塑料包裝材料表面大腸桿菌滋生影響因素研究

熊子怡，王小梅，潘嘹,2*，盧立新,2，唐亞麗,2，王軍,2

塑料包裝材料表面大腸桿菌滋生影響因素研究

熊子怡1，王小梅1，潘嘹1,2*，盧立新1,2，唐亞麗1,2，王軍1,2

（1.江南大學，江蘇 無錫 214122；2.江蘇省食品先進制造裝備技術重點實驗室，江蘇 無錫 214122）

選擇大腸桿菌為典型致病菌，分析不同塑料包裝材料（聚乙烯、聚丙烯、聚酰胺、聚對苯二甲酸乙二酯）、營養狀況與溫濕度下包裝表面大腸桿菌的滋生情況。通過正交試驗法分析各因素對大腸桿菌在包裝表面滋生的影響規律。著重研究不同塑料材料表面大腸桿菌生物膜附著的影響因素，通過相關性分析確定模型輸入參數；并基于這些參數采用反向傳播神經網絡（BP神經網絡）建立不同塑料材料表面大腸桿菌菌落數的預測模型。溫度對大腸桿菌在材料表面的生長影響最大，其次為營養狀況，材料和相對濕度的影響相對較小。塑料材料的水接觸角、表面能、粗糙度和營養肉湯接觸角是影響材料表面大腸桿菌生物膜附著的主要因素，基于這些因素建立的塑料材料表面大腸桿菌菌落數的神經網絡預測模型的2超過0.95，具有極高的預測精度。該研究提出了塑料包裝材料表面大腸桿菌滋生的關鍵環境控制因素，并為食品包裝材料的選擇提供了參考，從而為提升食品安全提供理論依據。

大腸桿菌；塑料包裝材料；正交試驗；BP神經網絡；生物膜

全球范圍內食源性致病菌導致的食品安全問題逐年加劇，嚴重影響人們的生活品質，甚至威脅生命安全[1-2]。在運輸和銷售過程中，由于各種因素而導致的食品包裝薄膜損壞、內部液體發生滲漏等情況，都會在包裝材料表面滋生微生物，進而使接觸包裝的人陷入感染風險中[3]。尤其是2019年底開始的新冠肺炎疫情中，多家冷鏈食品運輸的外包裝上均檢測并分離出了新冠病毒，使得包裝表面致病微生物滋生的問題引起了人們的重視。

目前市場上用于生產和銷售環節的塑料包裝材料主要有：聚對苯二甲酸乙二醇酯（Polyethylene Terephthalate，PET）、聚酰胺（Polyamide，PA）、聚乙烯（Polyethylene，PE）、聚丙烯（Polypropylene，PP）、聚偏二氯乙烯（Polyvinylidene Chloride，PVDC）等材料。前4種塑料材料被廣泛應用于食品內外包裝，作為本課題的主要研究因素之一，選取PET、PA、PE、PP 4種材料作為典型的表征來進行試驗探究。

微生物在包裝材料表面繁殖的過程中會形成一層生物被膜，使得微生物能夠附著于材料表面[4]。現有研究主要關注外部環境因素（如溫度[5]、相對濕度[6]和pH值[7]）、載體表面不同特征[8-9]以及微生物自身[10]，對材料表面生物被膜形成的影響。申鍇等[7]發現中性的pH值會更加有利于生物被膜的構筑以及穩定。Ganesan等[9]發現材料疏水性降低導致塑料表面生物被膜含量增加；還可以通過降低塑料和大腸桿菌表面之間的排斥力來控制細菌附著。Zhang等[10]發現有鞭毛的大腸桿菌在所有不同塑料上都表現出比沒有鞭毛的菌株有更好的初始附著性能，鞭毛幫助細菌游動，克服了細菌和塑料之間的能量屏障，隨后附著在塑料上。

