基于SCF/C-kit通路探討三焦針法對腹瀉型腸易激綜合征大鼠的影響

尚雪梅 朱洲 潘莉 唐徐韻 宋光仙 石麗杉 程敏 楊孝芳

腸易激綜合征(irritable bowel syndrome,IBS)作為一種慢性胃腸道疾病,臨床特征主要表現為腹痛、腹瀉及糞便性狀改變[1-2]。在我國IBS發病率約占7%～11%,其中臨床以腹瀉型腸易激綜合征(irritable bowel syndrome with diarrhea,IBS-D)最為常見,約占整個IBS患者數的74%[3-5]。近來研究發現,胃腸動力異常是引起IBS-D發病一大病理特征[6],研究認為,Cajal間質細胞(interstitial cells of Cajal, ICC)作為胃腸活動“起搏器”,其異?？蓪е挛改c動力障礙,而干細胞因子(stem cell factor,SCF)和酪氨酸激酶受體(tyrosine kinase receptor, C-kit)則可直接調控ICC功能的發揮[7]從而影響胃腸動力。因而,對SCF/C-kit通路在胃腸動力異常過程中的作用機理進行探討具有一定意義。

中醫學認為IBS-D病位在腸,與肝、脾、腎、肺等臟腑功能密切相關,其發病主要與情志失調、飲食不節、感受外邪等密切相關[8],但其根源于臟腑氣機失調,從而誘發IBS-D。因而,調暢全身臟腑氣機成為IBS-D重要治則。《難經·六十六難》云:“三焦者,原氣之別使也,主通行三氣?！盵9]中醫古籍認為三焦在一身氣機運行中占有重要地位,是一身氣機的通道,因而,通過調暢三焦可調控全身臟腑氣機的運行?；诖?本研究通過采用韓景獻教授基于“三焦氣化失司”理論提出的三焦針法調節IBS-D脾胃運化、改善臟腑氣機、益氣調血、扶本培元[10]。同時基于IBS-D大鼠模型,探究三焦針法對IBS-D大鼠SCF/C-kit通路的調控作用,闡述三焦針法治療IBS-D改善胃腸動力的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

SPF級健康wistar雄性大鼠24只,體質量(300±50)g,購自:長沙市天勤生物技術有限公司[生產許可證號:SCXK(湘)2019-0013]。飼養于貴州中醫藥大學中心動物實驗室,飼養溫度(20±2)℃,濕度(60±5),光明/黑暗周期為12小時,定期更換墊料,保持環境干燥通風,自由飲水和攝食。大鼠適應性喂養7天,按隨機數字表抽取6只大鼠為空白組,其余18只大鼠為模型組進行造模。造模完成后,根據隨機數字表分為模型組、西藥組和三焦組,每組6只。所有動物實驗過程均通過貴州中醫藥大學實驗倫理審查(論理審批號:20220068),同時符合國家實驗動物福利指南。

1.2 主要試劑與儀器

冰醋酸(20220402,成都金山化學試劑有限公司),匹維溴安片(法國蘇威公司,進口藥品注冊證號:H20160396),蘇木素—伊紅(hemotoxylin-eosin,HE)染色試劑(武漢賽維爾生物科技有限公司),PCR引物(生工生物工程(上海)股份有限公司),Trizol試劑(合肥博美生物技術有限公司),BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司),兔抗大鼠SCF、C-kit抗體(abclonal)。

針刺針(0.25 mm×0.25 mm,蘇州醫療用品廠有限公司),曠場實驗箱(XR-XZ301,上海欣軟信息科技有限公司),電子天平(PPT-A+100,美國康州HZ電子科技有限公司),數字切片掃描儀[Pannoramic250,3DHISTECH(Hungary)],酶標儀(型號:SpectraMAX Plus384,美谷分子儀器有限公司),實時熒光定量(RT-PCR)儀(型號:QuantStudio TM3,美國Thermofisher儀器有限公司),電泳儀JY200C(北京君意東方電泳設備有限公司),水平脫色搖床TY-80A(江蘇科析儀器有限公司),化學發光凝膠成像儀5200(上海天能科技有限公司)。

1.3 造模方法

IBS-D模型動物制備參照章海鳳等[11]的方法,采用冰醋酸+束縛應激方式進行造模:4%的冰醋酸溶液按0.2 mL進行灌腸,每隔兩日增加0.1 mL,直至劑量為0.5 mL。灌腸后,進行束縛刺激,1次/d,每次2小時,持續給藥14天。以大鼠出現靜臥少動、肛周污穢等一般癥狀及體質量較空白組降低,曠場實驗中橫向運動、縱向距離較空白組減少、稀便率和AWR3分時注水量增加為造模成功標準[11]。

