茯苓酸調(diào)節(jié)PI3K/AKT/NF-κB信號通路對大鼠幽門螺旋桿菌相關(guān)性胃炎的治療作用

徐 璐，張冬雨，王瑞鋒

鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院/河南省兒童醫(yī)院鄭州兒童醫(yī)院 1.檢驗(yàn)科 鄭州市兒童感染與免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2.消化科，河南 鄭州 450000

幽門螺旋桿菌(Helicobacterpylori,Hp)是一種螺旋形革蘭氏陰性細(xì)菌,通過口-口和糞-口途徑傳播和感染,幾乎所有感染的患者都會發(fā)生不同程度的胃炎,它可以從急性/慢性炎性反應(yīng)、腸化生、慢性萎縮性胃炎、不典型增生發(fā)展至上皮內(nèi)瘤變,甚至是胃癌[1]。侵入性、內(nèi)窺鏡檢查和非侵入性方法如呼吸、糞便和血清學(xué)檢查用于診斷Hp感染,治療上采用強(qiáng)酸抑制劑與抗生素或鉍的組合,但需要考慮到個(gè)人病史和抗生素耐藥性的急劇增加,治療效果有限[2]。茯苓酸(pachymic acid, PA)是一種來自茯苓的羊毛脂三萜化合物,可抑制多種疾病中的炎性反應(yīng)[3],但在胃炎中的研究較少。磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié),有文獻(xiàn)指出,抑制PI3K及其下游因子蛋白激酶B(protein kinase B, AKT)、激活核因子(nuclear factor, NF)-κB信號可以調(diào)節(jié)多種炎性反應(yīng),抑制促炎因子的分泌,顯著改善急性胃炎模型小鼠的胃黏膜炎性反應(yīng)病變[4]。然而,PA能否通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT/NF-κB信號通路影響Hp相關(guān)性胃炎尚不清楚。本研究旨在討論P(yáng)A對Hp相關(guān)性胃炎的影響及PI3K/AKT/NF-κB通路的調(diào)控作用,以期為Hp相關(guān)性胃炎的治療提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物:SPF級7～8周齡SD雄性大鼠(200～230 g,北京藥康生物科技有限公司[SCXK(京)-2023-0008]),飼養(yǎng)環(huán)境為12 h/12 h光暗循環(huán),溫度(23±1)℃,濕度(55±5)%。研究方案已通過倫理委員會批準(zhǔn),實(shí)驗(yàn)操作遵守相關(guān)規(guī)定。

1.1.2 試劑:PA(純度≥98%,DF0001,德思特生物公司);740 Y-P(PI3K激動劑,HY-P0175,MCE公司);白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、IL-10、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosor-bent assay,ELISA)試劑盒(上海科艾博生物技術(shù)有限公司);一抗磷酸化-NF-κB p65(p-NF-κB p65)(ab239882)、NF-κB p65(ab19870)、p-PI3K(ab182651)、PI3K(ab302958)、p-AKT(ab38449)、AKT(ab8805)(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組:構(gòu)建Hp相關(guān)性胃炎大鼠模型[5]:大鼠禁食12 h,灌胃NaHCO3+消炎鎮(zhèn)痛藥0.5 mL/只,禁食6 h,以含量為109CFU/mL的Hp菌液灌胃(1.5 mL/只),禁食禁水4 h后恢復(fù)常規(guī)飼養(yǎng),隔天1次,持續(xù)10 d,恢復(fù)常規(guī)飼養(yǎng)。ELISA檢測大鼠血清是否含有HpIgG抗體,有則代表造模成功。

將大鼠隨機(jī)分為5組:對照組(CT組)、模型組(M組)、PA低劑量組(PA L組)、PA高劑量組(PA H組)、PA H+740 Y-P組,每組12只。除CT組以外大鼠建立Hp相關(guān)性胃炎模型,CT組大鼠灌胃0.9%氯化鈉溶液。造模成功后大鼠常規(guī)飼養(yǎng)4周,PA L組、PA H組大鼠分別腹腔注射3.33、13.32 mg/kg劑量的PA[6];PA H+740 Y-P組大鼠腹腔注射PA 13.32 mg/kg+尾靜脈注射740 Y-P 10 mg/kg[7];CT組和M組大鼠腹腔注射等量0.9%氯化鈉溶液。1次/d,給藥持續(xù)4周,造模和給藥期間損失大鼠及時(shí)補(bǔ)充。

1.2.2 胃黏膜損傷指數(shù)(gastric mucosal damage index,UI)的評估:每組隨機(jī)選6只大鼠,采用吸入乙醚法麻醉大鼠,仰位固定,快速取出胃組織,自胃大彎剪開胃部,使用生理鹽水沖洗干凈,棉簽擦拭,觀察胃黏膜水腫、充血及潰瘍情況。根據(jù)GUTH法評價(jià)UI[8]:統(tǒng)計(jì)胃黏膜各病灶長度之和,≤1 mm記為1分;1 mm～≤2 mm記為2分;2 mm～≤3 mm記為3分;3 mm～≤4 mm記為4分;>4 mm記為5分;病灶寬度>2 mm則UI值加倍。檢測完成的胃組織勻漿后,分裝儲存在-80 ℃冰箱。

