復方芩柏顆粒對潰瘍性結腸炎大鼠Th1/Th2、Th17/Treg細胞穩態影響

洪譯 王真權 羅雯鵬

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis,UC)是以彌漫性、連續性病變為特征的慢性非特異性炎癥性疾病,屬于炎癥性腸病范疇[1]。該病全球發病率逐年上升[2],已成為臨床較難治愈的常見消化道疾病之一。針對UC的病因及發病機制仍未達成共識,目前已提出包括遺傳、免疫學失調、微生物群失衡和環境觸發等多種致病因素,其中較為公認的是與免疫功能障礙失調相關的免疫學說。

中醫并無與UC相對應病名,臨床根據患者癥狀分為“泄瀉”“腸澼”等病。中醫認為,UC病位在大腸,與脾胃、肝、肺等多臟腑相關。脾虛濕熱蘊腸為基本病機,本虛標實為病性特點。多由飲食不節、外感六淫、情志失調[3]或稟賦不足所致。臨床診療中發現大多UC發病與中醫“濕熱[4]”“瘀血[5]”“濁毒[6]” 等病理因素相關。

復方芩柏顆粒是我院多年來臨床治療UC的純中藥制劑,療效確切,在防治UC的發生發展方面有其獨特優勢。前期已有研究顯示,復方芩柏顆粒具有較強的抑菌抗炎作用,能夠有效增強機體免疫力,且無明顯毒副作用[7]。同時復方芩柏顆粒可促進UC大鼠腸道黏膜愈合,減輕腸道炎癥反應,其機制可能是通過上調轉化生長因子β1(transforming growth factor 1, TGF-β1)表達,調控輔助性T細胞(helper T cell)17/調節性T細胞(regulatory T cells,Treg)細胞穩態平衡,并與用藥濃度相關。該結果提示 Th17/Treg 可能是復方芩柏顆粒治療 UC 的重要靶點[8-10]。本研究旨在證實復方芩柏顆粒對UC大鼠Th1/Th2、Th17/Treg細胞穩態的調節作用,探討復方芩柏顆粒對潰瘍性結腸炎的治療機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性SD大鼠42只(動物質量合格證編號:422023100001662),SPF級,6～7周齡,體質量(230±15)g,購于湖北貝恩特生物科技有限公司,許可證號:SCXK(鄂)2021-0027,本次實驗已通過動物實驗倫理審查[編號:LACUC(準)- BNT-2022-002]。大鼠飼養于SPF級環境,飼養室溫度(22±3)℃,相對濕度 50%～60%,12小時明暗交替,實驗前適應性喂養7天。

1.2 實驗藥物、試劑及儀器

復方芩柏顆粒,組成:黃柏、檳榔、秦艽、防風炒炭、熟大黃、生地黃、當歸尾、桃仁、延胡索、黃芩、澤瀉,藥物比例:黃柏∶黃芩∶澤瀉∶當歸∶檳榔∶秦艽∶防風∶熟大黃∶延胡索∶生地黃∶桃仁=4∶4∶4∶4∶3.5∶3.5∶3.5∶3.5∶3.5∶5∶2,規格:6 g/包,批號:湘藥制字Z20080819,湖南中醫藥大學第二附屬醫院提供;美沙拉嗪腸溶片(黑龍江天宏藥業股份有限公司生產,批號:20190109);葡聚糖酸鈉(dextran sulfate,DSS)(Sigma,批號:PHL83846);糞便隱血檢測試劑(遠慕生物,批號YM-TC0511),二甲苯(國藥,批號:10023418);無水乙醇(國藥,批號:10009259);蘇木素—伊紅染液(三鷹,批號:B600020);CD4流式抗體(biolegend,批號:201505);干擾素γ(interferon-γ,IFN-γ)流式抗體(Cell Signaling,批號:62675S);白介素(interleukin,IL)-4流式抗體(biolegend,批號:511905);IL-17A流式抗體(Invitrogen,批號:12717781);CD25流式抗體(biolegend,批號:202113);叉頭狀轉錄因子3(forkhead box protein P3,FoxP3)流式抗體(biolegend,批號:320007);熒光定量PCR MasterMix(TSINGKE,批號:TSK201);BCA蛋白定量試劑盒(碧云天,批號:P0009);ECL底物發光試劑盒(武漢聚能譯通,批號:K-12043-D10);SDS聚丙烯酰胺分離膠(Solarbio,批號:S8010);HRP標記山羊抗兔(武漢三鷹,批號:SA00001-2);HRP標記山羊抗小鼠(武漢三鷹,批號:SA00001-1)。病理切片機(德國Leica,型號:RM 2016);(流式細胞儀Beckman,型號:CytExpert);實時熒光定量PCR儀(ABI,型號:QuantStudio 12K);PCR儀(LongGene,型號:A300);水平電泳儀(JUNYI Electrophoresis Co,型號:JY300);紫外分析儀(JUNYI Electrophoresis Co,型號:JY02S);凝膠成像系統(Bio-rad,型號:ChemiDocTMXRS+)。