然而，常用塑料包裝材料表面微生物滋生的綜合影響研究仍存在不足，同時，還需要更深入地探究材料表面特征對細菌附著和生物膜形成的影響。本文以在市面上常見的食品包裝薄膜為主要材料，探究溫度、相對濕度、包裝材料和營養狀況對塑料包裝材料表面大腸桿菌生長情況的影響，為改進產品的運輸儲存條件提供研究支持。重點探究了材料性狀指標與包裝表面大腸桿菌菌落數之間的關聯，通過相關性分析確定模型參數指標，隨后采用BP神經網絡模型分析建立一個可以預測72 h時包裝表面滋生大腸桿菌的濃度模型，為食品包裝薄膜材料的選擇提供科學論據。

1 試驗

1.1 試驗材料

主要材料：大腸桿菌（Escherichia coli ATCC 25922，），來自北京保藏生物科技有限公司；營養肉湯和平板計數瓊脂，來自國藥集團化學試劑有限公司。試驗中所用溶液全部121 ℃滅菌20 min后使用。塑料薄膜PE、PP、PA、PET，來自江西義楊包裝有限公司，厚度為0.05 mm。

相對濕度控制根據標準飽和鹽溶液相對濕度標準[11]來選擇試驗所需的鹽，如表1所示。

表1 相對濕度標準鹽溶液控制

Tab.1 Relative humidity control for standard salt solution

1.2 主要儀器及設備

1.2.1 自制培養裝置

試驗用自制培養裝置為樂扣盒、亞克力板等組成的一個恒濕系統，用于培養大腸桿菌生物膜。如圖1所示，將亞克力架平坦存放于樂扣盒內，在盒子內部底層倒入標準鹽溶液或藍色硅膠來控制試驗所需的相對濕度，然后將培養皿置于亞克力架上，再用樂扣盒蓋密封培養。試驗中組裝操作全程處于垂直層流式潔凈工作臺中進行，以確保試驗操作環境的無菌性。

圖1 自制培養裝置

1.2.2 其他儀器與設備

其他儀器與設備：MLS-3781L-PC高溫高壓滅菌鍋，日本三洋生物有限公司；HCB-1300V垂直層流潔凈工作臺，青島海爾特種電器有限公司；AQUA-ARC超純水機，上海純浦實業有限公司；ZQLY-300YG振蕩培養箱，上海知楚儀器有限公司；RQH-350人工氣候箱，上海右一儀器有限公司；TE-2K電暈處理機，無錫康特電子設備有限公司；POWEREACH接觸角測量儀，上海中宸數字技術設備有限公司；mfp-d 3D表面形貌儀，美國Rtec公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種接種

挑取少量大腸桿菌接種于50 mL營養肉湯中，保持37 ℃和150 r/min的條件培養16 h，制備大腸桿菌原液，數量約為8 lg(CFU/mL)。梯度稀釋[12]大腸桿菌原液6次。用無菌吸管吸取3 mL稀釋后的大腸桿菌菌液注入20 mL不同濃度配比的營養液（改變營養肉湯和生理鹽水的比例），迅速將營養液與菌液混合均勻。之后快速各取3 mL混合液分別注入35 mm培養皿中作為平行樣，同時取3 mL生理鹽水放在一個培養皿中作為對照樣。

使用鑷子將提前裁制好的2 cm×2 cm材料樣品覆蓋在培養皿的混合菌液的液面上；將培養皿放入提前備好的自制培養裝置中；迅速放進不同試驗溫度下的人工氣候箱進行恒溫控制培養72 h。注意：樣品與液面中間切勿產生氣泡，鑷子使用完畢后放在酒精燈上來回高溫殺菌后，置冷備用。