1.2.3 電鏡觀察胃黏膜細(xì)胞:每組隨機(jī)選6只大鼠,麻醉后取胃組織沖洗干凈,一半胃組織固定于4%多聚甲醛中待測,另一半胃組織固定于電鏡固定液中4 h,使用0.1 mol/L的緩沖液漂洗3次,在1%的鋨酸中固定2 h,再次漂洗,依次使用50%、70%、80%、90%、95%、100%乙醇和100%丙酮上脫水;包埋機(jī)包埋,置入37 ℃烤箱過夜,切80 nm超薄片;切片使用鈾鉛雙染色(2%醋酸鈾飽和乙醇溶液和枸櫞酸鉛分別染色15 min),室溫下干燥過夜,次日使用透射電子顯微鏡觀察切片并采集圖像。

1.2.4 HE染色觀察胃黏膜病理學(xué)變化:將1.2.3固定于多聚甲醛的胃組織石蠟包埋,制作5 μm薄片,脫蠟,蘇木精染色切片15 min,鹽酸乙醇分化10 s,浸入弱堿性溶液中返藍(lán),再置于85%乙醇溶液中,伊紅染色5 min,梯度脫水,封片,顯微鏡下觀察病理學(xué)特征。

1.2.5 ELISA法檢測胃組織炎性因子、氧化應(yīng)激因子水平:取1.2.2中胃組織勻漿液,10 000 r/min離心20 min后,取上清,使用ELISA試劑盒檢測上清中炎性因子IL-6、TNF-α、IL-10以及氧化應(yīng)激因子iNOS、SOD的水平。

1.2.6 Western blot檢測胃組織蛋白表達(dá):取1.2.2中胃組織勻漿液,使用Western blot法檢測其蛋白表達(dá)水平。再次勻漿樣品,蛋白定量并等量點(diǎn)樣在凝膠中,經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜將樣品條帶在PVDF膜上按分子量大小分開,將PVDF膜分別孵育在p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、p-NF-κB p65、NF-κB p65抗體中,再經(jīng)過二抗和ECL化學(xué)發(fā)光液反應(yīng),分析各蛋白的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠UI比較

CT組大鼠胃黏膜無損傷情況;與CT組比較,M組大鼠胃黏膜上皮水腫、充血,潰瘍嚴(yán)重,UI升高(P<0.05);與M組比較,PA L組、PA H組大鼠潰瘍部位減少,水腫改善,UI呈劑量依賴性降低(P<0.05);與PA H組比較,PA H+740 Y-P組大鼠潰瘍情況嚴(yán)重,上皮充血,UI升高(P<0.05)(表1)。

表1 各組大鼠胃黏膜損傷指數(shù)(UI)比較

2.2 各組大鼠胃黏膜形態(tài)學(xué)比較

CT組大鼠胃黏膜上皮細(xì)胞排列整齊,細(xì)胞膜完整,細(xì)胞器結(jié)構(gòu)正常;M組大鼠胃黏膜上皮細(xì)胞固縮,細(xì)胞膜出現(xiàn)破裂,細(xì)胞器腫脹、游離、空泡變;與M組比較,PA L組、PA H組胃黏膜上皮細(xì)胞膜較完整,細(xì)胞器腫脹程度改善、結(jié)構(gòu)較正常;與PA H組比較,PA H+740 Y-P組胃黏膜上皮細(xì)胞損傷較嚴(yán)重,細(xì)胞膜破裂(圖1)。

圖1 透射電鏡觀察胃黏膜形態(tài)學(xué)Fig 1 Morphology of gastric mucosa observed by transmission electron microscopy

2.3 各組大鼠胃黏膜病理形態(tài)學(xué)特征比較

CT組大鼠胃黏膜皺壁正常,未見充血和黏膜糜爛;M組大鼠胃黏膜變薄,黏膜糜爛,部分腺體輕微擴(kuò)張,可見炎性細(xì)胞浸潤;與M組比較,PA L組、PA H組胃黏膜皺壁趨于正常、糜爛改善、少許充血,少量炎性細(xì)胞浸潤;與PA H組比較,PA H+740 Y-P組胃黏膜糜爛加重,炎性細(xì)胞浸潤增加(圖2)。

圖2 HE染色檢測胃黏膜病理形態(tài)學(xué)特征Fig 2 Pathologic characteristics of gastric mucosa detected by HE staining

