肝硬化病人血清lncRNA TUG1表達水平與肝功能、肝纖維化程度的相關性研究

李軼 尚立

肝硬化是肝臟慢性纖維化的終末期[1],肝纖維化是肝硬化進展的主要過程和必經階段[2]。早期識別和治療肝纖維化,有利于改善肝硬化疾病預后。有研究表明,長鏈非編碼RNA牛磺酸上調基因1(long non-coding ribonucleic acid taurine up-regulated gene 1,lncRNA TUG1)可通過促纖維化相關基因的表達,加速肝纖維化的進展[3]。lncRNA TUG1在脂多糖誘導的肝細胞炎癥中表達上調[4]。lncRNA TUG1可加速肝纖維化進展,而肝纖維化是肝硬化進展的必經階段。因此推測,lncRNA TUG1可能通過促進肝纖維化參與肝硬化疾病進展。本研究探討肝硬化病人血清lncRNA TUG1表達水平與肝纖維化和肝硬化的關系,以期為逆轉或消退肝纖維化、治療肝硬化提供相關線索。

對象與方法

一、對象

2020年2月～2022年6月本院收治的Child-Pugh分級C級的肝硬化病人92例,為肝硬化組,均為乙型肝炎肝硬化,男38例,女54例,年齡中位數為50歲。根據國內S2000標準對病人進行肝纖維化分級:S0～S4級,其中S0、S1、S2級歸為輕中度纖維化(輕中度組,61例),S3、S4級歸為重度纖維化(重度組,31例)。同期88例本院健康體檢者為對照組,男33例,女55例,年齡中位數為50歲。納入標準:(1)均經臨床癥狀、血液學、腹部超聲檢查確診,診斷符合中華醫學會肝病學分會制訂的診治指南[5];(2)一般資料完整;(3)自愿參與本研究且簽署同意書;(4)非酒精、藥物等不良生活習慣引起的肝炎、肝硬化。排除標準:近6個月內接受過激素、干擾素等治療;有肝外膽道梗阻性疾病;全身性炎癥疾病、其他肝病或病毒感染;有精神疾患。

二、方法

1.血清lncRNA TUG1測定:采集對照組體檢當天及肝硬化病人入組第二天(治療前)清晨空腹靜脈血,每分鐘3 000轉離心15分鐘,分離血清,置于-80 ℃條件保存待測。依照RNA提取試劑盒說明提取血清總RNA,紫外分光光度計測定濃度和純度,260 nm、280 nm波長處吸光度值處于1.8～2.1之間鑒定為合格,依照反轉錄試劑盒將提取的RNA反轉錄為cDNA。采用熒光定量PCR(qRT-PCR)法對lncRNA TUG1及其內參GAPDH進行擴增,序列見表1。qRT-PCR反應體系:cDNA模板(50 ng/μl)1 μl,上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μl,SYBR Green qPCR Mix(2×)(美國EZBioscience公司)5 μl,ddH2O加之10 μl。反應條件:95 ℃預變性1分鐘;95 ℃變性30秒,58 ℃退火30秒,72 ℃延伸30秒,45個循環后終止。為減小誤差,每個樣品重復3次,反應終止后采用2-ΔΔCT法計算lncRNA TUG1相對表達量。

表1 qRT-PCR引物序列

2.肝功能指標、肝纖維化指標檢測:采用全自動生化分析儀測定血清丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、總膽紅素(TBIL)水平,采用酶聯免疫吸附(ELISA)法測定肝纖維化指標層黏連蛋白(LN)、Ⅲ型前膠原肽(PⅢP)、Ⅳ型膠原(CⅣ)水平,采用全自動熒光定量PCR儀檢測血清乙型肝炎病毒DNA(HBV DNA)水平。

3.治療方法:肝硬化病人入組后均口服恩替卡韋分散片,每次0.5 mg,每天1次。

三、統計學方法

結果

1.對照組、肝硬化組血清lncRNA TUG1、肝功能指標、肝纖維化指標水平比較:肝硬化組血清lncRNA TUG1、ALT、AST、TBIL、LN、PⅢP、CⅣ水平均高于對照組,差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 兩組血清lncRNA TUG1、肝功能指標、肝纖維化指標水平比較

2.肝硬化病人不同肝纖維化程度組一般資料及lncRNA TUG1、肝功能指標、肝纖維化指標比較:重度組肝硬化病程、HBV DNA、lncRNA TUG1、ALT、AST、TBIL、LN、PⅢP、CⅣ均顯著高于輕中度組,差異有統計學意義(P<0.05)。兩組性別、BMI、乙肝家族史比較,差異均無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 肝硬化病人不同肝纖維化程度組一般資料及lncRNA TUG1、肝功能指標、肝纖維化指標比較