1.3.2 大腸桿菌計數方法

從不同試驗溫度的人工氣候箱中將培養完成后的自制培養裝置取出，用酒精消毒外表面后立刻放入垂直層流潔凈工作臺，迅速用鑷子取出覆蓋在混合液上的塑料薄膜，取3 mL生理鹽水輕輕沖掉塑料膜表面浮菌。將除掉表面浮菌的塑料薄膜放入盛有5 mL生理鹽水的試管蓋中，用細胞刮刀輕輕摩擦材料表面多次，使得薄膜表面的生物膜脫落進入溶液中。吸取5 mL的生理鹽水徹底沖洗細胞刮刀和鑷子，將殘留菌液沖入試管。將細胞刮刀處理好的塑料薄膜及菌液密封完好，放入超聲波震蕩儀中使之更加徹底脫落于菌液當中[13]，由此制成1∶10的大腸桿菌菌液，培養24 h后記錄菌落數量[12]，單位為lg(CFU·mL?1·cm?2)。

1.3.3 塑料薄膜表面性質測定

對50 cm×50 cm的塑料材料（PE、PP、PA、PET）進行裁剪，隨后在電暈處理機（輸出功率為50 W）上分別進行電暈操作，取樣。試驗設計包括對電暈層數進行0次、2次和4次的設定，共計12組試驗，并對樣品表面性質指標進行測定。使用接觸角測量儀檢測滅菌后的超純水以及營養肉湯2種溶液在塑料薄膜表面的接觸角數據，分析其潤濕性。測量2種不同液體的接觸角（超純水和二碘甲烷），采用Owen-Wendt-Kaelble公式[14]計算得出塑料薄膜的表面能。使用3D表面形貌儀檢測材料的表面粗糙度、粗糙度偏差。

1.4 數據處理

1.4.1 正交試驗方法

根據現實情況設計實現了4因素3水平L9（34）正交試驗，試驗指標為72 h時塑料包裝材料表面的大腸桿菌菌落數，分析采取直觀的極差分析法，正交試驗因素如表2所示。

表2 L9（34）正交試驗因素水平

Tab.2 L9(34) orthogonal experimental factor level

1.4.2 其他數據處理

所用數據進行3次以上獨立試驗，每次試驗取5次平行樣品的數據。利用Origin軟件進行插圖的繪制。利用MATLAB軟件進行相關性分析和反向傳播神經網絡（Backpropagation Neural Network，后簡稱BP神經網絡），以建立材料性質指標與包裝表面形成大腸桿菌生物膜的菌落數之間的關系。

2 結果與分析

2.1 塑料包裝材料表面大腸桿菌滋生影響因素的影響性對比

根據表2設置的正交試驗條件進行試驗，可以得到共9組試驗結果。圖2展示了正交試驗4個因素的均值分布圖，在溫度、相對濕度、營養狀況、材料4項因素中，溫度的極差值最大，根據極差值的大小對多種因子的影響性進行從大到小排序為溫度、營養狀況、材料、相對濕度。

在4個因素的共同作用下，溫度、營養狀況和材料3個因素的均值根據水平呈現遞增或遞減的現象，僅相對濕度在第二水平內有拐點。通過影響性排序，發現相對濕度對結果的影響最小，其他因素的影響則顯著得多，從而導致了相對濕度在這種情況下的特殊表現。

圖2 正交試驗均值分布

2.2 溫度對塑料包裝材料表面大腸桿菌滋生的影響規律

在相對濕度為85%、營養肉湯濃度為50%和PA為塑料材料的條件下，不同溫度對大腸桿菌濃度的影響結果見圖3a。在試驗考察的溫度范圍內，大腸桿菌的濃度隨著溫度的升高呈現總體上升的趨勢。到目前為止，多個研究已經表明隨著溫度的升高，大腸桿菌的繁殖與生長為正相關[5]。在溫度較高的條件下，不但菌種混合液里面的大腸桿菌增長，而且能夠促進組織架構結合的表面蛋白[15]以及產生EPS以用于黏附[16]，最終在材料表面附著的大腸桿菌數量會較多。而在溫度5 ℃條件下，大腸桿菌的菌落數為0。這是因為溫度較低（5 ℃），導致大腸桿菌產生用于吸附的蛋白較少，其表達受到抑制，從而降低了在塑料薄膜上形成生物膜的能力。此外，由于研究時間限制為72 h，溫度較低（5 ℃）也會抑制大腸桿菌的生長和繁殖，使其無法達到形成成熟生物膜所需的時間。因此，無法在此溫度下形成生物膜。