1.3 造模、分組及給藥

SD大鼠按照SPF級標準適應性喂養7天后,根據隨機數字表選取30只大鼠為模型制備組,剩余12只為正常組,模型制備組自由飲用5% DSS溶液[11-12],正常組自由飲用純凈水,連續7 天后,正常組和模型制備組各隨機抽取3只大鼠,對照兩組大鼠一般情況、結腸組織形態改變及病理結構改變確定造模是否成功[13]。造模成功后模型制備組27只大鼠根據隨機數字表分為模型組、美沙拉嗪組、復方芩柏顆粒組三組,每組9只大鼠。

正常組及模型組:灌服生理鹽水,2 mL/次,2次/天,連續3周方式干預;美沙拉嗪組:美沙拉嗪在成人潰瘍性結腸炎急性活動期服用劑量為3 g/d,參照《動物實驗方法學》一書[14],可得大鼠等效劑量為270 mg/(kg·d)。將美沙拉嗪腸溶片用蒸餾水溶解配置成500 mg/mL母液,按照灌胃濃度用蒸餾水稀釋成15.5 mg/mL,使用時按照灌服,2次/d,2 mL/次,連續3周方式干預;復方芩柏顆粒組:前期實驗已得出最佳復方芩柏顆粒大鼠給藥濃度為2.52 g/(kg·d)[9],將復方芩柏顆粒用蒸餾水溶解配置成1g/mL母液,按照灌胃濃度用蒸餾水稀釋為145 mg/mL,使用時按照灌服,2次/d,2 mL/次,連續3周方式干預。干預結束后處死大鼠。

1.4 標本采集

將大鼠固定于無菌操作臺上,用3%戊巴比妥腹腔注射深度麻醉大鼠后,打開大鼠胸腔,暴露心臟,針頭刺入右心室采血,離心后將血清保存在-80℃環境下,以待后續檢測。頸椎脫臼法處死大鼠,打開大鼠腹腔,采集大鼠腸系膜淋巴結及脾臟用于后續單細胞懸液制作。離斷大鼠恥骨聯合,分離肛管,取出腸道,于回盲部分離,縱軸剖開,祛除殘余糞便,觀察大鼠腸道情況,病變明顯處留取標本,保存在-80℃環境下以待后續檢測。

1.5 大鼠一般情況觀察

自造模第一日起,每日密切觀察并記錄各組大鼠飲食、飲水、糞便及大便隱血、活動、體質量等一般情況。根據疾病活動指數(disease activity index,DAI)評估大鼠潰瘍性結腸炎嚴重程度,DAI 評分=(體質量下降分數+大便性狀分數+便血分數)/3。DAI 評分法見表1。

表1 DAI評分標準

1.6 大鼠結腸組織病理變化觀察

大鼠結腸組織放置于4%多聚甲醛溶液中固定24小時后石蠟包埋切片,脫蠟水化后進行蘇木素—伊紅(hemotoxylin-eosin staining,HE)染色,于顯微鏡下觀察結腸組織病理學變化,記錄并拍照。

1.7 流式細胞儀檢測大鼠脾臟、腸系膜淋巴結中Th1/Th2、Th17/Treg細胞比例

取大鼠腸系膜淋巴結及脾臟細胞,研磨過濾后制作單細胞懸液,重懸并調整細胞濃度為1×106個/mL。取100 μL上述單細胞懸液按照細胞表面抗原染色方法標記表面抗原(CD4+、CD25+),4 ℃孵育30分鐘,加入預冷后的流式染色緩沖溶液洗滌細胞,離心5分鐘(1000 r/min),加入1 mL的固定/破膜工作液(1∶3稀釋),混勻,4 ℃避光孵育45分鐘,再加入2 mL破膜緩沖液(1∶9去離子水稀釋)離心洗滌細胞后棄上清,加入FoxP3(或IL-4、IL-17A、IFN-γ)抗體,避光4℃孵育30分鐘后加入1 mL破膜工作液離心洗滌細胞2次并棄上清,最后加入0.5 mL PBS重懸細胞,上機檢測。