1.4 干預方法

空白組、模型組:予固定但不進行其余干預。

西藥組:進行匹維溴銨灌胃,濃度為1.5 mg/mL的匹維溴銨混懸液按大鼠體質量以15 mg/kg的劑量給藥,1次/d,連續治療14天。

三焦組:參照文獻[12]進行三焦針法干預:將大鼠固定,選取“膻中”“中脘”“氣海”及雙側“血?！薄白闳铩?穴位定位參照《實驗動物常用穴位名稱與定位第2部分:大鼠》[13]進行定位),“血?！毕蛏掀酱?～5 mm,行捻轉補法(>120次/min)30秒,其他穴位均直刺2～3 mm,行捻轉補法30秒,1次/d,連續治療14天。

1.5 觀察指標及檢測方法

1.5.1 一般狀態 每日觀察大鼠的食量、飲水、精神狀態、皮毛色澤、活動度、糞便、肛周污穢程度及有無其它異常癥狀等情況,同時記錄大鼠體質量。

1.5.2 曠場實驗 分別于造模前、造模后及干預后進行。實驗開始前將大鼠放置于實驗環境中適應30分鐘后開始實驗。每次將一只大鼠放置于50 cm×50 cm×50 cm的曠場實驗箱中心位置,利用攝像機記錄大鼠5分鐘內行為,運用ANY-MAZE軟件分析大鼠橫向運動(行走距離)、縱向運動(直立次數)及糞便粒數。每只大鼠實驗后,用75%乙醇溶液擦拭曠場實驗箱,避免大鼠殘留氣味影響實驗結果。

1.5.3 稀便率 參照文獻[13]進行干預,在造模后、治療后,將每組大鼠分開放置于鐵籠中,將墊有濾紙的托盤放置于鐵籠下方,4小時后統計各組大鼠總排便粒數和稀便數,計算 稀便率。稀便率(%)=(稀便數÷總排便粒數)×100%。

1.5.4 AWR評分 參照文獻[13]進行干預,分別于造模后、治療后采用結直腸擴張(colorectal dilatation,CRD)法對各組大鼠進行AWR評分,以評估大鼠內臟敏感性。測定前12小時大鼠禁食不禁水。大鼠吸入七氟烷輕度麻醉后,將甘油潤滑的6F導尿管緩慢插入肛門7 cm后用膠帶將導尿管固定于大鼠尾根部,將大鼠置于單籠中,待大鼠蘇醒且狀態穩定時經球囊注入(27±1)℃的0.9%氯化鈉溶液,觀察引起大鼠AWR達3分時的注水量,重復檢測3次,取3次平均值作為大鼠引起 AWR 達3分時最小容量閾值,AWR評分標準見表1。

表1 AWR評分標準

1.5.5 HE染色法觀察大鼠結腸組織 干預結束后第二天,將大鼠麻醉,迅速分離結腸,使用4%的多聚甲醛進行固定,將固定后組織經乙醇梯度脫水,二甲苯透明,包埋,石蠟切片(5 μm);采用HE染色,切片脫蠟至水,蘇木精染色,鹽酸乙醇分化,流水沖洗,中性樹膠封固,使用Pannoramic 250數字切片掃描儀(3DHISTECH)進行圖片觀察并采集。

1.5.6 RT-PCR法檢測大鼠結腸組織中SCF、C-kit mRNA表達 將上述各組大鼠結腸組織用Trizol試劑提取總RNA,RT反應后逆轉錄為cDNA,將cDNA進行實時熒光定量PCR反應。PCR反應:95℃30秒,95℃5秒,55℃30秒,72℃30秒,共45個循環,得到檢測樣本相應CT值,通過2-ΔΔCT計算樣本mRNA表達量。引物序列詳見表2。

表2 引物序列

1.5.7 Western blot法檢測大鼠結腸組織中SCF、C-kit蛋白表達 提取結腸組織蛋白,使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度,具體操作根據試劑盒說明書進行。后進行蛋白變性、電泳、轉膜、封閉、一抗孵育(C-kit 1∶2000;SCF 1∶1000;β-actin 1∶50000)、二抗孵育(1∶5000稀釋)。使用ECL發光液按1∶1混合后,滴加到PVDF膜上反應1分鐘,將膜置于化學發光凝膠成像儀暗室中,使用天能GIS機箱控制軟件V2.0進行曝光掃描,用Image J軟件進行分析,結果以目的蛋白相對表達量表示。