圖3 不同因素對大腸桿菌濃度的影響

2.3 營養狀況對塑料包裝材料表面大腸桿菌滋生的影響規律

在溫度為15 ℃、相對濕度為45%和PET為塑料材料的條件下，不同營養狀況對大腸桿菌濃度的影響結果見圖3b。結果表明營養肉湯濃度突破0之后，大腸桿菌數量從0迅速上升。隨著營養肉湯濃度的增加，大腸桿菌的數量也在增加。

營養肉湯中含有豐富的碳源、氮源和無機鹽等物質，是大腸桿菌生長繁殖所需的能源物質[17]。在溫濕度和初始大腸桿菌量都相等的情況下，當營養物質越多時大腸桿菌所能夠吸收和利用的能源增多，有益于自身繁殖，導致最終附著在薄膜表面的大腸桿菌數量增加。

2.4 材料對塑料包裝材料表面大腸桿菌生物膜附著的影響

2.4.1 包裝表面大腸桿菌濃度與材料表面性質間的試驗結果分析

在環境條件為溫度15 ℃、相對濕度45%、營養狀況50%下，通過電暈操作對材料表面進行改性后，檢測各類指標數據如圖4所示。將不同材料表面性質指標及塑料表面大腸桿菌菌落數進行相關性分析，結果如圖5所示。包裝表面大腸桿菌生物膜菌落數與材料自身性質均存在一定的相關性[18-19]，性狀的變化可能促使濃度指標發生同方向或反方向的變化。

圖5結果顯示，水接觸角、營養肉湯接觸角與包裝表面大腸桿菌的濃度呈極顯著的負相關（<0.000 1），說明表面親疏性是表面材料細菌黏附的重要因素[18]。在流體系統中表面粗糙度和不規則聚合物材料的剪切力降低，進而會增加細菌黏附[19]，熱圖中包裝表面大腸桿菌的濃度與粗糙度、粗糙度偏差的顯著相關關系（<0.05）可以在一定程度上說明這一觀點。所檢測的表面能與包裝表面大腸桿菌的濃度呈極顯著的正相關（<0.01）。由于粗糙度與粗糙度偏差之間相關度超過0.95，因此在后續數據分析中將水接觸角、表面能、粗糙度和營養肉湯接觸角作為模型輸入參數。

圖4 材料影響試驗結果

圖5 相關性熱圖

2.4.2 包裝表面大腸桿菌濃度與材料表面性質間的BP神經網絡模型分析

將水接觸角、表面能、粗糙度和營養肉湯接觸角對72 h時包裝表面大腸桿菌生物膜菌落數進行BP神經網絡模型分析，預測結果的相關統計量見表3。訓練集和測試集的均方根誤差分別為1.561 6和1.577 8，擬合優度分別為0.978 78和0.957 74。可以看出，BP神經網絡可以極佳地預測72 h包裝表面大腸桿菌濃度。

表3 BP神經網絡模型統計量指標

Tab.3 Statistics index of BP neural network model

2.5 相對濕度對塑料包裝材料表面大腸桿菌滋生的影響規律

圖6為不同相對濕度條件下材料表面大腸桿菌濃度變化（溫度為15 ℃、營養狀況為50%、塑料材料為PET）。

圖6 相對濕度變化對大腸桿菌濃度的影響

隨著相對濕度的增加，大腸桿菌的濃度同樣趨勢呈上升狀態。由于使用藍色硅膠保持自制培養裝置內相對濕度接近0%，導致營養肉湯中的水分會部分流失，大腸桿菌會處于水分活度越來越大的營養肉湯環境當中。當低于大腸桿菌適宜生長的水分活度時，滲透壓增高，大腸桿菌的生長由此受到抑制[6]，甚至在水分活度過低的情況下還會導致脫水，引起質壁分離或死亡[20]。當相對濕度逐漸升高時，水分活度增高，滲透壓降低，有利于大腸桿菌的生長，因此呈現大腸桿菌在塑料包裝材料表面的數量隨著相對濕度的增大而增大的情況。

