點上傳至Metascape數據庫（https：//metascape.org/）中，選擇物種為“H.sapiens”，進行custom analysis。分別得到GO富集分析及KEGG富集通路分析結果。KEGG富集通路分析按照P值進行升序排列；GO分析按logP值進行升序排列，結果利用“微生信”（http：//www.bioinformatics.com.cn/）進行可視化展示。

8 核心活性成分-靶點分子對接分析

利用PDB數據庫下載關鍵靶蛋白，從TCMSP數據庫中下載核心活性成分的mol2結構，利用Autodock Tools進行去水、加氫、設置旋轉鍵、盲對接等操作，再進行分子對接，最終結果通過pymol進行可視化處理。

結果

1 丹參、莪術化學成分的篩選結果

通過TCMSP數據庫，經ADME篩選（OB≥30%，DL≥0.18）、文獻補充、篩選后共得到丹參58個有效成分，莪術8個有效成分。見表1。

2 丹參、莪術化學物預測靶點

通過Uniprot數據庫、PharmMaper數據庫檢索對應的基因，丹參58個化合物共有833個基因，莪術8個化合物共有90個基因，利用cytoscape3.8.2軟件建立基因靶點與化合物的網絡關系圖，見圖1。

圖1 丹參—莪術基因靶點—化合物

3 疾病-藥物交集基因

將丹參、莪術的基因靶點去重后得到丹參126個基因，莪術54個基因，并將疾病基因輸入微生信網站得到交集基因，丹參-莪術交集基因為25個，CA與丹參-莪術的交集基因為14個。見圖2。

圖2 藥物-疾病交集基因

4 蛋白互作圖

基于String數據庫分析“丹參-莪術”與CA靶點之間的交互作用，使用cytoscape3.8.2軟件進行數據可視化分析，一個節點代表一個蛋白質，邊則代表蛋白相互之間的作用關系，其中1個游離的蛋白質被舍棄，共13個點，22條邊。利用Analyse network進行度的分析，度值越大則節點越大，顏色越紅，表示“丹參-莪術”通過此靶點治療CA的可能性越大。邊按照combined score進行顏色、粗細調節，顏色越紅，線條越粗，表示得分越高，蛋白互作關系越強。見圖3、圖4。

圖3 string原圖

圖4 可視化后的PPI網絡圖

5 GO富集分析

GO分析中按logP值進行升序排列，結果顯示生物過程（BP）有83個條目，細胞組分（CC）有4個條目，分子功能（MF）有18個條目。其中BP、MF展示前10個條目，CC展示全部條目。BP主要涉及細胞對有機環狀化合物的反應、類固醇激素介導的信號通路、類固醇激素反應等；CC主要涉及膜小凹、膜微區、膜筏、質膜筏；MF主要涉及核受體活性、配體激活的轉錄因子活性、核類固醇受體活性、類固醇結合等。見圖5。

圖5 GO富集分析結果

6 KEGG富集通路分析

KEGG富集通路分析結果共得到20條信號通路，包括化學致癌-受體激活通路、癌癥信號通路、雌激素信號通路、乳腺癌信號通路、催乳素信號通路、內分泌耐藥的信號通路、腫瘤壞死因子信號通路等，按照P值進行升序排列，并將該結果通過微生信網站進行可視化分析。見圖6。

圖6 KEGG富集通路分析結果

7 分子對接

通過cytoscape3.8.2軟件進行degree篩選，將PPI得出的前2個核心靶點（MAPK1、ESR1）通過PDB數據庫轉換為受體（3SA0、1XPC），分別與前3個核心成分丹參新醌（dan-shexinkum d，MOL007093）、二氫丹參內酯（dihydrotanshinlactone，MOL007100）、2-異丙基-8-甲基菲-3，4-二酮（2-isopropyl-8-methylphenanthrene-3，4-dione，MOL007041）進行分子對接，對接次數設置為50次。通常認為當結合能＜-5kcal/mol時，靶點與藥物成分結合較好，具體結合能見表2，其中MOL007100與3SA0、 MOL007093與1XPC、MOL007093與3SA0可見氫鍵連接。見圖7-圖9。

圖7 MOL007100-3SA0

圖8 MOL007093-1XPC

圖9 MOL007093-3SA0

表2 分子對接結合能（kcal/mol）

討論

CA具有發病率高的特點，是癌癥患者常見的伴發癥狀。但其出現的機制尚不明了，影響因素較多。針對CA，現代醫學可采用糖皮質激素、大麻素、醋酸甲地孕酮等藥物[18]。而目前中醫治療上主要應用經方、驗方、中成藥注射劑及中醫外治法[19]，但缺少指南統一標準。