2.4 各組大鼠胃組織IL-6、TNF-α、IL-10水平比較

與CT組比較,M組IL-6、TNF-α水平升高,IL-10水平下降(P<0.05);與M組比較,PA L組、PA H組IL-6、TNF-α水平下降,IL-10水平升高,且呈劑量依賴性(P<0.05);與PA H組比較,PA H+740 Y-P組IL-6、TNF-α水平升高,IL-10水平下降(P<0.05)(表2)。

表2 各組大鼠胃組織IL-6、TNF-α、IL-10水平比較Table 2 Comparison of IL-6, TNF-α and IL-10 levels in gastric tissue of rats in each pg/mL, n=6)

2.5 各組大鼠胃組織iNOS、SOD水平比較

與CT組比較,M組iNOS水平升高,SOD水平下降(P<0.05);與M組比較,PA L組、PA H組iNOS水平下降、SOD升高,且呈劑量依賴性(P<0.05);與PA H組比較,PA H+740 Y-P組iNOS水平升高、SOD水平下降(P<0.05)(表3)。

表3 各組大鼠胃組織iNOS、SOD水平比較

2.6 各組大鼠胃組織蛋白表達(dá)水平比較

與CT組比較,M組p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05);與M組比較,PA L組、PA H組p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表達(dá)水平呈劑量依賴性下降(P<0.05);與PA H組比較,PA H+740 Y-P組p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)(圖3)。

*P<0.05 compared with CT group; #P<0.05 compared with M group; △P<0.05 compared with PA L group; &P<0.05 compared with PA H group.

3 討論

Hp擁有多種毒力基因,使細(xì)菌能夠適應(yīng)胃部的酸性環(huán)境,并附著在胃上皮細(xì)胞上,引起慢性炎性和組織損傷[11]。研究發(fā)現(xiàn),患者感染Hp后IL-6和TNF-α水平升高,促炎因子IL-6可以誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子的產(chǎn)生,而TNF-α具有促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移以及腫瘤血管生成的潛力,因此Hp引起的胃炎也是胃癌發(fā)生的第一步[12]。Hp利用IL-10的免疫抑制作用來幫助其逃離宿主的免疫系統(tǒng),進(jìn)而誘導(dǎo)胃部慢性炎性反應(yīng)[13]。本研究采用Hp菌液灌胃法建立Hp相關(guān)性胃炎大鼠模型,發(fā)現(xiàn)Hp相關(guān)性胃炎大鼠胃黏膜糜爛,上皮水腫、充血、潰瘍和炎性細(xì)胞浸潤嚴(yán)重,且胃組織中IL-6、TNF-α水平升高,IL-10水平下降,表明Hp持續(xù)感染促進(jìn)促炎細(xì)胞因子的分泌,誘發(fā)組織損傷;PA有效改善模型大鼠胃黏膜糜爛,上皮水腫、潰瘍及炎性細(xì)胞浸潤情況,下調(diào)IL-6、TNF-α水平,上調(diào)IL-10水平,減輕胃黏膜損傷。此外,細(xì)菌分泌的毒力因子激活氧化應(yīng)激也會介導(dǎo)宿主細(xì)胞的慢性炎性反應(yīng)[14]。iNOS是機(jī)體活性氮自由基產(chǎn)生的催化酶,iNOS一旦被激活會持續(xù)較長時(shí)間并產(chǎn)生大量NO,刺激氧化應(yīng)激并引起胃損傷;SOD保護(hù)機(jī)體免受自由基的損害,SOD水平的降低可能引發(fā)鏈狀脂質(zhì)過氧化,加劇胃黏膜細(xì)胞損傷[15]。在本研究中,模型大鼠胃組織iNOS水平升高、SOD水平下降,說明大量的NO和自由基可能加速胃炎的進(jìn)展,這種變化可以被PA緩解,提示PA可改善Hp相關(guān)性胃炎大鼠胃組織中氧化-抗氧化之間的不平衡。

PI3K介導(dǎo)細(xì)胞炎性反應(yīng)調(diào)節(jié)過程,PI3K的激活會促使AKT活化,進(jìn)而激活NF-κB,誘導(dǎo)多種炎性相關(guān)基因的表達(dá)[16]。抑制PI3K/AKT/NF-κB通路的活化可減少氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng),對胃潰瘍發(fā)揮保護(hù)作用[17]。本研究發(fā)現(xiàn),胃炎大鼠胃組織p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白水平升高,PA能抑制胃炎大鼠PI3K/AKT/NF-κB信號的激活,且PI3K激活劑740 Y-P可減弱PA對胃炎大鼠的胃黏膜損傷的改善作用,提示PA可能通過抑制PI3K/AKT/NF-κB通路,減輕Hp相關(guān)性胃炎大鼠胃黏膜損傷。

綜上所述,PA可能通過抑制PI3K/AKT/NF-κB通路發(fā)揮對Hp相關(guān)性胃炎大鼠的治療作用。然而,Hp相關(guān)性胃炎的病因十分復(fù)雜,PA的作用機(jī)制還需更加廣泛、深入的探究。