分別檢測各組大鼠脾臟、腸系膜淋巴結中CD4+IFN-γ+細胞、CD4+IL-4+T細胞、CD4+IL-17A+T細胞、CD4+CD25+FoxP3+T細胞占CD4+T細胞百分比,以觀察治療前后Th1、Th2、Th17、Treg細胞百分比含量。

1.8 RT-PCR 法檢測結腸組織中T-bet、GATA-3、RORγt、FoxP3 的mRNA表達

Trizol法提取總RNA后進行基因組DNA去除反應,用逆轉錄試劑盒將組織RNA逆轉錄為cDNA,引物設計如表2。

表2 T-bet、GATA-3、RORγt、FoxP3引物序列

再置于PCR儀上擴增檢測,反應條件為95℃預變性1分鐘;95℃10秒,60℃10秒,72℃10～15秒,循環40次。獲得運行數據,最終數據以2-△△Ct法進行分析并整理。

1.9 Western blot 法檢測結腸組織中RORγt、FoxP3的蛋白表達

樣品制備:大鼠腸道組織冰上研磨后加入裂解液冰上裂解20分鐘,離心后取上清用BCA試劑盒檢測總蛋白含量,加入適量5×上樣緩沖液,混勻后煮5分鐘。后進行SDS-PAGE電泳:固定電泳裝置,加Tris-甘氨酸電泳緩沖液,加樣品和預染Marker。連接電源(電壓80V),待溴酚藍至分離膠時電壓改120V,直到溴酚藍至分離膠底部,關閉電源。 Western blot 檢測:轉膜、封閉、洗滌后將一抗和靶蛋白結合,洗滌后溫育二抗和一抗,洗滌后將ECL 試劑滴加在封口膜上。將PVDF膜的正面朝下接觸發光試劑,顯色2分鐘,翻轉PVDF膜,觀察結果。

1.10統計學處理

2 結果

2.1 對大鼠一般情況及腸黏膜影響

正常組大鼠食欲旺盛,飲水正常,體質量未見明顯下降,反應敏捷,糞便色黑,麥粒狀,糞便隱血(-)。腸壁無增厚,黏膜完整,絨毛排列整齊,未見脫落、潰瘍、隆起、壞死;模型組大鼠體質量下降,易驚恐,飲食飲水減少,出現行動遲緩、大便稀溏、大便隱血陽性等癥狀。其結腸長度變短,腸壁水腫,腸黏膜面充血,有彌漫性出血點、糜爛和潰瘍,隱窩膿腫;美沙拉嗪組及復方芩柏顆粒組大鼠癥狀較模型組改善, 飲食、 飲水量、 體質量趨向正常組,結腸長度較正常組稍短,腸黏膜及腸壁形態及結構較模型組恢復,充血水腫、潰瘍病變處減少。四組大鼠DAI評分總體均數不等(H=30.051,P=0.000),如表3所示。

表3 各組大鼠DAI評分

2.2 對大鼠結腸病理形態改變影響

正常組大鼠結腸組織黏膜完整連續、腺體排列整齊規則,結構清楚,未見明顯炎性細胞浸潤;模型組大鼠結腸組織可見黏膜下層充血、水腫,毛細血管擴張,黏膜及黏膜下層有炎性細胞浸潤,腺體破壞嚴重,肌層變薄。美沙拉嗪組及復方芩柏顆粒組大鼠治療后其結腸組織病理形態改變相似,均為黏膜及黏膜下層存在少量充血和水腫現象,肌層較正常組略微變薄,炎性細胞浸潤較模型組減少。見圖1。

注: A 正常組;B 模型組;C 美沙拉嗪組;D 復方芩柏顆粒組。

2.3 對大鼠Th1/Th2、Th17/Treg細胞比例影響

與正常組相比,模型組Th1細胞含量顯著升高(P<0.05)。美沙拉嗪組及復方芩柏顆粒組干預后Th1細胞含量較模型組降低(P<0.05);模型組Th2細胞含量較正常組顯著降低(P<0.05)。美沙拉嗪組及復方芩柏顆粒組干預后Th2細胞含量較模型組明顯升高(P<0.05);模型組Th17細胞含量較正常組顯著升高(P<0.05)。美沙拉嗪組及復方芩柏顆粒組干預后Th17細胞含量較模型組降低(P<0.05);模型組Treg細胞含量較正常組明顯降低(P<0.05)。復方芩柏顆粒組、美沙拉嗪組干預后Treg細胞含量較模型組降低(P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠Th1、Th2、Th17、Treg細胞百分比