1.6 統計學處理

2 結果

2.1 大鼠一般狀態比較

造模后,空白組大鼠毛色光滑,抓取時動作敏捷,精神充足,肛周干凈,糞便呈顆粒狀。其余三組大鼠毛色暗淡,精神萎靡,反應遲鈍,肛周污跡且伴糞便稀薄。干預后,西藥組和三焦組大鼠精神狀態,毛色、活動、肛周污跡及糞便性狀得到改善。

2.2 各組大鼠體質量比較

造模前,各組大鼠體質量無明顯差異;造模后,與空白組比較,各組大鼠體質量降低(P<0.01);干預后,與模型組比較,西藥組、三焦組體質量顯著升高(P<0.05,P<0.01),且西藥組與三焦組比較無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組大鼠體質量比較

2.3 各組大鼠曠場實驗比較

造模前,各組大鼠無差異;造模后,與空白組比較各組大鼠橫向運動距離及縱向運動次數均顯著減少(P<0.01)。干預后,與模型組比較,西藥組及三焦組大鼠橫向運動距離及縱向運動次數均顯著增加(P<0.01),且西藥組與三焦組比較無統計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 各組大鼠橫向運動與縱向運動結果比較

2.4 各組大鼠稀便率情況

造模后,與空白組比較各組大鼠稀便率顯著增加(P<0.01)。干預后,與模型組比較,西藥組及三焦組大鼠稀便率均顯著降低(P<0.01),且西藥組與三焦組比較無統計學意義(P>0.05)。見表5。

表5 各組大鼠稀便率情況比較

2.5 各組大鼠AWR3分時注水量情況

造模后,與空白組比較各組大鼠AWR3分時注水量顯著降低(P<0.01)。干預后,與模型組比較,西藥組及三焦組大鼠AWR3分時注水量均顯著增加(P<0.01),且西藥組與三焦組比較無統計學意義(P>0.05)。見表6。

表6 各組大鼠AWR3分時注水量情況比較

2.6 各組大鼠結腸病理情況

模型組大鼠結腸固有層有少量炎癥細胞浸潤,以淋巴細胞為主;其余大鼠結腸粘膜結構清晰完整,分層明顯,上皮細胞排列整齊,固有層腺體排列較規則,固有層和粘膜下有不同程度的中性粒細胞或淋巴細胞聚集,無明顯病理變化。見圖1。

注:A 空白組;B 模型組;C 西藥組;D 三焦組。

2.7 各組大鼠結腸組織中SCF、C-kit mRNA表達水平比較

與空白組相比,IBS-D模型組大鼠結腸組織SCF、C-kit mRNA表達均顯著升高(P<0.01)。與模型組相比,三焦組大鼠結腸組織中SCF mRNA、C-kit mRNA表達均顯著降低(P<0.01),西藥組大鼠結腸組織中SCF mRNA、C-kit mRNA表達無統計學意義(P>0.05)。見表7。

表7 各組大鼠SCF、C-kit mRNA表達水平比較

2.8 各組大鼠結腸組織中SCF、C-kit蛋白表達水平比較

與空白組相比,模型組大鼠結腸組織中SCF、C-kit蛋白表達水平均顯著升高(P<0.01)。與模型組相比,三焦組大鼠結腸組織中SCF、C-kit蛋白表達水平顯著降低(P<0.05),西藥組結腸組織SCF、C-kit蛋白表達水平比較無統計學意義(P>0.05)。見圖2、表8。

圖2 各組大鼠SCF、C-kit蛋白表達水平的影響

表8 各組大鼠SCF、C-kit蛋白表達水平比較

3 討論

IBS-D是一種功能性胃腸道疾病,其發病機制尚未明確。大量研究顯示,胃腸運動功能紊亂是導致IBS-D發病的一大重要病理機制。目前臨床多采用對癥治療,但存在一定不良反應且復發率高等副作用[14],因而探索其替代療法、潛在機制及治療靶點尤為重要。