3 結語

以包裝表面大腸桿菌生物膜菌落數為評價指標，結合材料的5項性質指標進行相關性分析，證明了通過材料性質指標預測包裝表面大腸桿菌濃度具有可行性。隨后，采用了BP神經網絡模型進行預測。驗證結果顯示，BP神經網絡模型能夠保持較高的預測精度和良好的穩定性。因此，本研究成功地實現了對72 h包裝表面大腸桿菌濃度的準確預測，為后續通過材料性質指標對包裝表面大腸桿菌滋生情況的預測提供了基礎支持。

影響大腸桿菌在材料表面生長狀況的主要因素為溫度，按照影響性從大到小排序為溫度、營養狀況、材料、相對濕度。建議在食品的運輸與儲藏過程中，為了有效控制微生物的增殖，應將整個過程的包裝食品溫度控制在5 ℃及以下；在生產環節務必嚴格注意衛生，確保產品無殘留物；在運輸過程中，無論是機械還是人工搬運，都需要保持穩定性，以避免對包裝薄膜造成破損，進而導致內部液體泄漏，從而造成污染。

研究揭示了不同影響因素對食品包裝薄膜表面微生物滋生的規律，這些發現對食品的塑料包裝材料選擇和產品的運輸儲存環境提供了有益的參考。同時，提出了包裝表面大腸桿菌滋生的關鍵環境控制因素，這為進一步提升食品安全提供了理論支持，并為未來的研究和實踐提供了指導。

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Factors Affecting the Growth of Escherichia Coli on Plastic Packaging Surface

XIONG Ziyi1, WANG Xiaomei1, PAN Liao1,2*, LU Lixin1,2, TANG Yali1,2, WANG Jun1,2

(1. Jiangnan University, Jiangsu Wuxi 214122, China; 2. Key Laboratory of Advanced Food Manufacturing Equipment and Technology of Jiangsu Province, Jiangsu Wuxi 214122, China)

The work aims to select Escherichia coli () as the typical pathogen to study the effect of different plastic packaging materials (polyethylene, polypropylene, polyamide, polyethylene terephthalate), nutritional status and temperature and humidity on the growth ofon the plastic packaging surface. The effects of various factors on the growth ofon the packaging surface were analyzed by orthogonal experimental method. Focusing on the factors affecting the attachment ofbiofilm on the surface of different plastic materials, the model input parameters were determined by correlation analysis. Based on these factors, a prediction model for the number ofcolonies on the surface of different plastic materials was established with back propagation neural network (BP neural network). The temperature had the greatest effect on the growth ofon the material, followed by the nutritional status, and the material and relative humidity had relatively small effect. Water contact angle, surface energy, roughness and nutrient broth contact angle of plastic materials were the main factors affectingbiofilm attachment on material surfaces. The BP neural network prediction model for the number ofcolonies on the surface of plastic materials based on these factors had a goodness-of-fitof more than 0.95, which had a very high prediction accuracy. This study proposes key environmental control factors for the growth ofon the surface of plastic packaging materials and provides a reference for the selection of food packaging materials, thus providing a theoretical basis for enhancing food safety.

Escherichia coli; plastic packaging material; orthogonal experiment; BP neural network; biofilm

TB487；TS206

A

1001-3563(2024)07-0031-07

10.19554/j.cnki.1001-3563.2024.07.005

2024-01-05

江蘇省食品先進制造裝備技術重點實驗室自主研究課題（FMZ202202）

通信作者