由于模型組Th1、Th17細胞比例較正常組上升,Th2、Treg細胞比例較正常組下降,故模型組中Th1/Th2、Th17/Treg細胞比值較正常組升高;與模型組相比,美沙拉嗪組及復方芩柏顆粒組Th1、Th17細胞比例回調下降,Th2、Treg細胞比例回升,故美沙拉嗪組及復方芩柏顆粒組Th1/Th2、Th17/Treg細胞比值較模型組下降。其中復方芩柏顆粒組Th1/Th2細胞比值下調較美沙拉嗪組更明顯。

2.4 對大鼠T-bet、GATA-3、RORγt、FoxP3的 mRNA 表達影響

通過 RT-PCR 檢測大鼠結腸組織中轉錄因子T-box轉錄因子(T-box expressed in T cells,T-bet)、GATA結合蛋白3(GATA binding protein-3,GATA-3)、維甲酸相關孤兒受體γt(retinoid-related orphan nuclear receptor γt,RORγt) 及FoxP3 的 mRNA 表達水平。模型組中T-bet 、RORγt的mRNA含量高于正常組(P<0.05),模型組GATA-3、FoxP3的mRNA含量低于正常組(P<0.05)。與模型組相比,美沙拉嗪組及復方芩柏顆粒組治療后T-bet、RORγt的mRNA含量降低(P<0.05),GATA-3、FoxP3的mRNA含量升高(P<0.05)。各組T-bet、GATA-3、RORγt、FoxP3的 mRNA 表達見表5。

表5 各組大鼠T-bet、GATA-3、RORγt、FoxP3的 mRNA 表達

2.5 對大鼠RORγt、FoxP3 的蛋白表達影響

通過Western blot檢測大鼠結腸組織中RORγt、FoxP3的蛋白表達。與正常組相比,模型組RORγt 蛋白表達升高(P<0.05),FoxP3蛋白表達降低(P<0.05)。與模型組相比,美沙拉嗪組及復方芩柏顆粒組治療后RORγt 蛋白表達降低(P<0.05),美沙拉嗪組及復方芩柏顆粒組治療后FoxP3蛋白表達升高(P<0.05)。復方芩柏顆粒組RORγt的蛋白表達較美沙拉嗪組下調更為明顯(P<0.05)。見表6、圖2。

注:NC正常組; UC模型組; QB復方芩柏顆粒組; ME美沙拉嗪組。

表6 各組大鼠RORγt、FoxP3的蛋白表達

3 討論

目前研究認為,UC的發病機制中免疫功能失衡是重要因素之一,T淋巴細胞在炎癥刺激下可激活 CD8+T 細胞,進一步激活CD4+T 細胞,二者之間的平衡反映T細胞功能。CD4+T 細胞可分為Th 細胞和Treg細胞,Th 細胞又可分為Th1、Th2、Th9及 Th17等細胞亞群。

3.1 Th1/Th2免疫平衡及相關細胞因子

Th1和Th2細胞由Th0細胞分化而成。Th1細胞主要產生IFN-γ、IL-2等促炎因子,對抗細胞內病原體導致的免疫反映。轉錄因子T-bet是Th1細胞的特異性轉錄因子,IL-2可通過誘導T-bet表達增加Th1細胞分化。T-bet在產生IFN-γ過程中起決定性作用,IFN-γ又可誘導T-bet表達,二者之間形成正反饋調節環[15]。T-bet亦可轉導進入Th2細胞中,抑制IL-4等抑炎因子表達及Th2細胞分化;Th2細胞主要產生IL-4、IL-5和IL-13等抑炎因子對抗寄生蟲及過敏反應。GATA-3是Th2細胞的特異性轉錄因子,IL-4依靠GATA-3促使Th0細胞分化為Th2細胞[16]。正常情況下,Th1和Th2細胞保持動態平衡,聯合其他的因素共同調節機體免疫平衡[17]。而在UC急性活動早期外周血中IFN-γ等Th1細胞分泌的促炎細胞因子含量明顯升高,抑炎因子相對不足導致炎癥發生;后期外周血中IL-4、IL-6等Th2細胞分泌的抑炎細胞因子水平明顯降低導致炎癥反應劇烈,即Th1/Th2細胞平衡被打破致使免疫失常從而誘發炎癥[18]。