3.肝硬化病人血清lncRNA TUG1與肝功能指標、肝纖維化指標的相關性:Pearson相關分析結果顯示,肝硬化病人血清lncRNA TUG1與HBV DNA、ALT、AST、TBIL、LN、PⅢP、CⅣ均呈正相關(P<0.05)。見表4。

表4 肝硬化病人血清lncRNA TUG1與肝功能指標、肝纖維化指標的相關性

4.血清lncRNA TUG1水平對肝硬化病人肝纖維化程度的評估效能:以血清lncRNA TUG1水平為檢驗變量,以肝硬化病人肝纖維化程度是否發展為重度為狀態變量繪制ROC曲線,結果顯示,lncRNA TUG1評估肝硬化病人肝纖維化程度發展為重度的曲線下面積(area under curve,AUC)為0.91(95%CI:0.84～0.99),截斷點為2.61,特異性為90.2%,敏感度為83.9%,見圖1。

圖1 血清lncRNA TUG1水平預測肝硬化患者肝纖維化程度加重風險的ROC曲線

5.影響肝硬化病人肝纖維化程度的多因素Logistic回歸分析:將肝硬化病人肝纖維化程度是否發展為重度作為因變量,以lncRNA TUG1、肝硬化病程、ALT、AST、TBIL、LN、PⅢP、CⅣ為自變量進行多因素Logistic回歸分析,結果顯示,lncRNA TUG1、LN為肝硬化病人肝纖維化程度發展為重度獨立影響因素(P=0.001、0.004)。見表5。其中,自變量lncRNA TUG1、肝硬化病程、ALT、AST、TBIL、LN、PIIIP、CIV均為連續變量,采用實際值;肝纖維化程度為分類變量,賦值情況:重度=1,輕中度=0。

表5 影響肝硬化病人肝纖維化程度的多因素Logistic回歸分析

討論

肝硬化可由肥胖、非酒精性脂肪肝、高飲酒量、乙型或丙型肝炎感染、自身免疫性疾病等引起,是肝臟疾病病人死亡率增加的主要原因[6-8]。肝硬化是在長期炎癥后發展起來的,炎癥導致健康肝實質被纖維化組織和再生結節替代,從而導致門靜脈高壓,該疾病從無癥狀期(代償性肝硬化)演變為癥狀期(失代償性肝硬化),其并發癥往往導致病人生活質量受損和高死亡率[9-10]。

研究顯示,肝臟中纖維化逆轉至正常結構的程度高于其他組織,其解決纖維化的基礎包括:中斷或清除導致慢性肝損傷的有害物質,炎癥反應的失活和抗炎/恢復性途徑的誘導,細胞外基質降解[11-13]。本研究結果顯示,lncRNA TUG1在肝硬化病人血清中表達水平相對升高,且表達隨肝纖維化程度增加而升高,與Han等[3]研究結果一致。lncRNA TUG1是一種與肝臟病理性損傷密切相關的lncRNA,其表達下調可顯著抑制轉化生長因子-β1/smad信號通路激活,進而逆轉肝星狀細胞活化,發揮抗肝纖維化作用[14]。據此推測,本研究中lncRNA TUG1表達升高可能有利于激活肝星狀細胞,推動肝纖維化病理進程。Li等[15]研究顯示,TUG1的沉默顯著抑制增生性瘢痕纖維化中的細胞外基質生物合成,推測lncRNA TUG1也可能與肝纖維化過程中的細胞外基質合成有關,其表達上調可能有利于細胞外基質生物合成,進而促進肝纖維化進展。

研究表明,肝功能指標及肝纖維化指標均與肝硬化病人病情進展有密切聯系,肝硬化存在以及病人病情加重可造成上述指標異常增高[5,16]。Pearson相關分析發現,血清lncRNA TUG1與肝功能指標、肝纖維化指標及HBV DNA均呈顯著正相關,證實血清lncRNA TUG1水平可一定程度反映肝硬化病人肝功能損傷和肝纖維化程度。ROC曲線分析結果提示,lncRNA TUG1水平可評估肝硬化病人肝纖維化程度,當其檢測水平高于截斷值2.61時,病人肝纖維化可能進展為重度。

綜上所述,肝硬化病人血清lncRNA TUG1、肝功能指標及肝纖維化指標水平均明顯升高,lncRNA TUG1與病人肝功能、肝纖維化程度密切相關,其水平隨肝纖維化程度增加而升高。臨床中尋找有效拮抗lncRNA TUG1途徑的相關物質,可能有助于逆轉或消退肝硬化病人肝纖維化。本研究未納入丙肝肝硬化病人進行對比分析,且未能對治療后病人血清lncRNA TUG1表達水平變化進行動態檢測,今后將增加樣本量進行對比分析。