本研究通過TCMSP數據庫及相關文獻補充，篩選得出丹參—莪術的活性成分，再由GeneCards、OMIM數據庫中得到CA的疾病靶點，后利用String數據庫進行蛋白互作分析，并通過cytoscape3.8.2軟件進行可視化分析，篩選得到核心靶點，最終進行富集分析及分子對接。結果表明丹參新醌、二氫丹參內酯、2-異丙基-8-甲基菲-3，4-二酮與MAPK1、ESR1有較強的結合能力，在丹參、莪術治療CA過程中具有重要作用。

MAPK是絲裂原活化蛋白激酶，也是CXC趨化因子的靶標之一[20]，趨化因子可結合相應受體，參與腫瘤形成、免疫反應等過程[21]，CXCL14作為趨化因子家族成員，參與了體重控制過程，并且可能在中樞神經系統調控攝食行為活動中起到重要作用[22]。胰高血糖素樣肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）是由腸道L細胞所產生的激素，具有刺激胰島素分泌、利尿、減少胃排空、減少炎癥和細胞凋亡等作用[23]，研究表明GLP-1受體激活能夠增加MAPK磷酸化達到抑制食物攝入的目的[24]。同時MAPK1是GATA3轉錄因子的轉錄靶標，去泛素化酶USP21可以通過與GATA3結合來調節MAPK1的表達[25]。當血管緊張素Ⅱ1型受體與血管緊張素Ⅱ結合后可激活細胞內MAPK途徑以觸發鈉攝入[26]。另外，通過果蠅實驗證明Dop1R2/Raf/MAPK通路是多巴胺信號在食欲嗅覺記憶穩定過程中的關鍵下游效應子[27]，能夠以此來穩定食欲和嗅覺的記憶。

ESR1作為編碼雌激素受體α（estrogen receptor，ERα）的基因，對于乳腺癌[28]、子宮內膜癌[29]、肝內膽管癌[30]等具有臨床意義。ERα作為重要的雌激素受體之一，是調節正常攝食行為、維持正常的能量消耗和脂肪分布必不可少的[31]。ESR1能夠調節SLC2A4基因的表達，改變組織胰島素敏感型葡萄糖轉運蛋白4（GLUT4）含量，最終調節血糖[32]。也有研究表明ESR1與限制性神經性厭食有關，但相關的單核苷酸多態性還沒有已知的功能，仍需要進一步實驗[33]。

KEGG通路富集分析表明丹參、莪術治療CA可能與雌激素信號通路（Estrogen signaling pathway）、腫瘤壞死因子信號通路（TNF signaling pathway）等有關。雌激素信號通路有助于對抗腫瘤免疫的異常調節，還可能逆轉出現免疫抑制的腫瘤微環境[34]。雌激素可以與GLP-1結合形成GLP-1-雌激素偶聯物，其存在可以將雌激素特異性遞送到表達胰高血糖素樣肽-1受體（GLP-1R）的區域[35]，而SIM1神經元中的ERα可以部分介導GLP-1-雌激素偶聯物，從而發揮減重作用[36]。此外，在已被切除卵巢的大鼠中進行實驗，證實雌二醇（E2）具有抑制食物攝入的效力[37]。癌癥患者的免疫系統會釋放細胞因子，TNF-α作為其中之一，可通過血腦屏障，與大腦內皮細胞管腔表面相互作用，進而導致影響食欲下降的物質的釋放[13]。在腫瘤惡病質患者中，血液TNF-α水平也出現顯著增高，且與體重穩定組的腫瘤患者相比，腫瘤惡病質患者的皮下脂肪組織中TNF-αmRNA呈現高表達狀態[38]。

綜上所述，本研究針對丹參、莪術治療CA的機制、作用靶點、通路進行預測，并運用分子對接進行驗證，可知丹參、莪術的前3個核心成分為丹參新醌、二氫丹參內酯、2-異丙基-8-甲基菲-3，4-二酮并通過MAPK1、ESR1核心靶點入手，調節Estrogen signaling pathway、TNF signaling pathway等信號通路，達到改善患者食欲的目的。后續可繼續進行實驗驗證，為進一步研究丹參、莪術治療CA的臨床效果，提供一定的指導意義。