3.2 Th17/Treg免疫平衡及相關細胞因子

Th17/Treg細胞穩態失衡是 UC 發病的另一重要機制。二者相互抑制互相拮抗,亦可相互轉化[19-21]。Th17細胞可防御細胞外細菌感染,也介導自身免疫性疾病和慢性炎癥。主要分泌IL-17、IL-21、IL-23等促炎細胞因子,可促使多種細胞分泌趨化因子和細胞因子,并通過細胞集落刺激因子和趨化因子促進中性粒細胞、巨噬細胞和淋巴細胞增殖和成熟。RORγt是Th17細胞的特異性細胞轉錄因子。RORγt表達可抑制Treg細胞分化,促使TGF-β、IL-6、IL-23等多種促炎因子共同調控Th17細胞分化,研究發現去除TGF-β基因可抑制Th17細胞分化,IL-23降低亦可使Th17細胞分化減少[22];Treg細胞通過分泌IL-10、TGF-β等抑炎細胞因子抑制樹突細胞、B細胞等細胞活化和增殖來介導免疫耐受。FoxP3是Treg細胞的特異性轉錄因子,可抑制Th1細胞、Th17細胞等促炎淋巴細胞分化[23]。IL-10維持FoxP3表達同時誘導Treg細胞分化,TGF-β在多種細胞因子調控下亦可誘導Treg細胞分化。由于TGF-β既能誘導RORγt表達又能誘導FoxP3表達,而二者分別是Th17細胞和Treg細胞分化的重要條件,故Th17細胞和Treg細胞在分化過程中是相互拮抗的。

正常情況下,Th17/Treg細胞處于動態平衡狀態,共同維持機體腸黏膜免疫穩態,其平衡失常則引發免疫失衡導致炎癥反應[24]。UC患者外周血中Th17細胞分泌的IL-17等促炎因子增多,Treg細胞分泌的 IL-10等抑炎因子減少,引起免疫紊亂,導致UC發生[25-28]。

3.3 復方芩柏顆粒對UC的治療作用

本實驗中,模型組大鼠DAI評分明顯高于正常組,美沙拉嗪組、復方芩柏顆粒組大鼠經干預后DAI評分下降(P<0.05)。模型組大鼠IFN-γ、IL-17促炎因子含量升高,IL-4抑炎因子、FoxP3細胞因子含量降低(P<0.05),即Th1/Th2、Th17/Treg較正常組顯著升高(P<0.05),經美沙拉嗪、復方芩柏顆粒干預治療后IFN-γ、IL-17促炎因子含量降低,IL-4抑炎因子、FoxP3含量升高(P<0.05),即Th1/Th2、Th17/Treg細胞比值較模型組下降(P<0.05)。提示復方芩柏顆粒可能通過下調IFN-γ、IL-17促炎因子百分比含量、上調IL-4抑炎因子百分比含量、FoxP3水平,恢復Th1/Th2、Th17/Treg細胞動態平衡達到治療UC效果。

模型組大鼠結腸組織T-bet及RORγt mRNA表達、RORγt的蛋白表達水平顯著增高(P<0.05),而GATA-3及FoxP3的mRNA表達、FoxP3的蛋白表達水平明顯降低(P<0.05),經美沙拉嗪及復方芩柏顆粒干預治療后,T-bet及RORγt的 mRNA表達、RORγt的蛋白表達水平均下降(P<0.05);GATA-3及FoxP3的mRNA表達、FoxP3的蛋白表達水平均上升(P<0.05)。提示復方芩柏顆粒可通過上調GATA-3及FoxP3轉錄因子水平、下調T-bet及RORγt轉錄因子水平達到治療UC效果。其機制可能是通過上調GATA-3水平促進Th2細胞分化,上調FoxP3水平促進Treg細胞分化,以抑制免疫應答;下調T-bet、RORγt水平減少促進炎癥反應的Th1細胞及Th17細胞增殖分化以控制腸道炎癥反應修復腸道黏膜。

綜上所述,本實驗通過檢測復方芩柏顆粒對DSS誘導的UC大鼠轉錄因子T-bet、GATA-3、RORγt、FoxP3表達及檢測Th1/Th2細胞、Th17/Treg細胞治療前后穩態變化,得出結論:復方芩柏顆粒通過下調T-bet轉錄因子抑制Th1細胞分化,減少IFN-γ等促炎因子分泌。通過上調GATA-3轉錄因子增加Th2細胞分化,以此增加IL-4等抑炎因子分泌,從而調節Th1/Th2細胞穩態平衡,減輕腸道炎癥反應;同時,復方芩柏顆粒可以下調RORγt轉錄因子水平、上調FoxP3轉錄因子水平,抑制Th17細胞分化、促進Treg細胞分化,減少IL-17等促炎因子分泌,以此調節Th17/Treg細胞平衡,減輕炎癥反應,增強免疫抑制,達到治療UC、恢復腸道穩態的效果。