本實驗采用“冰醋酸灌腸+束縛應激”建立IBS-D模型,針對大鼠體質量、橫向運動、縱向運動、稀便率及AWR3分時閾值進行觀察檢測。結果顯示,與空白組相比,IBS-D模型大鼠體質量明顯下降,橫向運動和縱向運動次數明顯減少,稀便率明顯增加,AWR3分時注水量明顯降低,提示模型復制成功。經針刺干預后,三焦組大鼠體質量、橫向運動、縱向運動次數明顯升高,稀便率明顯減少,AWR3分時注水量明顯增高,提示三焦針法具有改善IBS-D大鼠腹痛、腹瀉癥狀作用。

匹維溴銨作為臨床常用治療IBS-D的解痙藥,主要用于改善由胃腸道功能紊亂導致的排便異常、疼痛等癥狀,可緩解腸道痙攣,改善胃腸道功能,故本實驗選其為陽性對照藥物[15]。本研究顯示,匹維溴銨干預后,SCF、C-kit基因及蛋白表達具有下調趨勢,但無統計學意義,提示匹維溴銨能夠在一定程度上緩解IBS-D癥狀,改善胃腸道紊亂情況,這可能與匹維溴銨作為腸道解痙藥,通過抑制Ca2+離子通道,降低腸道平滑肌興奮性,緩解痙攣[15]的作用機制有關。

中醫學根據臨床特征將IBS-D歸屬于“腹痛”、“泄瀉”等范疇。《景岳全書·泄瀉》曰:“泄瀉之本,無不由于脾胃”?！吨T病源候論》認為“脾胃虛弱則運化不利,水谷不化,致脾胃升降失司,清濁不分則生泄瀉”[16]。因而通過調節脾胃功能,促使脾胃氣機調暢達到腐熟水谷、宣統氣血津液可治療IBS-D。研究發現,韓景獻教授根據“三焦氣化失司”理論提出的三焦針法可通調三焦、助力中焦脾胃運化,以達到“中焦如漚”的狀態[10]。因而本研究以三焦針法作為干預措施,其方所選穴位包括膻中、中脘、氣海、血海(雙側)及足三里(雙側)。膻中為心包募穴,位屬上焦,刺激膻中可宣通上焦心肺之氣,達到“上焦如霧”的狀態;中脘屬任脈,為胃之募穴,脾胃表里,二者合用,可改善脾胃功能,促進中焦氣機運化。氣海為腎之原穴,可生發元氣,為人體提供動力。足三里為胃經合穴,胃下合穴,針刺足三里可促進后天脾胃之氣,調節氣血生化。血海屬足太陰脾經,為血液匯聚之處,血為氣之母,刺激該穴可促進氣血輸布[10, 17]。五穴合用,可調暢三焦氣機、改善中焦脾胃運化功能、滋養臟腑、促進脾胃氣血生化功能的發揮、固本培元,以改善IBS-D的病情。

ICC被稱為腸道平滑肌起搏細胞,研究顯示,ICC通過產生慢波電位控制腸道平滑肌收縮頻次、方向及節點,介導腸道平滑肌收縮,調控腸道神經元釋放相關神經遞質及胃腸激素[7, 18]。ICC的結果和數量異常會直接影響胃腸道運動從而導致出現胃腸動力異常性疾病。C-kit受體是一種具有酪氨酸激酶活性的跨膜蛋白,在ICC細胞膜上特異性表達,因而可間接作為ICC細胞特異性標記物,調控ICC的生理過程與表達。同時,SCF作為一種高度糖化的跨膜蛋白,是C-kit的配體,兩者特異性結合在維持ICC的數量、活化及功能的發揮方面具有關鍵作用[19-21]。本研究通過檢測SCF、C-kit基因及蛋白水平表達,發現IBS-D模型大鼠SCF、C-kit基因和蛋白水平均顯著升高。針刺干預后,SCF、C-kit基因及蛋白水平顯著降低,提示三焦針法可顯著調控SCF/C-kit通路改善IBS-D胃腸道動力障礙,這可能與SCF、C-kit基因及蛋白下調,SCF/C-kit通路受到抑制,腸道平滑肌細胞興奮性下降有關。

綜上所述,本研究初步證明三焦針法可通過調節SCF、C-kit基因和蛋白表達,改善IBS-D胃腸動力異常,緩解IBS-D癥狀。但本研究也存在一些不足之處,針刺對SCF/C-kit的影響是多方面的,接下來研究當中會加入阻斷劑阻斷SCF/C-kit通路傳導,進一步證實三焦針法對SCF/C-kit的影響。